This publication is funded through Cure CMD, an Association Contre Les Myopathies (AFM) grant (project 16297), and the National Institutes of Health (grant numbers K08 AR059750 and L40 AR057721). We would also like to thank Dr. Julie Tetzlaff for her assistance in revising this manuscript.

수확 한 동물의 근육에 적절한 식별자와 근육의 저장에 사용되는 컨테이너를 라벨. 가 추가 될 때 잡화 / 용기 악기 조직의 동결 / 해동을 방지하기 위해 미리 차게. 근육 조직 컬렉션 1. 연구 설계 고려 사항 <ol><li> 작은 동물 모델에서는 병리학 적 연구에 대한 충분한 근섬유 샘플링을 제공하기 위해 전체 근육의 평가를 필요로하기 때문에 작은 동물의 경우 근육 질환 (쥐) 모델은 연구를 위해 전체 근육을 사용합니다. 큰 동물의 경우 근육 질환 (개) 모델은, 자신의 횡 방향 (단면) 측면에서 최소 0.3 × 0.3 cm 또는 큰 근육 부분을 사용합니다. NOTE : 코어 생검도 사용할 수 있지만, 샘플링 문제로 인해 기본 특성화 연구 차선책 일 수있다. </li><li> 근절과 관련된 연구의 경우, 근절 길이의 미세 측정은 중요한 엔드 포인트를 포함 할 수 있고, requ에있다분노 취급 전문. 이것은 일반적으로 질병에만 해당 사항이있는 네 말린 근육 병증의 몇 가지 원인에서와 근절 쇼 부적절한 길이의 요소입니다. 일부 연구소는 오히려 비 인장 또는 비 뻗어 근육에 이러한 측정을 수행하는 것보다, 그 이외의 계약 또는 신장 상태로 근육을 해결하는 것을 선호합니다. <ol><li> 근절의 길이가 측정 할 수없는 경우, (시약 참조) 원하는 EM의 정착에 직접 배치하여 근육을 사전 스트레칭없이 근육 조직을 고정합니다. </li><li> 근절 길이가 측정 될 경우, (설명 참조) 근육을 미리 스트레칭 몇 가지 기술이 사용될 수있다 : <ol><li> 그것은 동물에있는 동안의 휴식 긴장의 근육을 유지하는 클램핑 장치를 사용하여, 클램프의 외부 주위 근육을 절제하고 (시약 참조) 원하는 EM의 정착에 직접 배치합니다. </li><li> 스트레치하고 관찰과 비슷한 길이에 (예 : 코르크 조각으로) 표면에 근육을 고정 <e그것은 동물에서 추출 된 생체 내에서 M&gt; 후. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. 원하는 연구에 적합한 조각으로 분리 된 골격근을 하위 분할 (그림 1) <ol><li> 얼어 붙은 근육 조직 검사의 경우 : <ol><li> 샘플링 바이어스를 최소화한다 (단계 1.1 참조)하지만, 표본 &lt;유물을 동결 방지하기 위해 1.5 cm해야 할 가능한 특정 근육의 많은 부분을 포함합니다. </li><li> 때문에 취급에 차이가 섬유 크기 인공적인 차이를 방지하기 위해 유사 같은 연구에서 모든 근육을 처리합니다. </li></ol></li><li> 전자 현미경 (EM)의 경우 : <ol><li> 일본어 근육의 종축에 평행 한 샘플의 길이 방향 축과, 시료로부터 근육 ~ 0.5 × 0.2 × 0.2 cm 스트립을 잘라. 참고 : 정착 적절 그래서 2mm 이하의 시편 두께를 유지, 조직의 두꺼운 조각을 침투하지 않습니다 적절한 결과를 얻기에 매우 중요합니다. 또한,근육의 이러한 작은 조각의 방향이 자주 어렵 기 때문에, 그것은으로 근육의 실제 방향 (즉, 고정 된 시험편의 긴 측면은 근육 / 근섬유의 길이 방향이다)를 모방 한 조직의 조각을 사용하는 것이 좋습니다 EM 처리 중에 처리 및 혼란을 최소화합니다. </li></ol></li><li> 세포 배양의 경우 : <ol><li> 원하는 세포 수율은 세포 배양 설립에 필요한 근육의 양에 영향을 미칠 수 있습니다. 단일 근육 (또는 근육의 일부) 작은 동물에서 세포 배양을 설정하는 부족의 휴대 번호를 제공, 그래서 수 있습니다 필요한 경우, 여러 개의 근육에서 수영장 조직. </li></ol></li></ol> 전자 현미경 (EM) 3. 조직의 고정 및 처리 <ol><li> (시약 참조) 원하는 EM의 정착에 직접 얇은 차원에서 2mm보다 더 큰 근육의 조각을 놓습니다. </li><li> fixati의 2-48 시간 후 (시약 참조) EM의 정착 버퍼에있는 근육을 놓고에. (몇 주 또는 몇 달) 장기간 고정은 EM 연구에 미세 디테일의 손실이 발생할 수 있습니다. </li><li> 처리를 위해 EM의 핵심 시설로 보냅니다. </li></ol> 조직 학적, 생화학 적, 분자 연구 4. 근육 냉동 <ol><li> 조직이 수건에 약간 부착 될 때까지 철저하게 종이 타월로 표본을 내듯 시편의 과도한 수분을 제거합니다. 과도한 수분은 근육에 상당한 냉동 아티팩트를 생성합니다. 참고 : 조직이 더 베이비 파우더에서 압연하여 건조 할 수있다. 그들은 지나치게 습한 환경에서되지 않는 한이 단계는 일반적으로 근육이 필요하지 않습니다. </li><li> 중심 근육 (그림 2C)에 대한 기초를 제공 할 수있을만큼 10월으로, 얕은 cryomold의 바닥이나 코르크 10월 (또는 트라가 칸트 검과 유사한 접착제)를 놓습니다. 냉동 전에 코르크 또는 cryomold 레이블링 표본 추적하는 데 유용 할 수있다. </li><li> Carefully 단면 한 근육 10 월 (도 2c)에 접촉되지 않도록 OCT를 돌출 근육의 대다수와, 원하는 방향으로 주형에 근육을 배치. </li><li> 이 약 3 ~ 4 cm의 깊이에 도달 할 때까지 금속 컵에 이소 펜탄을 추가합니다. </li><li> 열 안전 장갑에 넣고 듀어의 뚜껑을 제거합니다. </li><li> 컵의 외부에 액체 질소의 수준은 컵의 내부에 이소 펜탄의 레벨 이상이되도록, 액체 질소와 접촉 금속 컵을 놓거나 잡아. 이러한 컨테이너를 준비하는 전략은 그림 2에 나타내었다. <ol><li> 이 작업하기 번거로울 수 있습니다 버블 거품을 생성 (동결에 대해도 충분히 찬)로, 액체 질소가 금속 컵을 입력 할 수 없습니다. </li></ol></li><li> 그것은 적절한 온도에 도달 할 때 결정하기 위해 이소 펜탄을 준수하십시오. 적절한 온도 (최적 사이 -140 -149에 ° C에서), 그래서냉동 이소 펜탄의 뚜껑 흰색 자갈 (몇 분 후, 초기 안개 이소 펜탄 위에 사라진 후)를 형성한다 컵의 바닥, 또는 솔루션에 일반적으로 당밀의 일관성을 두껍게합니다. 이전에이 단계에 동결하면 동결 atifacts을 얻을 것입니다. <ol><li> 이소 펜탄 완전히 고체 정지하는 경우, 해동 및 후속 사용하기 전에 다시 냉동 온도에 진정. </li></ol></li><li> 미리 냉장 집게를 사용하여, 약 10 ~ 20 초 동안 이소 펜탄에 표본 및 코르크 / 금형을 낮 춥니 다. </li><li> 미리 냉각 용기에 냉동 표본을 놓습니다. </li><li> -80 ° C의 냉동고로 전송 될 때까지 항상 드라이 아이스에 표본과 용기를 보관하십시오. </li></ol> 냉동 이슈는 이미 냉동 조직에있는 경우 5., 그 절차는 다음과 같은 사용하여 냉동 이슈의 정도를 개선 &quot;해동 및 재 냉동&quot;할 수있다 <ol><li> 한 번에 냉장고, 한 중 블록을, 드라이 얼음에 보관하십시오. 이 프로토콜의 타이밍은 중요하다. 남은 해동하고 한 번에 하나의 블록을 재 냉동. </li><li> 드라이 아이스에서 RT로 샘플을 이동합니다. </li><li> 샘플이 OCT에서 포함 된 경우, 메스를 사용하여 가능한 한 완전히 주변 OCT를 제거합니다. </li><li> 샘플이 있지만이 건조되는 지점에, 그것은 완전히 해동되는 지점에 실온에서 해동 할 수 있습니다. <ol><li> 가볍게 시편 전체가 다음 단계로 진행하기 전에 해동 될 수 있도록 집게로 표본을 자극. </li></ol></li><li> 단계 4.1-4.10에 규정 된 근육을 고정. </li></ol> 벗겨진 단일 섬유 기능 테스트를위한 근육의 6. 준비 <ol><li> 근육의 저장 과정은 근육 / 섬유가 실험에 사용되는 경우에 따라 다르다. <ol><li> 몇 주 이내에 사용을 위해 -20 ℃에서 (시약 참조) 솔루션을 휴식 50 % glycerol/50 %의 용액에 근육을 배치하고 매장 </li><li> 사용 선미에 대한몇 주 어, C. -80 ° (시약 참조) 솔루션을 휴식 최대 75 % glycerol/25 %의 용액에 근육을 배치하고 매장 </li><li> 또한, -80 ℃에서 실리카 입자에 근육 건조, 핀 코르크 및 저장을하자 이러한 탈수 근육 동안 사용될 수있다. </li></ol></li></ol> 외부 연구소에 세포 배양의 선적 신선한 근육의 7. 준비 세포 배양의 설립을위한 프로토콜이 다른 4-7 잘 설명되어있다. <ol><li> 멸균 완료 성장 매체와 50 ㎖ 멸균 원뿔 관을 입력합니다. </li><li> 완전 배지에서 조직을 침지, 무균 핀셋을 사용하여 튜브에 근조직 추가. <ol><li> 운송 중에 건조를 방지하기 위해 미디어와 튜브의 나머지 부분을 입력합니다. </li></ol></li><li> 스티로폼 상자에 얼음 팩을 추가하고 몇 가지 얼음 팩 근처 원뿔 튜브를 놓습니다. <ol><li> 만 얼음 팩 (그리고 드라이 아이스)이 사용되어야 함을 유의하시기 바랍니다액체 및 조직의 동결로 인한 손상을 방지. </li></ol></li><li> 선박 패키지 O / N, 그러나 조직은 이러한 조건에서 이일을 지속 할 수있다. </li></ol>

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저자가 공개하는 게 없다.

골격근은 구조적으로 그리고 기능적으로 독특한 조직이며, 전문화 준비 절차는 구조적 및 기능적 파라미터의 최적의 평가를 허용 할 필요가있다. 다양한 조직은 일반적으로 임상과 연구 상황에서 병리학 연구에 고정되는 반면, 비 근육 조직에 대한 동결 프로토콜은 일반적으로 동결하기 전에 OCT에서 조직의 몰입을 포함한다. 도 3에 도시 된 바와 같이, 이러한 프로토콜은 골격근의 병리학 적 평가를 위해 적합하지 아직이 일반적으로 발생하는 오류라고 기재 프로토콜 충분히 유사하다. 이 논문의 목적은이 같은 문제를 방지하기 위해 근육의 적절한 처리를위한 간단한 프로토콜을 제공하는 것입니다. 조언도 경우에 외부의 핵심 연구소로 고품질 데이터의 수집을 용이하게하기위한 노력의 일환으로 오프 사이트 생리 학적 및 세포 연구에 대한 근육의 적절한 처리에 컴파일 된 갔지다시 현장 연구는 바람직하거나 할 수 없습니다. 이 프로토콜에 명시된 바와 같이, 병리학 적 연구에 대한 근육의 적절한 처리에 절대적으로 필수적인 요소는 조직의 수분 함량을 최소화하는 근육이 고정되는 온도를 감소하고, 동결이 달성되는 속도를 증가 있습니다. 조직 또는 (액체 질소로 발생 불충분 한 온도 또​​는 냉동 에이전트와 조직 사이의 직접 접촉의 부족에 의해 생성) 냉동 과정의 과도한 속도 저하 내의 과도한 수분은 병리학 적 분석에 악영향을 줄 수 유물을 동결로 이어질 것입니다. OCT를 조직의 수분의 추가 소스를 제공, 많은 실험실 내장 기판으로 검 트라가 칸트와 같은 다른 접착제를 사용합니다. 심지어 동결이 적절하게 수행되는 경우에, 치료는 RT 용기 또는 악기와 접촉을 통해 이후에 실수로 해동 표본을 방지하기 위해주의해야한다.따라서, 성공적인 냉동 공정은 사용되는 모든기구와 용기의 사전 냉각을 포함 계획도를 필요로한다. 냉동 아티팩트가 발생하는 경우, 대부분의 병리학 적 평가에 충분한 조직의 복구를 위해 여기에 설명 된 방법이있다. 그러나,이 동결 / 해동 사이클은 완벽 조직학을 제공하고 (다시 동결 조직에 필요한 시간에 부가하여) 조직의 다른 분자 또는 효소 연구를 저해 할 가능성이 있으므로 적절한 초기 냉동 방법을 사용하는 것이 크게 바람직하지 . 동결 이슈가 미리 고정 된 조직에서 발견 될 경우에, 그러나, 본 명세서에 기재된 기술은 매우 유용 할 수있다. EM 전에 조직 컬렉션에 대한 계획이 필요 특정 기술 과제를 제공 할 수 있습니다에 대한 조직의 고정 및 처리. EM위한 표본을 수집 가장 일반적인 오류 glutaraldehyd 너무 두꺼운 조직 단편의 사용을 포함전자 침투. 글루 타르 알데히드는 주어진 표면주의에서 근육 조직으로 약 0.1 cm 침투으로 EM 샘플들의 한 사이즈가 더 두꺼운보다 0.2 cm이다 않도록주의해야한다. EM 직접 수축 평가 장치의 훌륭한 수단으로 또한 일부 연구자들은 전략을 개발 한 근육 전에 고정에 미리 긴장 또는 사전 스트레칭 생리학 관련 긴장으로 수축 요소를 측정 할 수 있도록한다. 이 사전 장력에 대한 표준 프로토콜은 없지만, 두 가지 전략은 간단하게이 프로토콜에 설명되어 있습니다. 그것은 그들이 매우 특정한 방식으로 수행되고, 그것은 비표준 통해 근절 길이 인공적 변경을 방지하기 위해 슬랙 상태에서 근육을 고정하는 것이 바람직 할 수있다 않는 근육은 예측할 수없는 결과를 초래할 수 사전 인장하려고 주목해야한다 사전 장력 절차 8,9. 이러한 특정 측정은 대부분 B를 포함하여 (필요하지 않은되는 근육임상 목적을 위해 수행 iopsies)가 근육을 긴장 미리보기하기위한 노력은 일반적으로 이루어지지되고, 근육 형태에 주요 효과는 근육 sarcomeres의 불균일 한 간격이다. 이 논문은 선천성 근육 질환 필드 테스트의 성능 SOP를 제공하는 시리즈 제를 의미하고, 일상적 셀룰러 분자 기능성 생리 수행 선천성 근육 질환 분야에서 20 전문가의 노력을 나타내고, 병리학 적 연구. 게시 된 SOP의 범위는 다음 해에 사용할 수 있으며 각에 필요한 프로토콜 및 해당 출판물의 형식은이 SOP 노력의 목표는 제공하는 것입니다 워싱턴 DC 2013 년 4 월에 개최되는 선천성 근육 질환 컨소시엄 워크샵에서 논의 된 1) m로 우리의 분야에서 사용되는 방법과 끝점을 표준화하기 위해 선천성 근육 질환 분야에서 필요한 시험 및 검체 분석 용 로드맵가능하고 UCH 2) 우리의 분야에서 새로운 연구에 대한 표준 관행에 명령을 제공합니다. 우리는 이러한 자원은 우리의에서 연구 된 분야에 새로운 수사관의 진입을 용이하게하고, 따라서 수행 할 수있는 연구의 범위를 향상시킬 수 있다고 생각합니다. 또한, 관행의 표준화 연구를 통해 데이터를 비교하고 전임상 및 임상 시험을 계획하고 수행 할 때 엔드 포인트를 식별하는 데 매우 도움이 될 것입니다. 이 문서의 주요 초점은 다양한 연구에 적합한 동결 및 조직의 준비와 관련이 있지만, 우리의 협력 그룹은 또한 근육 표본의 병리학 적 분석을위한 유용한 끝점을 논의했다. 현재,이 병적 인 분석을 수행 할 때 취할 수있는 방법에 대한 공식적인 합의가없고, 다른 연구의 다양한 각각의 질병에 대한 사전 출판물에 새로운 연구 결과를 관련시키는 수행됩니다. 따라서, 우리는 그것이 유용 할 것이라고 생각근육 병리 특성에 병적 인 엔드 포인트의 계획에 대한 몇 가지 일반적인 지침을 제안한다. 이전 연구에서 병리 정량화에 상당한 생각) (1)에 섬유 크기 측정 방법을 넣어되어야 2) 섬유 타입 별 이상 또는 치료 효과의 가능성은, 3)의 이상 또는 효과의 가능성이 제한되는 각각의 근육에, 4) 연구에서 질병에 대한 특징적인 병리 소견을 정량화하기위한 전략. 섬유 크기는 대부분의 연구에 필요한 엔드 포인트이며, 불행히도 정량 방법에있는 광대 한 차이가 있습니다. 많은 연구는 독자적인 이미징 소프트웨어가 제공하는 자동화 된 정량 방법을 사용하여 이러한 결과를보고 있지만, 이러한 프로그램의 대부분은 이러한 자동화 된 측정이 부정확 한 렌더링 할 수 있습니다 (예 : 섬유는 원이나 타원 것을 가정 등) 바로 가기를 취할. 이들 자동화 된 프로그램이 자신의 측정 B를 만드는 방법을 이해하는 것이 필요하다efore 측정에 대한 자신감을 가지고, 우리는 종이 방법에 이러한 내용을 포함하는 조사를 바랍니다. 또한 섬유 크기를 나타내는 데 사용되는 구체적인 측정은 매우 변수이며, 일부 측정은 다른 10,11에 바람직하다. 섬유 크기의 일반적으로 사용되는 측정은 생리 학적 연구를 수행하는 연구자는 자신의 악기를 사용하여 수득 CSA 측정에 그들의 결과를 표준화하기 때문에, 특히, 섬유의 단면적 (CSA)이다. CSA 측정이 정확하게 완벽한 가로 섹션에서 섬유의 크기를 반영 할 수있는 동안 불행하게도, 그들은 (종 방향 또는 경사 단면 섬유는 인위적으로 높은 CSA 측정을 미칠 정도) 섬유 방향에 광범위하게 의존하는 섬유의 크기에 따라서 적합하지 측정을 예로들 수 있습니다. 섬유 단면적에 덜 의존 섬유 크기의 바람직한 측정 번째의 측정이다 최소의 Feret 지름 (MinFeret 직경)이며근육 세포 (12) 전자 곡경. 이 측정은 섬유 방향에 약간 의존 일반적으로 섬유 측정을위한 임상 금 표준이며, 조사는이 기술을 사용하는쪽으로 이동하는 것이 좋습니다. 이러한 측정들은 CSA 측정 (13)을 생성하는 동일한 소프트웨어를 사용하여 만들 수 및 수동으로 측정하는 간단하다 할 수 있습니다. 섬유 유형, 특정 근육과 특정 질환과 관련된 병리 소견의 컨텍스트에 따라 병리학 적 데이터를 평가에 대하여,이 단지 연구 계획 단계에서 고려되어야 덜 논쟁 거리이다. 섬유 유형은 면역 조직 염색 또는 ATP 아제를 사용하여 평가 될 수 있지만, 특정 근육과 동물 종은 이러한 유형의 섬유의 특정 혼합물 (따라서 서로 다른 기대치를 필요로하고 전략 테스트)이 있는지 체크하는 것이 유용하다. 근육 특정 병적 인 참여 또는 치료 효능발생하고, 전체 근육 중량 컨트롤에 비해 병리학 적 평가하는 근육을 결정하기 전에 질병의 불균일의 정도를 식별하는 데 사용될 수있다. 마지막으로, 잘 많은 근육 질환이 (예 : 네 말린 근육 병증의 네 말린 막대와 같은) 특정 병리학 적 이상 (14, 15)과 관련된 것으로 알려져있다, 그래서 이들의 이상이 섬유 형 또는 근육에서 발견되는 여부를 고려하는 것도 유용합니다 특정 분포 16,17 분석을 수행하는 단계를 포함한다. 우리가 근육의 평가를위한 기준의 유연성 세트를 제안하지 않지만 전반적으로, 우리는이 문제가 이전에 어떤 골격 근육 질환의 병리학 적 연구의 성과에 고려되어야한다고 믿는다.

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which can present a number of challenges when evaluating its pathology. While it is sufficient, and often even optimal, to evaluate most tissues following formalin fixation and paraffin embedding, this process leads to the production of cell shrinkage artifacts that impair the evaluation of critical phenotypes in congenital muscle disease (including myofiber size and shape). Additionally, frozen muscle is required when performing many histochemical stains (including the reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), cytochrome oxidase (COX), succinate dehyrogenase (SDH), adenosine triphosphatase (ATPase), and Oil Red O stains) that are essential for the detection of specific pathological abnormalities required to diagnose a variety of congenital myopathies, mitochondrial myopathies, and storage diseases. Many antibodies and molecular tools used to characterize muscle morphology and function have consequently been developed and optimized only for frozen tissue, which further limits the usefulness of fixed tissue preparations in studies of skeletal muscle biology. As a result, it has become standard practice to freeze skeletal muscle specimens for most clinical and research indications in the field of congenital muscle disease, despite the technical challenges that appropriate freezing might pose.
The freezing of skeletal muscle can be technically challenging due to the high likelihood of ice crystal formation within myofibers when an inappropriate freezing protocol is followed1. In most cases, freezing artifacts are encountered when the water content of the tissue is too high or when the freezing process is too slow. The water content of tissue can be accidentally increased by immersion in fluid, such as transport of the muscle in saline; or freezing can be compromised if the tissue has been entirely immersed in OCT. Both of these procedures can lead to catastrophic freezing artifacts in muscle tissue. Additionally, a number of small missteps in the freezing process may cause slow freezing or accidental thawing of samples after appropriate freezing, and these issues can similarly complicate pathological evaluation. 
As new models and treatments for skeletal muscle disease are developed, it will become increasingly useful to use standard operating procedures (SOPs) to evaluate skeletal muscle phenotypes and treatment efficacy. This is particularly important for the pathological evaluation of congenital muscle diseases, as the recognition of subtle phenotypes seen in many of these disorders can be impaired by improper tissue preparation. This report represents an effort by a Congenital Muscle Disease Consortium to establish a skeletal muscle freezing SOP for the study of congenital muscle disease models. 
The protocol presented here describes a strategy used in our clinical and research labs to optimize assessment of frozen muscle pathology, while also being suitable for a variety of protein-based and genetic studies. Specific strategies to prepare skeletal muscle specimens for electron microscopy are also presented. Additionally, as single fiber functional testing of frozen tissue is possible2,3, experts in these techniques have provided details on optimal tissue handling protocols. Unfortunately, the isolation of myoblast cell lines cannot be effectively performed on pre-frozen tissue, so a strategy is presented herein for the short-term storage and transport of muscle tissue for myoblast culture establishment at outside laboratories. Overall, the methods described here provide guidelines for the appropriate processing of muscle tissue for a variety of pathological, functional, molecular and cellular studies, regardless of the on-site capabilities of a given laboratory.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1111">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For tissue freezing</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:369px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:523px;">Liquid nitrogen Dewar with a liquid withdrawal device</td>
			<td style="width:107px;">Custom Biogenic Systems</td>
			<td style="width:115px;">Lab-5 Series</td>
			<td>Any other liquid nitrogen dewar could substitute.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Cold-conductive container</td>
			<td style="width:107px;">Fisher</td>
			<td style="width:115px;">02-583A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Wide insulated container capable of holding liquid nitrogen</td>
			<td style="width:107px;">Nalgene</td>
			<td style="width:115px;">4150-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Oakton Temp 10 Thermocouple Thermometer</td>
			<td style="width:107px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:115px;">1228Y01</td>
			<td>Optional, but can be very useful in identifying the point at which isopentane is freezing.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For single fiber functional testing</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Petri dish</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">08-757-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Sylgard coating</td>
			<td style="width:107px;">Ellsworth Adhesives</td>
			<td style="width:115px;">&#160;3-6636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Dissection stereomicroscope</td>
			<td style="width:107px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:115px;">693101</td>
			<td>Any other dissection microscope could substitute.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For cell culture</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Sterile laminar flow hood</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:115px;">51022485</td>
			<td>Any other cell culture hood could substitute.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Materials</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For tissue freezing</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Plastic bags/containers</td>
			<td style="width:107px;">Nasco</td>
			<td style="width:115px;">B01009WA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Thermal safety gloves</td>
			<td style="width:107px;">Denville</td>
			<td style="width:115px;">G4162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Face shield</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">S47640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Long forceps</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">&#160;12-460-807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Marker</td>
			<td style="width:107px;">Staples</td>
			<td style="width:115px;">125328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For cell culture</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Sterile 50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:107px;">Denville</td>
			<td style="width:115px;">C1060-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">PES filter unit, 500 mL, 0.22 &#181;m</td>
			<td style="width:107px;">Denville</td>
			<td style="width:115px;">F5227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Sterile forceps</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">644320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Ice packs</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">NC9909223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Insulated Styrofoam box</td>
			<td style="width:107px;">Polar Tech</td>
			<td style="width:115px;">207F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Packing tape</td>
			<td style="width:107px;">Staples</td>
			<td align="right" style="width:115px;">795570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Reagents</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Tissue Freezing</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:107px;">Airgas</td>
			<td style="width:115px;">NI NF160LT350</td>
			<td>Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Isopentane (2-methylbutane)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">M32631-4L</td>
			<td>Store Isopentane&#160; in a flammable materials cabinet.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:523px;">EM fixative (choose one)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:369px;">The buffers without fixative should also be available, as EM-fixed tissues should be transferred from fixative to buffer after several hours or days if they are not immediately processed for EM.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:523px;">2.5% glutaraldehyde in 0.1M cacodylate buffer</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:115px;">16537-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:523px;">Karnovsky&#39;s fixative (3% glutaraldehyde + 2% paraformaldehyde in 0.1M phosphate buffer)</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:115px;">15732-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For functional studies (if desired)&#160;</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Relaxing solution, containing (in mmol/L)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 40 BES</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">B9879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 10 EGTA</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 6.56 MgCl2</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 5.88 Na-ATP</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">A3377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 1.0 DTT</td>
			<td style="width:107px;">RPI</td>
			<td style="width:115px;">D11000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 46.35 K-propionate</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td>Make a solution by mixing proprionic acid (Sigma P1386) and KOH (Fisher P250) 1:1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 15 creatine phosphate, pH 7.0</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 0.4 leupeptin</td>
			<td style="width:107px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:115px;">10895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 0.1 PMSF</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">P7676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Skinning solution, containing&#160;</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Relaxing solution (See Above)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 0.5% Triton X-100</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Indicating silica granules</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Flat pieces of cork (1 x 1 inch)</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:115px;">63305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For cell culture (if desired)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Complete Growth Medium, containing (for 500 mL)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td>Sterilize by filtering the solution through a 500 mL 0.22 &#181;m PES filter unit.&#160; Store at 4&#176;C and use within 1 month.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 395 mL of high glucose Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 100 mL of fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">F6178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 5 mL of 100X Penicillin-Streptomycin-Glutamine (PSG)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">G1146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Storage requriements</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="3" height="20" style="height:20px;">See the materials safety data sheet (MSDS) for all other reagents for storage specifications</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease

골격 근육 때문에, 기능 세포, 분자, 병리학 적 평가에서 최적의 결과를 얻기 위해 조직 수집을위한 특정 프로토콜을 필요로 그 구조와 기능의 고유 한 조직이다. 선천성 근육 질환에 대한 골격 근육을 평가할 때 인해 선천성 근육 질환 및 이러한 기능의 인식을 방해하는 고정의 가능성을 볼 몇 가지 병리학 적 이상 소견의 미묘함에, 냉동 근육의 병적 인 평가는 고정 근육에 바람직하다. 다른 조직을 동결 할 때 일반적으로 사용하지 않는 조직 학적 검사에 대한 골격 근육을 동결 할 때 또한 근육에 심한 동결 아티팩트를 생성 할 수있는 잠재력이 특정주의가 필요합니다. 이 필사본 최적 골격근 형태를 보존하기 위해 액체 질소로 냉각 한 이소 펜탄 (2 - 메틸 부탄)를 사용하여 골격근의 급속 냉동을위한 프로토콜을 설명한다. 이 절차는 또한 F에 효과적이다유전자 또는 단백질 발현 연구를위한 조직을 reezing. 또한, 우리는 수집하는 데 필요한 최소의 노력에 초점을도 (1)​​ 단 하나 섬유의 기능 연구 (2) 근원 세포의 세포 배양을위한 조직의 단기 부상자 명단에 대한 선호하는 방법을 설명하는 광범위한 절차로 우리의 동결 프로토콜을 통합 한 조직과 이러한 연구를 완료하기 위해 전문 연구 또는 참고 실험실에 수송한다. 전반적으로,이 원고는 신선한 조직이 효과적으로 표현형 연구 다양한 분배 될 수있는 방법의 개요를 제공함으로써 선천성 근육 질환과 관련된 병리학 적 연구에 대한 표준 작업 절차 (SOP에)를 제공한다.

부적절한 동결 본 유물의 예를 제공하기 위해, 몇 번의 마우스 대퇴사 두근 근육은 일반적으로 발생하는 오류를 복제하는 다른 기술 (그림 3)를 사용하여 고정 하였다. 도 3a에 도시 된 바와 같이, 적절히 언 골격근은 주변 조직 (보통 다른 근육 섬유, 그러나 때때로 근섬유 사이 근섬유 공간 질병이나 부상 프로세스의 다양한 섬유증 또는 염증 세포로 채워진다)에 근섬유의 타이트 동격을 나타내고 명확하게 볼 수 세포질 구획. 깨끗이 이것으로 퇴행성 변화, 회생 변경, 또는 다른 pathognomonic 발견 (중심 핵, 세포 내 개재물)의 존재를 파악하는 것이 중요하다 같이 병리 분석을 위해, 세포 내 공간을 볼 수있는 능력은, 종종 근섬유 격실보다 중요 공간. 따라서, 세포 내 구획에서 얼음 결정의 존재는 오전을 나타냅니다근육의 병적 인 평가에 ajor 문제. 근육 조직의 적절한 동결은 모두 충분히 차가운 온도와 얼음 결정의 형성을 방지하기 위해 동결 충분한 속도가 필요합니다. 두 요소를 차지하더라도, 상당한 동결 이슈는 여전히 근육 조직 내에 있기 때문에 과도한 습기가 발생할 수 있습니다. 이 문제는 일반적으로 이전에 식염수에 담가 충분히 건조 또는 근육 10 월 (그림 3B, 3E)을 절편의 사이트에서 미디어를 장착과 직접 접촉 한 경우되었던 근육 조직에서 발생합니다. 10월 일부 접촉이 설치 과정의 결과로 일반적으로 피할 수 있지만, 모든 노력은 조직 학적으로 평가하고 OCT를 설치하는 데 사용됩니다 영역 사이의 접촉을 피하도록해야한다. 대조적으로, -80 ° C 냉동고 (도 3c) 및 액체 질소 (도 3D)을 사용하여 언 샘플은 예를 선택해동결 차선 온도 나 속도에 의해 생산되는 냉동 유물들. -80 ° C의 냉동고에 조직을 배치하여 발생하는 느린 냉동 과정은 이슈를 동결의 극단적 인 예를 제공합니다. 액체 질소를 사용하는 경우, 주요 문제는 액체 질소와 조직 사이의 접촉이 조직 - 액체 계면에 형성하는 질소 가스의 칼집을 발생하고,이 기체 인터페이스는 한 냉동 급속한 근육을 생성하기에 충분히 차가운 없다는 것이다. 이는 표본의 표면 근처 상당한 냉동 아티팩트를 생성 할 수 있지만, 검체의 내부 영역은 적절한 비율로 플래시 동결 가능성이 통째로 이슈 동결 절약 될 수있다. 액체 질소에있는 근육 조직의 간단한 침수 이소 펜탄 냉동 과정과 같은 유용한 근처 아무데도 동안, 이소 펜탄 등 기관에서 임상 해부 표본으로 (사용할 수있는 상황에서 큰 근육 표본의 동결을 위해 유용 할 수 있습니다아웃 임상 근육 병리 연구소). (여러 차원에서&gt; 2cm) 조직의 많은 부분을 사용하는 경우이 전략을 사용하고 결과는 일반적으로 더 있습니다. 냉동 아티팩트의 회피가 최적의 조직 학적 결과를 제공하고 있지만, 기술은 실질적으로 부적절 냉동 조직의 평가가 가능 아티팩트 냉동 반전이 또한 개발되었다 (본원에 기술 됨) 하였다. 잘못 (그림 3E) 동결 된 조직은 해동 섬유 내의 물을 재분배 할 수 있도록 엄격하게 통제 조건 (그림 3 층)에서 다시 냉동 및 얻을 수있다 형태 보존 정도가 우수 할 수있다 할 수있다. 우리의 경험에서,이 프로세스는 주목할 정도로 조직의 세포 형태를 유지하지만, 종종 근섬유 공간 내의 섬유의 인공적인 분리를 생성한다. 많은 병적 인 엔드 포인트는 세포 내 공간과 그의에서 발견되는근섬유 공간이 가장 좋은 (섬유증을 강조하거나 다른 세포 유형을 식별하는 하나) 특수 얼룩을 사용하여 볼 수 있습니다, 이러한 인공적인 변화는 진정으로 근육의 병적 인 평가를 저해 할 가능성이 있습니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51586/51586fig1highres.jpg" width="500" /> 골격근의 구조적, 기능적, 및 셀룰러 연구 조직의 그림 1. 아지. 원하는 연구의 종류에 따라, 수집 된 골격 근육 조직은 최적의 결과를 위해 다양한 방법으로 처리 될 수있다. 이 문서에서 설명하는 프로토콜은 전문가의 핵심 시설에서 얻을 수있는 결과를 최적화하기 위해 오프 사이트 연구에 대한 골격 근육 표본을 triaging 또는 처리하는 방법을 설명합니다. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51586/51586fig2highres.jpg" wiDTH = &quot;500&quot;/&gt; 그림 2. 근육 냉동에 사용되는 장치의 예. 프로토콜에서 설명한 바와 같이, 최적의 근육 동결은 냉동 온도에 이소 펜탄에있는 근육 조직의 몰입을 필요로한다. 빙냉 이소 펜탄을 얻는 안전하고 효율적인 수단은 액체 질소를 함유하는 주변 듀어에서 냉각되는 이소 펜탄을위한 금속 용기의 사용을 포함한다. 이 양손을 자유롭게하도록 종종 편리로서, 두 액체의 혼합물을 방지하면서, 액체 질소에 이소 펜탄 용기를 보유하는 등 (A)을 스탠드 링으로서 보조기를 사용하는 것이 가능하다. 또한, 컨테이너는 수동으로 액체 질소 (B)에서 개최 될 수있다. 어느 경우 든, 조직 펜탄가 가시적 용기 (보통 불투명 백색 자갈)의 하단에 동결 된 후 완전한 냉동 있도록 10-20 초 동안 침지한다까지 펜탄에 배치되어서는 안된다. Isope동결 온도 ntane 최소한 &quot;포그&quot;를, (상당한 안개가 존재하는 경우, 즉, 온도가 불충분) 생성한다. 조직이 동결되면, 냉동 후 해동 사고를 방지하기 위해 (냉각기 또는 냉장고에 직접 다음과) 사전 냉각 용기에 직접 넣습니다. (C) 적절하게 장착 냉동 근육 냉동 OCT의베이스로부터 돌출 된 근육 조직의 대부분을 수행한다. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51586/51586fig3highres.jpg" width="500" /> 10월 설치 매체와 접촉, (C) 근육 냉동 상태 (A) 적절 이소 펜탄 냉동 근육의 그림 3. 이슈를 동결하고 효과적인 해동 / 재 냉동의 예. 대표 이미지는 (B) 근육은 이소 펜탄에 적절하게 고정하지만, -80 ° C 냉동고, 및 (D에 </강한&gt;) 근육이 이슈를 동결 다양한 각도 표시, 모두 액체 질소에 냉동. (B)에 나타낸 바와 같이, OCT의 높은 액체 함량은 그것과 접촉하는 근육에 상당한 냉동 아티팩트를 장착하기위한 필수의 OCT 이렇게 단지 최소량 사용해야 생산 및 조직 학적 평가를 위해 근육 &quot;서 있어야 표면에서 &quot;중. (C) -80 ° C 냉동고 또는 (D) 액체 질소 (차가운 얼음 이소 펜탄으로 동결의 속도를 기준으로)를 사용하여 냉동 프로세스의 속도 저하가 중요한 냉동 유물의 생산으로 이어질 수 있습니다. (때문에 10월과 과도한 접촉에) 처음 suboptimally 냉동 (E) 한 후 (F) 해동 여기에 설명 된 기술을 사용하여 다시 냉동 동일한 표본에서 패널 E와 F 쇼 근육. 하나는 다시 냉동 샘플에서 섬유 사이에 인공적인 분리를 관찰 할 수 있지만, 개선 된 In은 근육 섬유의 세포 형태를 쉽게 알 수있다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51586/51586fig3highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.

조직의 우선 순위 구분과 골격근 질환 모델에 대한 동결

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

tissue-triage-and-freezing-for-models-of-skeletal-muscle-disease

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

39.9K 조회수.  Medical College of Wisconsin. The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.

비디오: Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

성인 및 배아 골격근의 Microexplant 문화 및 골격 근육 줄기 세포의 분리

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

연구

생물학

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing in a "satellite cell position" between the myofiber plasma membrane and the laminin-rich basement membrane that ensheaths it, are self-renewing cells that are solely committed to the myogenic lineage1,2. We have recently described a second class of vessel associated progenitors that can generate myofibroblasts and white adipocytes, which responds to damage by efficiently entering proliferation and provides trophic support to myogenic cells during tissue regeneration3,4. One of the most trusted assays to determine the developmental and regenerative potential of a given cell population relies on their isolation and transplantation5-7. To this end we have optimized protocols for their purification by flow cytometry from enzymatically dissociated muscle, which we will outline in this article. The populations obtained using this method will contain either myogenic or fibro/adipogenic colony forming cells: no other cell types are capable of expanding in vitro or surviving in vivo delivery. However, when these populations are used immediately after the sort for molecular analysis (e.g qRT-PCR) one must keep in mind that the freshly sorted subsets may contain other contaminant cells that lack the ability of forming colonies or engrafting recipients.

Method for the enzymatic dissociation, surface labeling and purification by flow cytometry of fibro/adipogenic and myogenic progenitors from murine skeletal muscle.

골격근에서 Progenitors의 정화

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal circulation, intact whole muscle, at body temperature. This includes the study of contractile responses like posttetanic potentiation, staircase and fatigue. Furthermore, the consequences of disease, disuse, injury, training and drug treatment can be of interest. This video demonstrates appropriate procedures to set up and use this valuable muscle preparation.
To set up this preparation, the animal must be anesthetized, and the medial gastrocnemius muscle is surgically isolated, with the origin intact. Care must be taken to maintain the blood and nerve supplies. A long section of the sciatic nerve is cleared of connective tissue, and severed proximally. All branches of the distal stump that do not innervate the medial gastrocnemius muscle are severed. The distal nerve stump is inserted into a cuff lined with stainless steel stimulating wires. The calcaneus is severed, leaving a small piece of bone still attached to the Achilles tendon. Sonometric crystals and/or electrodes for electromyography can be inserted. Immobilization by metal probes in the femur and tibia prevents movement of the muscle origin. The Achilles tendon is attached to the force transducer and the loosened skin is pulled up at the sides to form a container that is filled with warmed paraffin oil. The oil distributes heat evenly and minimizes evaporative heat loss. A heat lamp is directed on the muscle, and the muscle and rat are allowed to warm up to 37&deg;C. While it is warming, maximal voltage and optimal length can be determined. These are important initial conditions for any experiment on intact whole muscle. The experiment may include determination of standard contractile properties, like the force-frequency relationship, force-length relationship, and force-velocity relationship.
With care in surgical isolation, immobilization of the origin of the muscle and alignment of the muscle-tendon unit with the force transducer, and proper data analysis, high quality measurements can be obtained with this muscle preparation.

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

This video demonstrates the surgical preparation and procedures needed to study the contractile responses of the rat medial gastrocnemius muscle preparation in situ. This preparation allows measurement of skeletal muscle contractile properties under physiological conditions. The animal is anesthetized and the muscle is separated from surrounding tissue at its distal end. The Achilles tendon is attached to a force transducer, allowing measurement of the muscle&#x2019;s contractile response at 37 degrees C with an intact circulation.

쥐 절차<em&gt; 현장에서</em&gt; 골격근 수축 등록

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections (bupivacaine, cardiotoxin or notexin), muscle transplantations (denervation-devascularization induced regeneration), intensive exercise, but also murine muscular dystrophy models such as the mdx mouse (for a review of these approaches see 1). In zebrafish, genetic approaches include mutants that exhibit muscular dystrophy phenotypes (such as runzel2 or sapje3) and antisense oligonucleotide morpholinos that block the expression of dystrophy-associated genes4. Besides, chemical approaches are also possible, e.g. with Galanthamine, a chemical compound inhibiting acetylcholinesterase, thereby resulting in hypercontraction, which eventually leads to muscular dystrophy5. However, genetic and pharmacological approaches generally affect all muscles within an individual, whereas the extent of physically inflicted injuries are more easily controlled spatially and temporally1. Localized physical injury allows the assessment of contralateral muscle as an internal control. Indeed, we recently used laser-mediated cell ablation to study skeletal muscle regeneration in the zebrafish embryo6, while another group recently reported the use of a two-photon laser (822 nm) to damage very locally the plasma membrane of individual embryonic zebrafish muscle cells7.
Here, we report a method for using the micropoint laser (Andor Technology) for skeletal muscle cell injury in the zebrafish embryo. The micropoint laser is a high energy laser which is suitable for targeted cell ablation at a wavelength of 435 nm. The laser is connected to a microscope (in our setup, an optical microscope from Zeiss) in such a way that the microscope can be used at the same time for focusing the laser light onto the sample and for visualizing the effects of the wounding (brightfield or fluorescence). The parameters for controlling laser pulses include wavelength, intensity, and number of pulses.
Due to its transparency and external embryonic development, the zebrafish embryo is highly amenable for both laser-induced injury and for studying the subsequent recovery. Between 1 and 2 days post-fertilization, somitic skeletal muscle cells progressively undergo maturation from anterior to posterior due to the progression of somitogenesis from the trunk to the tail8, 9. At these stages, embryos spontaneously twitch and initiate swimming. The zebrafish has recently been recognized as an important vertebrate model organism for the study of tissue regeneration, as many types of tissues (cardiac, neuronal, vascular etc.) can be regenerated after injury in the adult zebrafish10, 11.

The method presented here comprises the precise injury of live zebrafish embryos with high-energy laser pulses and the subsequent analysis of these injuries and their recovery with time. We also show how genetically labeled single or groups of skeletal muscle cells can be tracked during and after laser light induced damage.

Zebrafish 배아 골격근의 레이저 쏜 부상

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

성인 골격근의 개인 Myofibers 및 위성 세포의 분리와 문화

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular dystrophies1-3, congenital myopathies4,5, and disruptions in sarcomeric assembly6,7, due to high genomic and structural conservation with mammals8. Muscular disorganization and locomotive impairment can be quickly assessed in the zebrafish over the first few days post-fertilization. Two assays to help characterize skeletal muscle defects in zebrafish are birefringence (structural) and touch-evoked escape response (behavioral).
Birefringence is a physical property in which light is rotated as it passes through ordered matter, such as the pseudo-crystalline array of muscle sarcomeres9. It is a simple, noninvasive approach to assess muscle integrity in translucent zebrafish larvae early in development. Wild-type zebrafish with highly organized skeletal muscle appear very bright amidst a dark background when visualized between two polarized light filters, whereas muscle mutants have birefringence patterns specific to the primary muscular disorder they model. Zebrafish modeling muscular dystrophies, diseases characterized by myofiber degeneration followed by repeated rounds of regeneration, exhibit degenerative dark patches in skeletal muscle under polarized light. Nondystrophic myopathies are not associated with necrosis or regenerative changes, but result in disorganized myofibers and skeletal muscle weakness. Myopathic zebrafish typically show an overall reduction in birefringence, reflecting the disorganization of sarcomeres.
The touch-evoked escape assay involves observing an embryo&#39;s swimming behavior in response to tactile stimulation10-12. In comparison to wild-type larvae, mutant larvae frequently display a weak escape contraction, followed by slow swimming or other type of impaired motion that fails to propel the larvae more than a short distance12. The advantage of these assays is that disease progression in the same fish type can be monitored in vivo for several days, and that large numbers of fish can be analyzed in a short time relative to higher vertebrates.

The zebrafish is now an established and powerful tool for modeling muscular dystrophies, congenital myopathies, and related neuromuscular diseases. Birefringence and touch-evoked escape behavior are two common noninvasive assays used to determine the degree of muscular disorganization and locomotive impairment of zebrafish embryos during early development.

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

인간의 골격 근육에서 혈관 유래 다 능성 전구체의 분리

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the isolation of these vesicles, including ultracentrifugation, ultrafiltration, and size exclusion chromatography. However, not all are suitable for large scale exosome purification and characterization. Outlined here is a protocol for establishing cultures of primary fibroblasts isolated from adult mouse skeletal muscles, followed by purification and characterization of exosomes from the culture media of these cells. The method is based on the use of sequential centrifugation steps followed by sucrose density gradients. Purity of the exosomal preparations is then validated by western blot analyses using a battery of canonical markers (i.e., Alix, CD9, and CD81). The protocol describes how to isolate and concentrate bioactive exosomes for electron microscopy, mass spectrometry, and uptake experiments for functional studies. It can easily be scaled up or down and adapted for exosome isolation from different cell types, tissues, and biological fluids.

This protocol illustrates the 1) the isolation and culture of primary fibroblasts from the adult mouse gastrocnemius muscle as well as 2) purification and characterization of exosomes using a differential ultracentrifugation method combined with sucrose density gradients followed by western blot analyses.

골격근 섬유아세포(Skeletal Muscle Fibroblast)에서 엑소좀의 분리 및 특성 분석(Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts)

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions can be converted back to NO in mammals through a two-step reduction mechanism: nitrate being reduced to nitrite (NO2-) mostly by oral commensal bacteria, then nitrite being reduced to NO by several mechanisms including via heme- or molybdenum-containing proteins. This reductive nitrate pathway contributes to enhancing NO-mediated signaling pathways, particularly in the cardiovascular system and during muscular exercise. The levels of nitrate in the body before such utilization are determined by two different sources: endogenous NO oxidation and dietary nitrate intake, principally from plants. To elucidate the complex NO cycle in physiological circumstances, we have examined further the dynamics of its metabolites, nitrate and nitrite ions, which are relatively stable compared to NO. In previous studies skeletal muscle was identified as a major storage organ for nitrate ions in mammals, as well as a direct source of NO during exercise. Therefore, establishing a reliable methodology to measure nitrate and nitrite levels in skeletal muscle is important and should be helpful in extending its application to other tissue samples. This paper explains in detail the preparation of skeletal muscle samples, using three different homogenization methods, for nitrate and nitrite measurements and discusses important issues related to homogenization processes, including the size of the samples. Nitrate and nitrite concentrations have also been compared across four different muscle groups.

We present protocols for three different methods for the homogenization of four different muscle groups of rat skeletal muscle tissue to measure and compare the levels of nitrate and nitrite. Furthermore, we compare different sample weights to investigate whether tissue sample size affects the results of homogenization.

질산염 및 아질산염 측정을 위한 쥐 골격근 균질액의 제조

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions ...

Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological physiology. Overexpression or knockdown of target genes enables investigators to manipulate individual molecular events and, thus, better understand the mechanisms that impact muscle mass, muscle metabolism, and contractility. In addition, electroporation of DNA plasmids that encode fluorescent tags allows investigators to measure changes in subcellular localization of proteins in skeletal muscle in vivo. A key functional assessment of skeletal muscle includes the measurement of muscle contractility. In this protocol, we demonstrate that whole muscle contractility studies are still possible after plasmid DNA injection, electroporation, and gene expression modulation. The goal of this instructional procedure is to demonstrate the step-by-step method of DNA plasmid electroporation into mouse skeletal muscle to facilitate uptake and expression in the myofibers of the tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles, as well as to demonstrate that skeletal muscle contractility is not compromised by injection and electroporation.

Electroporation of plasmid DNA into skeletal muscle is a viable method to modulate gene expression without compromising muscle contractility in mice.