Name: isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells
Uploaded: 2014-08-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
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이 작품은 (KAH에) 건강 그랜트 R01 AI088209 국립 연구소에 의해 지원되었다. 우리는 또한 미네소타 유동 세포 계측법 자원의 대학 감사합니다.

본 연구에서는, 성인 (6 - 8 주) 암컷 C57BL / 6 쥐를 사용 하였다. 마우스는 국립 암 연구소에서 구입 한 특정 병원균이없는 상태에서 유지되었다. 미네소타 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학 (IACUC)는 모든 동물 실험을 승인했다. 인스 트루먼 트와 버퍼의 1 준비 <ol><li> 효소 용액을 준비 알부민 풍부한 완충액 (PBS 1X [칼슘 / 마그네슘 2 + 불 함유]와 0.5 % 소 혈청 (0.05 %와 RPMI1640 배지를 Liberase TH의 DNase I 및 100 U / ㎖ [/ w V]) 알부민 및 2 mM의 에틸렌 디아민 테트라 산 [EDTA]), FACS 완충액 (1X PBS [칼슘 / 마그네슘 2 + 불 함유 함유하는 1 % 태아 소 혈청 [FBS] 및 0.02 % NaN3가), 버퍼 정렬 FACS (1X PBS [칼슘 / 마그네슘이 2 + 불 함유] 2 % FBS), RP10 및 배지를 함유하는 (RPMI-1640 배지)는 10 % FBS와 함께 공급된다. </li><li> 10 패닝 접시를 준비합니다. (0.01 ㎎ / ㎖ G 40 ml의 코팅 용액을 준비귀리는 0.1 M 탄산 수소 나트륨 완충액 안티 쥐의 IgG), 각 100 × 15mm 플레이트, 소용돌이로 코팅 용액 4 mL를 넣고 4 ° CO / N 부화. 항체 용액을 붓고 두 번 1X PBS 5 ㎖를 사용하여 판을 세척, 헹굼 사이에 격렬하게 소용돌이 친다. 4 ° C에서 제조 된 판을 보관하십시오. </li></ol> 흉선 조직의 2 수확 <ol><li> CO 2 챔버에 마우스를 안락사. , 해부 매트에 그 뒷면에있는 동물을 넣어 매트에 발을 핀 및 70 % 에탄올로 분사하여 모피 젖은. </li><li> 똑바로 가위로 아래턱에 요도 위에서 시작하여 피부를 통해 중간 선 절개를하고 양쪽 무릎 아래쪽으로 절개를 확장 할 수 있습니다. 절개는 &quot;Y&quot;거꾸로처럼 보인다. 측면에 느슨한 피부를 뒤로 당겨 절개 매트에 핀. </li><li> , 검상 돌기에서 진동판에 구멍 쇄골에 대해 다음 갈비뼈를 들어 올려까지 양쪽의 갈비뼈를 잘라집게 해부 매트에 고정합니다. 흉선은 갈비뼈 아래에, 그리고 마음 (그림 1) 위에 놓인 두 개의 얇은 흰색 엽 (叶)처럼 보인다. 분리 결합 조직을 부드럽게 당겨 곡선 톱니 모양의 집게와 흉선 로브의 쌍을 제거, 흉선 주변. 5 ㎖의 RPMI-1640을 포함하는 6 웰 플레이트에 배치 흉선 엽. </li></ol> 흉선 기질 세포의 3 준비 <ol><li> 모든 주위 지방 및 결합 조직을 손질하고 5 ml의 갓 효소액을 제조 함유 6 웰 플레이트의 웰에 새로운 흉선 로브 옮긴다. 미세 가위로 흉선 엽 (叶)에 작은 절개를 확인하고 20 분 동안 37 ° C에서 접시를 품어. </li><li> 조직 해리 5 ml의 피펫을 사용하여 3 회 - 부드럽게 흉선 조직 상하 2를 소화 피펫. 10 ㎖의 효소를 중화 알부민 풍부한 차가운 완충액을 함유하는 50 ㎖의 튜브에 상청 분획을 수집한다. 얼음에 포집 관을 유지합니다. 2.5 추가ML 효소 나머지 조직에 솔루션을 15 분 동안 37 ° C에서 접시를 품어. </li><li> 골재 분리를 위해 3 ML의 주사기와 18 G 바늘 부드러운 기계적 교반을 수행합니다. 포집 관에 풀 상층 액. 나머지 조직에 2.5 ml의 효소 솔루션을 추가하고 15 분 동안 37 ° C에서 접시를 품어. </li><li> 3 ML의 주사기와 25 G 바늘 부드러운 기계적 교반을 반복 한 접시 추가 5 품어 - 10 분. </li><li> 완전한 소화 한 후, 포집 관에 뜨는을 풀. 원심 분리기 400 XG, 8 분 세포를 수집하기위한 4 ° C에서 포집 관. 대기음 액체 및 10 ㎖ 알부민 풍부한 버퍼에 펠렛 세포를 중단하고 100mm 메쉬를 통해 샘플을 필터링. 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. 그런 흐름 cytometic 분석 (제 4 절) 또는 TEC는 농축 (5 장)을 수행합니다. </li></ol> 유동 세포 계측법에 의해 TEC는의 4 확인 </p&gt; <ol><li> 96 웰 둥근 바닥 플레이트에서 테스트에 대한 FACS 염색 버퍼 100 μL 당 4 × 106 세포의 최종 농도로 세포를 준비하고 얼음에 플레이트를 유지한다. 세포 (10 μg FACS 버퍼 / ㎖에서 항 CD16 / CD32 항체) 20 μL의 Fc 블록 솔루션을 추가하고 얼음에 10 분 동안 세포를 배양한다. 400 XG, 3 분 동안 4 ° C에서 접시를 스핀. 싱크대 아래로 판의 얼굴을 쓸어 넘겨 우물에서 액체를 폐기하십시오. </li><li> 펠렛 세포 100 ㎕의 항체 칵테일 (항-CD45, -EpCAM, -MHC 클래스 II, 및 -Ly51 항체, 및 제조 업체에서 서로 다른 형광 색소로 표지 UEA-1 렉틴은 권장 또는 FACS 버퍼에 각 항체의 최적 농도를 시험 일시 중단 ) 및 어둠 속에서 20 분 동안 얼음 위에서 세포를 배양. 보상의 경우, 각각의 형광 색소와 1 × 10 6 세포를 염색. </li><li> 각 웰에 FACS 버퍼의 100 μl를 추가하고 400 XG, 3 분 동안 4 ° C에서 접시를 회전. 세척 단계를 반복시간 후 100 ㎕의 FACS 완충액에 세포를 재현 탁. 300 ㎕의 FACS 버퍼 가득 12 × 15mm 둥근 바닥 FACS 튜브에 세포를 전송합니다. 유동 세포 계측기에 샘플을 획득하고 FACS 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석한다. TEC 게이팅 전략은 그림 2에 나타내었다. </li></ol> 패닝에 의해 TEC는의 5 심화 <ol><li> 400 XG, 5 분 동안 4 ° C에서 (제 3에서 제조) 흉선 세포를 스핀 다운. 대기음 액체 및 15 ㎖의 50 ml의 원추형 튜브 ML 당 2 × 108 세포의 농도로 FACS 정렬 버퍼에 펠렛 세포를 일시. 세포 현탁액의 2.5 ㎍ / ml의 최종 농도 방지 CD90.2 항체 (클론 30-H12) (또는 항 CD45)을 추가하고 30 분 동안 4 ° C에서 회전 믹서에 부드럽게 세포를 배양한다. 배양 후, 5 씻어 - RP10 매체의 10 배 볼륨과 400 XG, 5 분 동안 4 ° C에서 튜브를 원심 분리기. </li><li> 대기음 액체의 펠렛 세포를 재현 탁ML 당 1 × 107의 농도로 RP10 매체. 각 코팅 팬 (단계 1.3에서 준비) 판 소용돌이에 5 ㎖의 세포 현탁액을 추가하고 실온에서 30 분 동안 배양한다. 격렬하게 소용돌이 친다; 원뿔 튜브에 상층 액을 전송합니다. 판에게 RP10 매체를 사용하여 두 번 씻어 컬렉션 튜브에 상층 액을 풀. </li><li> 400 XG, 5 분 동안 4 ° C에서 포집 관을 원심 분리기. 대기음 액체 및 5 ㎖의 RP10 배지에서 세포 펠렛을 재현 탁. 새로운 패닝 플레이트에 세포 현탁액을 추가 소용돌이 및 RT에서 30 분 동안 배양한다. 세포가 접시를 씻어 원뿔 튜브로를 풀 수집합니다. TEC는이 충실하면, 정렬 버퍼 5 ML의 FACS에서 셀을 400 XG, 5 분 동안 4 ° C에서 세포를 스핀 다운 및 일시 중지합니다. </li></ol> 셀 정렬하여 TEC는의 6 정화 <ol><li> 혈구를 사용하여 세포를 세어 FACS 정렬 버퍼에 4 × 10 7 세포의 농도에서 세포 현탁액을 준비합니다. 항체 데 추가세포 용액에 4.4 절에 cribed 30 분 동안 4 ° C에서 회전 믹서에 부드럽게 세포를 배양한다. 염색 후, 씻어 FACS 정렬 버퍼의 ML 당 10 × 106 세포의 농도로 세포를 일시. </li><li> 정렬 100 μM 노즐을 통해 TEC 부분 집합은 형광 활성 세포 정렬을 사용. 정렬 세포는 RPMI-1640 (v / v)로 FBS) 30 %에 수집됩니다. 셀 정렬은 400 XG, 5 분 동안 4 ° C에서 원심 분리기 세포를 수행하고 다운 스트림 분석을 위해 준비되면. </li></ol>

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O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+isolation+of+adult+thymic+epithelial+cell+subsets+for+multiparameter+flow+cytometry+and+gene+expression+analysis.">Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis.</a> J. Immunol. Method. 367, 85-94 (2011).</li><li>Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+enzymes+improve+isolation+and+characterization+of+the+adult+thymic+epithelium.">Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium.</a> Journal of immunological method. 385, 23-34 (2012).</li></ol>

저자는 그들이 더 경쟁 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

프로토콜에서 중요한 단계는 흉선 간질 세포 (섹션 3)의 준비와 TEC는의 농축 (4 절)입니다. 이 적극 신선한 효소 용액마다 준비하고, 조직이 가능한 한 빨리 처리하는 것이 좋다. 풀링 thymi 들어, 효소 용액의 부피를 최적화 thymi의 수에 따라 요구된다. 모든 조직 잔사 처리 후에 남아 있으면, 더 효소액 및 배양 시간의 연장을 첨가하여 세포 수율을 증가시킬 수있다. TEC는의 농축, 상층 액의 수집을 완료하고 세포의 손실을 감소 5.3 절에 설명 된 판 린스를 반복하는 동안. 1980 년, Wekerle 등. 완전 세포 내 소포 내에서 많은 가능한 림프 세포를 감싸 큰 대뇌 피질 상피 세포 아르 &quot;흉선 간호사 세포&quot;(다국적 기업) 33 - 첫번째 TEC는 유형을보고했다. 1982 년 Kyewski 카플란은 다양한 격리 응축 설명초국적 34의 수율에 영향을 itions. 최근 다카 하마와 동료들은 고립과 다국적 기업의 특성을 재 방문. 그들은 단지 멤브레인 permeabilization 후 35 CD45에 대한 우선적 인 염색 기초 그러한 세포를 확인 하였다. 또한 CTEC 여러 바운드 흉선 세포로 구성되어 자신의 준비에 &quot;깨진&quot;TNC를 설명했다. 이러한 깨진 TNC는 세포 CD45과 CTEC 마커 β5t에 양성이었고, 이들의 제조에 총 cTECs의 70 %를 차지. 우리 분리 절차 cTECs 전체의 40 % 미만을 구성하더라도 실제로, 우리는 우리의 제조 흉선 세포 현탁액의 높은 CD45는 EpCAM의 +와 + Ly51이었다 유사한 세포 집단을 관찰했다. 브로큰 TNC는 CD90 또는 CD45 중 하나와 고갈을 활용 우리와 같은 TEC 농축 프로토콜에서 제거됩니다. 따라서, 미래의 과제는이 모집단의 손실을 최소화하는 것이다. 비교기존의 여러 단계의 소화 과정 29, Liberase 소화 프로토콜은 TEC는의 상당히 높은 세포 수익률 (그림 3) 할 수 있습니다. 세포 수율이 크게 증가하지 않았더라도 다른 그룹은, 회색의 방법 30, 36을 수정하여 흉선 간질 세포 분리를위한 새로운 방법을보고있다. 최근 Chidgey와 동료들은 독립적으로 Liberase 소화를 사용하여 TEC 프로토콜을보고 그들은 또한 TEC는 37의 효과적인 방출을 획득했습니다. 그러나, 그들의 프로토콜의 제 흉선 세포 분리 단계 cTECs 대부분 이들 각각 흉선 29에서 약 1.6 x 10 4 TEC는 폐기 할 가능성이있다. 인해 작은 기질 세포의 손실을 야기 밀도 구배 농축하여, AutoMACS 기반-CD45 마이크로 비드 고갈 널리 종래 FACS 정화 TEC는 29,36,37로의 농축을 위해 사용된다. CD45-마이크로 비드 고갈 프로토콜 29을 사용하여 농축 AutoMACS 계에 비해TEC는 높은 회수율은 농축하여 얻어진 패닝. 전체적으로 여기에 제시된 프로토콜은 이전에보고 된 많은 장점을 집계. 이 프로토콜 (섹션 6)로 정제 TEC 부분 집합은 성공적으로 리얼 타임-PCR과 웨스턴 블롯 분석을 12으로, 추가 분석을 위해 사용되어왔다. 이 프로토콜은 또한 분리 및 수지상 세포와 같은 다른 흉선 기질 세포의 연구에 적합하다. 우리는 흉선 간질 세포, 특히 TEC는,의 강력한 격리는 T 세포의 발달을위한 방법 흉선 기능의 이해와 시험 관내 T 세포 구성에서 달성을 촉진 것이라고 믿는다. (예 : 이식 및 암 치료에 사용되는 것과 같은) 치료에서 회복 일반적인 문제는 면역 결핍으로 이어지는 흉선 상피 세포의 가난한 재구성이기 때문에 또한, 이러한 세포의 특성은 의료 사회에 대한 좋은 실용적인 가치가있다.

초기 T 세포 개발, 골수 조혈 줄기 세포 유래 다 분화능 전구 세포가 흉선의 피질 모집, T 계보에 대한 약속을 받아야하고 T 세포 전구체 1이된다. 매우 가변적 T 세포 수용체 1 전구 세포의 큰 풀을 형성 피질에서, T 세포 전구체 CD4 및 CD8 더블 네거티브 (DN) 흉선 세포 확장 및 미성숙 CD4 및 CD8 이중 양성 (DP) 흉선 세포로 분화. 만 DP 세포의 선택 MHC 제한 집합은 CD4 또는 CD8 하나의 긍정적 인 (SP) 흉선 세포가 흉선의 수질로 마이그레이션하고, 기능적 능력 성숙 T 세포에 긍정적 인 선택 2 불린다 이벤트를 차별화 6. 반면, 자동 반응 흉선 세포의 클론 부정적인 선택을 받아야하고 자기 공차 규제 T 세포로 변환, 또는 아직 명확하지 않은 목적을 위해 상피내 림프구로 전환, 세포 사멸을 통해 제거 3,7-10. 흉선에서, 흉선 간질 세포는 이러한 다양한 T 세포 발달의 운명 5,11,12에 대한 신호를 제공하는 고유의 미세 환경을 형성한다. 대뇌 피질의 TEC는 (cTECs) 및 수질의 TEC는 (mTECs), 수지상 세포, 대 식세포, 섬유 아세포, 혈관 내피 세포, 신경 크레스트에서 파생 된 혈관 주위 세포와 다른 중간 엽 세포 13 ~ 15 포함 - 흉선 간질 세포는 흉선 상피 세포 (TEC는)로 구성된다. 이들 중에서는 TEC는 T 세포의 발달 1,2,16,17 다양한 단계에 중요하다. 그러나, TEC는 격리 할 수있는 강력한 방법의 부족은 그 기능 (16)의 포괄적 인 이해를 방해하고있다. 특히 피질 전구 세포를 둘러싸 삼차원 네트워크를 형성 cTECs는 아직 확실하지 않은 이유로 양성 선택 13,18,19 필수적이다. 이전 연구는 대부분의 형태 학적 및 조직 학적 도구 (13)에 의존, TEC는의 이질성과 역할에 대한 단서를 제공 </sup&gt;. 최근 TEC 부분 집합의 고유 한 역할은 마우스 모델 12, 20에 유전 적 방법에 의해 해결되었다. TEC는을 분리하는 강력하고 재현 가능한 방법은 cTECs가 긍정적 인 선택을 어떻게 지원하는지 TEC 부분 집합, TEC 기능의 양적 및 질적 평가 및 메커니즘의 해명의 편견 특성을 달성하기 위해 필수적입니다. 때문에 그들은 그대로 장기에 형성 흉선에서 TEC는의 희소성과 긴밀한 상호 작용, TEC는의 분리 도전하고있다. 여기에 설명 된 프로토콜은 이전의 발견, 현재 이용 가능한 시약, 기법, 및 흉선 구조 및 기질 조성물의 지식에 기초한다. 거의 20 년 전, 몇 가지 절차는 트립신, 콜라게나 제와 디스 파제 등 다양한 효소가 소화하는 동안 사용 된에서 흉선 조직 21-27을, 해리하는 것으로보고되었다. 회색 등. 그들의 precedure 28에서와 효소를 비교하고 개선 메트 신고되었고 효소 칵테일 (29)의 여러 단계 소화 외경 (20), (30)을 널리 사용 하였다. 그러나,이 방법은 긴 준비 시간, 심지어 동일한 코호트 29,30 쥐에서 세포 수의 비율과 TEC는 최종 변수 복잡한 소화 단계 및 결과를 포함한다. 몇 년 전에, Liberase 연구 등급 효소, 고도로 정제 된 콜라게나 중성 프로테아제는 흉선 조직의 해리 (30)에 사용되기 시작 함유. 여기서 우리는 마우스 흉선 조직에서 실행 가능한 TEC는 높은 수를 산출 최적화 된 기계적 분리 절차 Liberase 소화 기반 프로토콜을, 설명합니다. . 해리 기질 세포를 풍부하게하기 위해, 이전의 연구는 밀도 구배 또는 자기 비드 분리 21,29를 사용하고 있습니다. 그러나 두 방법은 흉선 간질 세포, cTECs 29 특히 인구의 특정 집단의 손실 심각한 원인이된다. 세포 독성 제거 및 패닝 기법 <s&gt; (31, 32)까지 널리 면역 필드 12,31에 고갈 또는 림프구의 분리를 위해 사용되어왔다. 이러한 기술을 비교 한 결과, TEC는 우리의 농축을위한 전류 패닝 프로토콜을 세웠다. 농축 절차를 수행하는 동안 부드러운 상태가 적은 세포 죽음과 편견 증가 TEC 복구로 연결됩니다. 제 3 항에 기재된 절연 흉선 세포 현탁액을 직접 TEC 서브 세트와 수지상 세포의 확인 및 특성화를위한 유세포 분석 흐름에 적용될 수있다. 4 장에서는 사이토 다중 매개 흐름을 사용하여 TEC 하위 집합을 식별 할 수있는 간단하고 유용한 방법을 설명합니다. 정제 cTECs 또는 mTECs, TEC 농축 및 절차를 정렬 셀을 얻기 위해 추구 실험을 위해 제 5 및 6에서 찾을 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Anti-mouse EpCAM</td><td>eBioscience</td><td>XX-5791-YY*</td><td>Clone G8.8</td></tr><tr><td>Anti-mouse MHC II</td><td>eBioscience</td><td>XX-5321-YY*</td><td>Clone M5/114.15.2</td></tr><tr><td>Anti-mouse Ly51</td><td>eBioscience</td><td>XX-5891-YY*</td><td>Clone 6C3</td></tr><tr><td>UEA-1</td><td>Vector Laboratory</td><td>FL-1061</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td>LSRFortessa</td><td></td></tr><tr><td>Flow cell sorter</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td>FACSAria</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes</td><td>BD Biosciences</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometry analysis software</td><td>TreeStar - Flowjo</td><td>FlowJo v7/9</td><td></td></tr><tr><td>*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells

흉선은 T 림프구 개발을위한 중요한 기관이다. T 세포 고집, 긍정적 및 부정적 선택을 선택 : 흉선 간질 세포, 흉선 상피 세포 (TEC는)은 T 세포 발달의 여러 단계에서 특히 중요하다. 그러나, 흉선에서 TEC는의 기능이 불완전하게 이해 상태를 유지합니다. 기사에서는 기계적 중단과 소화 효소의 조합을 사용하여 신선한 마우스 흉선에서 TEC 서브 세트를 분리하는 방법을 제공한다. 방법은 흉선 기질 세포 및 흉선 세포를 효율적으로 세포 - 세포 및 세포 - 세포 외 기질로부터 연결 해제 될 단일 세포 현탁액을 형성 할 수있다. 세포 격리하여, 다중 매개 유동 세포 계측법은 TEC는 수지상 세포의 확인 및 특성화에 적용될 수있다. TEC는가 흉선에서 희귀 세포 집단 때문에, 우리는 또한 풍부하고 흉선 세포, 흉선에서 가장 풍부한 세포 유형을 고갈하여 TEC는 정화 할 수있는 효과적인 방법을 설명한다. FOLLO세포 생존의 상실 TEC는 정제 과정을 최소화 할 수 있도록 날개가 농축, 세포 정렬 시간은 감소 될 수있다. 정제 된 세포는 리얼 타임-PCR, 웨스턴 블롯 및 유전자 발현 프로파일 링 같은 다양한 다운 스트림 분석에 적합하다. 프로토콜은 TEC의 기능 연구뿐만 아니라 시험 관내 T 세포 재구성의 발전을 촉진 할 것이다.

수득 된 세포 현탁액은 흉선 세포, 조혈 유래 기질 세포 및 비 - 조혈 기질 세포로 구성 3 절에서 설명한 바와 같이이 프로토콜을 사용하여, 흉선 오르간 성인 마우스 (섹션 2) 및 흉선 세포 현탁액으로부터 제거 제조 하였다. CD45는 조혈 팬 마커가 흉선 세포 및 대 식세포와 수지상 세포로 조혈 기질 세포 모두에서 발현이다. 반면, TEC는 조혈 기원하지 않으며 CD45 15을 표명하지 아니합니다. 제 4 절에 설명 된대로 세포 염색 및 유세포 분석을 실시 하였다. TEC 서브 세트, 및 cTECs mTECs 두 가지 유형, 공통 쌍 유력한 TEC 전구체 (15)로부터 유래. 두 cTECs 및 mTECs는면 (28)에는 EpCAM 분자를 표현한다. 따라서 TEC는는는 EpCAM 양성 및 CD45 음성 유동 세포 계측법에 의해 (그림 2A)에 따라 문이 될 수있다. cTECs 및 mTECs는이 시약에 의해 구별 될 수있다 : Ly51CTEC로 표현 글루 타밀 아미노 펩 티다 제를 인식하는 항체, 및 mTEC (그림 2B)에 결합 렉틴 ​​Ulex Europaeus 응집소-1 (UEA-1) 28. 두 mTECs 및 cTECs는 MHC 클래스 그들의 표면 (그림 2C 및 2D)에 II 분자를 표현한다. mTECs 더욱 MHC II 분자 (도 2d)의 레벨에 따라 mTEC 낮고 mTEC 높게로 분류 될 수있다. 흉선 당 TEC의 평균 수는 약 9 × 105이다. 직접적인 비교에서, 콜라게나 제와 다단계 프로토콜 비해이 Liberase 효소 기반 프로토콜을 사용하여 약 8 배의 TEC는 복구 / 29 (도 3) 디스 파제. 정렬 시간을 감소시키고 회복 간질 세포의 생존 능력을 증가시키기 위해, 우리는 흉선 세포 현탁액을 95 % 이상으로 구성되어 있기 때문에 흉선 흉선 세포를 고갈하는 패닝 방법을 개발 하였다. 세포와 함께 배양 하였다TI-CD90 항체 및 도장 판에 의해 캡처. 전체 제조 흉선 세포에서 그 (프리가 부화)에 비해, TEC는의 비율은 작성자가 풍부한 세포에서 15 % 이상 0.5 % 이하로 증가 (도 4a 및도 4b) 하였다. 항 CD45 패닝은 또한 예를 들어, 일뿐만 아니라 수상 세포를 복구 할 필요가 없다, 만약 사용될 수있다. 이 경우, 약 80 %까지 농축 TEC 증가 (데이터는 미도시). 초점 이동을 통해 간질 세포 농축 한 후, TEC 부분 집합의 비율은 한 집합 또는 다른 선택적 패닝 동안 손실되지 않았 음을 시사한다 (그림 4C와 4D) 변경되지 않았다. 예비 농축 샘플에 비해, TEC는의 회수율은 약 85 % (도 4E)이었다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51780/51780fig1highres.jpg" width="500" /> 그림 1 마우스 흉선 during 해부. 흉선은 전방 우수한 흉부 심장 위에 있습니다. 절단 및 갈비뼈를 해제 한 후, 흉선의 두 개의 흰색 로브 노출되어있다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51780/51780fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림이" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51780/51780fig2highres.jpg" width="500" /> 유세포 분석 데이터와도 2 및 식별 CTEC의 mTEC. 스테인드 흉선 세포 샘플은 유동 세포 계측법으로 분석 하였다. 대표 FACS 프로파일이 표시됩니다. 숫자는 각 인구의 비율을 나타냅니다. (A) 살아있는 세포의, CD45 음성과는 EpCAM 양성 사건의 게이트 TEC 세포를 나타냅니다. TEC 게이트 내 (B)를, 두 집단은 Ly51 및 UEA-의 레벨로 구분됩니다 1. cTECs 높은이Ly51의 어 표현; mTECs는 UEA-1의 높은 수준을 가지고있다. (C) MHC II 분자가 매우 cTECs에 표현된다. (D) mTECs 별도로 낮은 mTEC 높은 mTEC라고합니다 MHC II 높은 MHC II 낮은 하위 집단들로 구성되어 있습니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51780/51780fig2highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51780/51780fig3highres.jpg" width="500" /> 도 3은 liberase 기반 프로토콜은 다단계 콜라게나 제 / 디스 파제 프로토콜을 사용하는 것보다 흉선에서 높은 세포 수율을 허용. 흉선 세포는 이전에 발행 된 다단계 콜라게나 제 / 디스 파제 프로토콜 또는이 liberase 기반 프로토콜을 사용하여 제조 하였다. 샘플의이 그룹은 유동 세포 계측법으로 분석 하였다. (A) &lt;/ strong&gt;을 대표 FACS 프로필이 표시됩니다. 번호 (B) 흉선 마우스 당 TEC의 전체 세포 수. 각 그룹 TEC 세포 비율을 나타내는 막대 그래프에 나타낸다. 오차 막대는 (n은&gt; 3) 표준 편차를 나타냅니다. 양측으로 독립 T 테스트는 소프트웨어의 프리즘을 사용하여 수행 하였다. P &lt;0.0001. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51780/51780fig3highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51780/51780fig4highres.jpg" width="300" /> 패닝 방법으로 TEC는도 4의 농축. 전후 농후 흉선 기질 세포의 FACS 프로필을 나타낸다. 제조 흉선 세포는 안티-CD90 항체로 염색 하였다. CD90 양성 흉선 세포는 흉선 세포의 95 % 이상을 구성한다. TEC 농축 과정에서, 흉선 세포는 CAPTUR 아르ED 및 프레 코트 패닝 플레이트에 고갈은 이와 TEC는 상등액 농축된다. (A)와 (B)는 TEC 게이트가 도시된다. 숫자는 시작 인구 (사전 농축) 또는 농축 (후 농축) 후 총 살아있는 세포 사이 TEC는의 비율을 보여줍니다. (C)와 (D)는, CTEC 및 mTEC 게이트 내의 세포가 표시됩니다. 숫자는 각 그룹에서 TEC 인구에 CTEC와 mTEC의 비율을 표시합니다. (E) 휴대 cTECs의 번호와 마우스 흉선 당 mTECs를 그래프에 표시됩니다. 데이터는 5 실험의 대표이다. &quot;사전은&quot;사전 농축 샘플을 나타내며, &quot;포스트&quot;후 농축 샘플을 나타내며, 작은 수평 라인이 평균을 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51780/51780fig4highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

여기에서 우리는 분리, 식별 및 마우스 흉선 상피 세포 (TEC는) 정화용 효율적인 방법을 설명합니다. 프로토콜은 정상 T 세포의 발달, 흉선 기능 장애, 및 T 세포 재구성을위한 흉선 기능의 연구에 활용 될 수있다.

격리, 식별 및 쥐과 흉선 상피 세포의 정화

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

isolation-identification-purification-murine-thymic-epithelial

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

32.0K 조회수.  University of Minnesota.  여기에서 우리는 분리, 식별 및 마우스 흉선 상피 세포 (TEC는) 정화용 효율적인 방법을 설명합니다. 프로토콜은 정상 T 세포의 발달, 흉선 기능 장애, 및 T 세포 재구성을위한 흉선 기능의 연구에 활용 될 수있다. 

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Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T cell replacement in lymphopenic patients. We studied thymic settling progenitors from murine embryonic day 13 and 18 thymi by two complementary in vitro and in vivo techniques, both based on the &#8220;hanging drop&#8221; method. This method allowed colonizing irradiated fetal thymic lobes with E13 and/or E18 thymic progenitors distinguished by CD45 allotypic markers and thus following their progeny. Colonization with mixed populations allows analyzing cell autonomous differences in biologic properties of the progenitors while colonization with either population removes possible competitive selective pressures. The colonized thymic lobes can also be grafted in immunodeficient male recipient mice allowing the analysis of the mature T cell progeny in vivo, such as population dynamics of the peripheral immune system and colonization of different tissues and organs. Fetal thymic organ cultures revealed that E13 progenitors developed rapidly into all mature CD3+ cells and gave rise to the canonical &#947;&#948; T cell subset, known as dendritic epithelial T cells. In comparison, E18 progenitors have a delayed differentiation and were unable to generate dendritic epithelial T cells. The monitoring of peripheral blood of thymus-grafted CD3-/- mice further showed that E18 thymic settling progenitors generate, with time, larger numbers of mature T cells than their E13 counterparts, a feature that could not be appreciated in the short term fetal thymic organ cultures.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

흉선의 특성 사용하여 마우스 배아에서 전구 세포를 정착<em&gt; 생체</em&gt;와<em&gt; 체외</em&gt; 분석 실험

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

연구

발생학

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

CD4의 분리 + Miltenyi 맥을 정제를 사용하여 마우스 림프절에서 T 세포

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

생물학

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

인간의 흉선에서 골수 수지상 세포와 상피 세포의 분리

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

면역학 및 감염병학

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and selection of T cells specific for self and foreign antigens. The approach entails implantation of thymic grafts derived from various aged mice into immunodeficient scid recipients. Over a relatively short period of time the recipients are fully reconstituted with T cells derived from the implanted thymus graft. Only thymocytes seeding the thymus at the time of isolation undergo selection and develop into mature T cells. As such, changes in the nature and specificity of the engrafted T cells as a function of age-dependent thymic events can be assessed. Although technical expertise is required for successful thymic transplantation, this method provides a unique strategy to study in vivo a wide range of pathologies that are due to or a result of aberrant thymic function and/or homeostasis.

This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.

분리 및 다른 세 쥐 흉선 이식의 이식.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...

Promoting 3-D Aggregation of FACS Purified Thymic Epithelial Cells with EAK 16-II/EAKIIH6 Self-assembling Hydrogel

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing thymus is crucial to maintain effective T cell-mediated acquired immune response against invading pathogens. However, thymus regeneration and revitalization proved to be challenging, largely due to the difficulties of reproducing the unique 3D microenvironment of the thymic stroma that is critical for the survival and function of thymic epithelial cells (TECs). We developed a novel hydrogel system to promote the formation of TEC aggregates, based on the self-assembling property of the amphiphilic EAK16-II oligopeptides and its histidinylated analogue EAKIIH6. TECs were enriched from isolated thymic cells with density-gradient, sorted with fluorescence-activated cell sorting (FACS), and labeled with anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibodies that were anchored, together with anti-His IgGs, on the protein A/G adaptor complexes. Formation of cell aggregates was promoted by incubating TECs with EAKIIH6 and EAK16-II oligopeptides, and then by increasing the ionic concentration of the medium to initiate gelation. TEC aggregates embedded in EAK hydrogel can effectively promote the development of functional T cells in vivo when transplanted into the athymic nude mice.

This video demonstrates a protocol to enrich thymic epithelial cells (TECs) with density gradient for FACS isolation. It also shows the use of EAK16-II/EAKIIH6 peptides to promote the TEC aggregate formation. The microenvironments of EAK16-II/EAKIIH6 hydrogel provide the 3-D configuration necessary to maintain the survival and function of the TECs.

EAK 16-II와 FACS 정화 흉선 상피 세포의 3 차원 집계를 홍보 / EAKIIH6 자기 조립 하이드로 겔을

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

분리 및 쥐 림프구의 활성화

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

흉선과 골수에서 기질 세포 분리 최적화

Stromal Cell Isolation From Hematopoietic Organs

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens through which to study previously unresolved heterogeneity at steady state, as well as changes in cell type representation induced by extrinsic stresses or during aging. Here, we present step-wise protocols for the isolation of high-quality stromal cell populations from murine and human thymus, as well as murine bone and bone marrow. Cells isolated through these protocols are suitable for generating high-quality single-cell multiomics datasets. The impacts of sample digestion, hematopoietic lineage depletion, FACS analysis/sorting, and how these factors influence compatibility with single-cell sequencing are discussed here. With examples of FACS profiles indicating successful and inefficient dissociation and downstream stromal cell yields in post-sequencing analysis, recognizable pointers for users are provided. Considering the specific requirements of stromal cells is crucial for acquiring high-quality and reproducible results that can advance knowledge in the field.

저자 스포트라이트: 단일 세포 염기서열 분석을 위한 기질 세포 분리를 사용한 조혈 연구 발전

Here we present protocols that enable isolation of stromal cells from murine bone, bone marrow, thymus and human thymic tissue compatible with single-cell multiomics.

조혈 장기에서 기질 세포 분리(Stromal Cell Isolation from Hematopoietic Organs)

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens ...

Preparing Mouse Thymic Epithelial Cells for Analysis of Intracellular Molecules

Preparation of Single-Cell Suspension of Mouse Thymic Epithelial Cells and Staining of Intracellular Molecules for Flow Cytometric Analysis

Thymic epithelial cells (TECs) play an essential role in promoting the development and repertoire selection of T cells. Cortical TECs (cTECs) in the thymic cortex induce early T cell development and positive selection of cortical thymocytes. In contrast, medullary TECs (mTECs) in the thymic medulla attract positively selected thymocytes from the cortex and establish self-tolerance in T cells. A variety of molecules, including DLL4 and beta5t expressed in cTECs, as well as Aire and CCL21 expressed in mTECs, contribute to thymus function supporting T cell development and selection. Flow cytometric analysis of functionally relevant molecules in cTECs and mTECs is useful to improve our understanding of the biology of TECs, even though current methods for the preparation of single-cell suspensions of TECs can retrieve only a small fraction of TECs (approximately 1% for cTECs and approximately 10% for mTECs) from young adult mouse thymus. Because many of these functionally relevant molecules in TECs are localized within the cells, we describe our protocols for the preparation of single-cell suspension of mouse TECs and the staining of intracellular molecules for flow cytometric analysis.

Preparation of Single-Cell Suspension of Mouse Thymic Epithelial Cells and Staining of Intracellular Molecules for Flow Cytometric AnalysisMechanisms

We describe protocols for the preparation of single-cell suspension of mouse thymic epithelial cells and the staining of intracellular molecules for flow cytometric analysis.

Thymic epithelial cells (TECs) play an essential role in promoting the development and repertoire selection of T cells. Cortical TECs (cTECs) in the ...

격리, 식별 및 쥐과 흉선 상피 세포의 정화

요약

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이 비디오의 챕터

흉선의 특성 사용하여 마우스 배아에서 전구 세포를 정착

CD4의 분리 + Miltenyi 맥을 정제를 사용하여 마우스 림프절에서 T 세포

인간의 흉선에서 골수 수지상 세포와 상피 세포의 분리

분리 및 다른 세 쥐 흉선 이식의 이식.

EAK 16-II와 FACS 정화 흉선 상피 세포의 3 차원 집계를 홍보 / EAKIIH6 자기 조립 하이드로 겔을

분리 및 쥐 림프구의 활성화

조혈 장기에서 기질 세포 분리(Stromal Cell Isolation from Hematopoietic Organs)

조혈 장기에서 기질 세포 분리(Stromal Cell Isolation from Hematopoietic Organs)

조혈 장기에서 기질 세포 분리(Stromal Cell Isolation from Hematopoietic Organs)

Preparation of Single-Cell Suspension of Mouse Thymic Epithelial Cells and Staining of Intracellular Molecules for Flow Cytometric Analysis