Name: alternative cultures for human pluripotent stem cell production, maintenance, and genetic analysis
Uploaded: 2014-07-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
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This work was supported by the Intramural Research Program of the National Institutes of Health (NIH) at the National Institute of Neurological Disorders and Stroke. We would like to thank Dr. Ronald D. McKay for his discussion and comments on this project.

hPSCs의 단일 셀 기반이 아닌 식민지 형 단일 층 (NCM) 문화. 1. 준비 <ol><li> 10 % FBS, 2 밀리미터 L-글루타민, 0.1 mM 비 필수 아미노산 (NEAA)와 보충 DMEM 매체 : 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs)의 배양 배지 500 ㎖로 만든다. </li><li> 마우스 배아 섬유 아세포를 DMEM 배지에서 0.1 % 젤라틴 코팅 6 - 웰 세포 배양 접시에 일상적인 프로토콜 (16)와 문화 MEFs 다음 CF1 균주에서 유래 (MEFs) 세포를 분리. 또한, 상업 자원의 통로 (3)에 MEF의 주식을 구입할 수 있습니다. </li><li> 리겔 플레이트를 준비합니다. <ol><li> -20 ° C의 냉동고에 50 % 씩 분주로 5 (~ 4 ° C에서 냉장) DMEM/F12 배지 ㎖ 및 저장소와 hESC의 자격 리겔 주식의 5 ㎖를 희석. 냉장고 (~ 4 ° C) O / N에서 냉동 마트 리겔 주식을 해동하고 추가 (2.5 % 작업 농도 상승을주는) 차가운 DMEM/F12 배지에서 리겔을 희석. </li><lI&gt; 웰 당 1.5 ml의 2.5 % 리겔과 코트 6 - 웰 세포 배양 플레이트, 냉장고 O / N에 코팅 된 플레이트를 저장하는 (주 : 2 주 안에 리겔 코팅 된 플레이트를 사용한다.) </li><li> 플레이트는 10 ~ 30 분 동안 세포 배양 후드 (참고 : 세포 배양 인큐베이터에서 접시를 따뜻하게하지 않는다)에 실온에서 따뜻하게 할 수 있도록, 냉장고에서 리겔 플레이트를 제거하고 대기음 DMEM 매체 전에 hPSCs을 도금 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 500 ㎖의 hESC 매체 만들기 : 80 % DMEM/F12 배지, 20 % KSR 2 ㎜의 L-글루타민, 0.1 mM의 비 필수 아미노산, 0.1 ㎜의 β-메르 캅토 에탄올, 4는 FGF-2 / ㎖를 겨. </li><li> , 60 % FBS, 20 % DMSO 및 mTeSR1 배지에서 20 μM Y-27632 여과 살균, 1 주 안에 매체를 사용 2X hPSC 동결 매체의 10 ㎖를 준비합니다. </li></ol> . 2 프로토콜 1 (기본) : 공급기에 hPSC 식민지를 성장 <ol><li> 일관성 resul을 얻기 위해 hPSC 문화에 대해 5 또는 6 (P5 및 P6로 지정)에서 MEF 통로 번호를 사용TS. Mitotically 37 ° C에서 3 시간 동안 10 ㎍ / ㎖의 마이 토마 이신 C와 세포를 치료에 의해 MEFs을 비활성화, 세척 세포는 1X 둘 베코 인산염 완충 식염수 (D-PBS)으로 3 배, 다음 0.53 밀리미터에서 0.05 % 트립신 MEFs을 떼어 놓다 EDTA. 대안 적으로, X-선 조사 장치와 8,000 라드의 투여 량으로 MEFs를 조사. </li><li> 현미경 하에서 트립 판 블루 염색 배제 방법을 이용하여 세포 수를 센다. 또한, 자동 세포 계수기를 사용합니다. </li><li> 6 자 폴리스티렌 번호판 플레이트 조사 MEFs 잘 당 1.88 × 10 5 세포 (즉, 1.96 × 10 4 세포 / ㎠)의 밀도로 0.1 % 젤라틴으로 코팅. 37 ° C에서 세포를 품어 5 % CO 2 24 시간 동안. </li><li> 파스퇴르 피펫 (이 시간에 필요로 한 세척 단계를 참고 없음)로 흡인하여 MEF 문화 매체를 제거합니다. </li><li> 작은 덩어​​리로 이전의 문화에서 씹다 hPSC 식민지, FR에 이르기까지 자신의 크기를 확인하기 위해 현미경으로 수풀을 검사OM (50) 직경의 100 ㎛, 잘 hPSC 2 ㎖를 포함하는 하나의 MEF 피더 레이어의 상단에 hPSC 덩어리를 접시. </li><li> 어떤 형태 학적으로 변형 된 또는 차별화 된 식민지 (~ 5 %)를 마크, 사진 에의 한 5 일 기록 식민지의 성장을위한 hESC의 매체 일상을 변경하고 수동으로 파스퇴르 피펫으로 조심스럽게 흡인에 의해 표시 식민지를 제거합니다. </li><li> 두 번 MEFs에 남아있는 식민지 (2 분 D-PBS로 각을) 씻어, 2 ㎖를 1 ㎎ / 10 ~ 30 분 hPSC 매체 ㎖의 콜라게나 제 IV)에 식민지를 배양하고,에서 hPSC 식민지의 분리를 검토 MEF 도포면 (주 : 콜로니 단단히 플레이트에 부착되는 경우에만 박리 공정을 돕기 위하여 스크레이퍼를 사용). </li><li> , 15 ML 튜브에 효소 반응, 전송 식민지를 최소화 hPSC 식민지는 실온에서 3 ~ 5 분 동안 침전 할 수 있도록, 그리고 C의 직접적인 시각화에 의해 식민지의 침전을 보장하기 위해 각 웰에 hPSC 매체의 5 ML을 추가합니다튜브의 바닥에 ELL 학생 (참고 :이 단계에서 튜브를 원심 분리하지 않음). </li><li> 잔류 MEFs를 함유 상청액을 제거하고 단일 세포를 해리, hESC의 매체 (5 mL)로 콜로니를 재현 탁하고, 두 번 침전 단계를 반복한다. </li><li> 세포의 계대를위한 6 자 접시에 (1 아니라 냉동 바이알 당 합류) 또는 판 냉동 보존을위한 매체 (또는 CryoStore CS10 동결 매체) 냉동 1X hPSC 작은 덩어​​리, 저장소로 매체, 씹다 hPSC 식민지를 제거합니다. </li></ol> 3 프로토콜 2. NCM에 hPSC 식민지를 공급기로 변환 <ol><li> 일단 D-PBS에서 hPSC 펠렛을 씻어 10 분 동안 1X Accutase 1 ㎖로 알약을 배양하고, 단일 셀의 분리를 보장하기 위해 현미경으로 효소 반응을 검사합니다. </li><li> 온화 Y-27632은 5 분 동안 RT에서 200 XG에서 원심 분리 한 다음 10 μM을 함유 mTeSR1 배지 5 ㎖에 세포를 재현 탁하여 효소 반응을 종결(세포 손상의 원인이 과도한 원심 분리의 힘을 사용하지 않는 참조). </li><li> 펠렛에 mTeSR1 매체의 5 ML을 추가, 하나의 세포로 펠렛을 재현 탁하고, 필터는 40 μm의 셀 스트레이너 (잔여 세포 집합체를 제거하는)를 통해 세포를 해리. </li><li> 잘 하나에 씨 1.3-2 X 10 6 hPSCs 2.5 % hESC의 자격 리겔로 코팅 된 6 - 웰 플레이트의 (1.4-2.1 × 10 5 세포 / ㎠), 2.5 mL로 mTeSR1 매체를 추가하고, 10 μM을 포함 배지에서 Y-27632 (초기 24 시간 단세포 도금을 촉진하기 위해). 1 μM Y-39983 (내가 억제제 ROCK), 1 μM의 phenylbenzodioxane (ROCK II 억제제), 1 μM의 thiazovivin (소설 ROCK 억제제) 또는 강화 단일 셀 도금 10 μM Y-27632을 대체하기 위해 다음과 같은 작은 분자를 이용 , 2 μM의 JAK 억제제 1. </li><li> (24 시간 이내) 다음날 약 자유로운 mTeSR1 매체와 매체를 교체, 추가로 하나의 세포를 떼어 놓다또한, 단일 세포 도금의 효율을 결정하는 세포의 수를 계산합니다 (참고 : 대략,이 단계에서 달성 될 수 단일 셀 도금 효율 50-90%). </li><li> 세포가 mTeSR1 매체의 3 ㎖로 몇 일 동안 단일 세포 형성 단층으로 성장 할 수 있습니다. 매일 매체를 변경합니다. </li><li> 경험적으로 세포 밀도에 따라 적응 NCM을 계대 일정을 결정합니다. 세포의 성장은 3 일 또는 4 일에 합류, 또는 세포 간 경계의 소멸 후 4 시간 시점에 도달 통로. 1 ~ 3 분할 비율 (즉, 잘 6 잘 플레이트의 3 우물에서 도금 세포의 1 합류) 세포의 계대 용을 사용 Accutase 1 ㎖의 세포를 떼어 놓다, 5 통로에 적응 NCM을 안정. </li><li> 세포 동결 <ol><li> 하나의 고정 된 유리 병에 대해 하나의 합류도 (~ 5 ~ 6 배 6 셀) 활용 : 음 10 분 Accutase 1 ㎖로 한 융합 세포를 떼어 놓다. </li><li> w를 희석i 번째 5 전술 한 바와 같이 mTeSR1 매질 및 원심 셀 ML. </li><li> mTeSR1 매체의 500 μL에 펠렛을 재현 탁하고 천천히 냉동 보존 유리 병 (20 μM Y-27632 포함)을 2 배 hPSC 동결 매체 500 μl를 추가합니다. 대안 적으로, 10 μM Y-27632 또는이 어느 μM의 JAK 억제제 1의 존재하에 2 μM의 JAK 억제제 1 또는 1X CryoStor CS10 매체를 함유하는 1X hPSC 동결 배지에서 세포를 재현 탁. </li><li> 얼음 냉각 cryocontainer (isopranol하여 하단 작성)에 냉동 튜브를 삽입하고 즉시 -80 ° C 냉동고에 cryocontainer를 전송합니다. </li><li> 장기간의 냉동 보존에 대한 (다음 날) 액체 질소 탱크에 -80 ° C 냉동고에서 세포를 전송합니다. </li></ol></li><li> 세포의 해동 <ol><li> 6 잘 플레이트의 1도를 도금 한 냉동 보존 유리 병을 사용한다. </li><li> 2 분 동안 동일한 물을 욕조에 10 분, 해동 세포에 대한 37 ° C의 물을 욕조에 미리 따뜻한 mTeSR1 매체,적가 10 μM Y-27632을 포함하는 미리 예열 mTeSR1 매체의 5 ML에 셀을 추가하고, 상기 한 바와 같이 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 10 μM Y-27632을 포함 mTeSR1 2 ㎖와 세포 펠렛을 재현 탁 천천히 잘 리겔으로 미리 코팅에 세포를 전송 (참고 : 공기 방울을 생성하지 않도록). </li><li> 매일 매체를 변경하고 hPSC 성장은 3 일 또는 4에 합류에 도달 할 전망이다. </li></ol></li></ol> 4 프로토콜 3. NCM 문화에 리겔에 hPSC 식민지로 변환 <ol><li> , 냉장고에서 마트 리겔 코팅 된 플레이트를 제거합니다 10 ~ 30 분 동안 조직 문화 후드에서 플레이트를 배치, 플레이트의 각 우물에서 매체를 제거하고 각 웰에 미리 예열 mTeSR1 2 ㎖를 추가합니다. </li><li> 전송 위의 리겔 플레이트에 피더 문화 (기본 프로토콜의 단계 2.10)에서 hPSC 덩어리를 분쇄. 각 웰에 2.5 ㎖의 최종 부피까지 mTeSR1 매체를 추가합니다. </li><li> 3~4일 매일 매체 변경식민지까지의 80 % 내지 90 %의 합류에 도달합니다. </li><li> 세포의 계대의 경우 : 두 번 D-PBS로 식민지를 씻어 15 ~ 20 분 동안 37 ° C에서 2 ㎎ / ㎖ 디스 파제 1 ㎖의 세포를 치료하고, 수풀 등의 침전물과 통로 세포. </li><li> NCM 문화의 경우 : 3.1 ~ 3.9 프로토콜 2에서 설명하는 단계를 반복합니다. </li></ol> 5 프로토콜 4.에 hPSCs의 NCM 문화 LN-521 <ol><li> 사용 하루 전에 4 ° C에서 재조합 LN-521 솔루션을 해동하고 최종 농도에 (칼슘 2 + / 마그네슘 2 +를 포함) 1X D-PBS와 해동 라미닌을 희석하여 라미닌 코팅 용액 (LCS)을 만들 10 ㎍ / ㎖의. </li><li> (: 드라이 아웃 코팅 과정에서 피할 주)도 6 - 웰 플레이트에 하나에 LCS의 1 ML을 추가합니다. </li><li> 증발을 방지하고 냉장고 (4 ° C) O / N (1 주일 이내에 플레이트를 사용 주)의 플레이트를 저장하는 파라 필름과 코팅 된 플레이트를 밀봉. </li><li> 부드럽게에없이 파스퇴르 피펫 LCS를 제거코팅 된 표면을 uching 잘 하나 mTeSR1 2 ㎖를 추가합니다. </li><li> 25 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 (D-PBS를 포함하여) 모든 문화 솔루션을 따뜻하게. </li><li> hPSC 식민지 NCM로 변환 <ol><li> 프로토콜 2에 설명 된대로 Accutase으로 하나의 세포에 세포 집합체를 떼어 놓다. </li><li> 하나에 씨 1.3-2 X 10 6 hPSCs 잘 LN-521-코팅 (1.4-2.1 × 10 / ㎠ 5 셀) ROCK 억제제의 존재없이. </li><li> 3~4일 매일 매체를 변경합니다. </li><li> 1 내지 3 개의 분할 비를 이용하여 다음 세포 계대 1 일 3 또는 4의 Accutase 1 ml의 세포 해리. </li></ol></li></ol> . 6 프로토콜 5 : NCM 문화 플라스미드 DNA 형질에 대한 <ol><li> 4 프로토콜 2에 설명 된대로 NCM 문화에 hPSC 식민지 적응. </li><li> 플레이트는 10 μM Y-2763의 존재에 mTeSR1 매체에 5 세포 / 웰 × 10 7.5 세포 밀도로 12 - 웰 플레이트에 hPSCs 해리2. </li><li> 세포를 도금 후 4-8 시간 사이에 약 자유로운 mTeSR1 매체와 mTeSR1 매체를 교체합니다. </li><li> 각 형질의 경우 (예를 들어, pmaxGFP) 발현 플라스미드의 2.5 μg을 희석하고 125 ㎕의 옵티-MEM 각 별도의 에펜 도르프 튜브에 리포 펙 타민 2000 년 5 μL 세럼 중간을 감소. </li><li> 5 분 후, 희석 시약을 혼합하고 RT (형질 단지를 형성)에서 20 분 동안 품어. </li><li> 1 ㎖ mTeSR1 매체의 각 잘 포함 hPSCs에 250 ㎕의 형질 단지를 추가하고 24 시간 동안 CO 2 배양기에서 37 ° C에서 세포를 품어. </li><li> 형광 현미경과 실제 형질 전환 효율의 계산을 위해 무작위로 사진에서 형질 전환 효율을 검사합니다. </li></ol> . 7 프로토콜 6 : NCM 문화 마이크로 RNA의 형질에 대한 <ol><li> 6에 잘 당 Accutase 1 ㎖를 추가하여 NCM 조건에서 2 일에 반 합류 hPSCs을 떼어 놓다<html> - 잘 플레이트. </li><li> 5 분 200 XG에서 효소 반응과 원심 분리기를 희석 mTeSR1 매체의 10 ML을 추가합니다. </li><li> , mTeSR1 배지로 세포 펠렛을 재현 탁 10 μM Y-27632를 함유 mTeSR1 배지에서 12 - 웰 플레이트에 웰 당 7.5 × 105 세포의 밀도로 세포를 시드하고, 세포가 4 시간 동안 부착시킨. </li><li> Y27632없는 mTeSR1 매체와 매체를 교체합니다. </li><li> 상업적으로 이용 가능한 마이크로 RNA (예를 들어, Dy547 레이블이 아닌 대상 miRIDIAN miRNA의 형질 컨트롤)를 사용합니다. 제공되는 시약을 사용하여 0-160 nm의에 이르기까지 농도를 적정하고 제조 업체의 지침을 따르십시오. </li><li> 형질 감염 후 24 시간에서 현미경 생균의 Dy547 형광을 영상화함으로써 hPSC 라인의 각 농도에 대한 형질 전환 효율을 최적화. </li><li> 모든 묘화 셀 위에 Dy547 양성 세포의 백분율에 기초하여 형질 전환 효율을 계산한다. </li></ol>. TLE &quot;&gt; 8 프로토콜 7 : 렌티 바이러스 벡터의 형질 도입에 대한 NCM 문화 <ol><li> 반복 프로토콜 6 7.4 7.1 단계를 반복합니다. </li><li> 전달에 사용되는 바이러스 입자의 양을 계산 : 다음 식에 사용 TU를 = TU는 단위 변환의 총 수를 의미하는 반면 (MOI는 CN을 X) / VT, MOI은 잘 (MOI 또는 감염의 원하는 다수의 동일 TU / 셀), CN은 물론 각 세포의 수를 지정하고, VT 재고 바이러스 역가 (TU / ㎖)를 나타냅니다. 예를 들어, SMART-shRNA를 벡터에 대한 스톡 바이러스 역가가 (ML 당 단위 변환) 1 × 10 9 TU / ㎖ 동일 주어진, 7.5 × 10 5 전달시에 웰 당 세포 및 (20)의 예상 MOI는 : 15을 사용 각 웰에 대한 재고 바이러스 입자의 μL가 (주의 :이 조건이 과도 렌티 바이러스 유도하는 것이 좋습니다). </li><li> 30 분 동안 폴리 브렌의 10 ㎎ / ㎖와 mTeSR1 매체의 사전 따뜻한 300 μL. </li><li> 주식 바이러스 입자의 15 μl를 추가로예열 mTeSR1 매체는 폴리 브렌을 함유하는 용액을 부드럽게 혼합한다. </li><li> 바이러스 입자를 포함하는 예비 가온 매체의 300 μL와 세포 배양 배지를 교체합니다. </li><li> 4 시간 배양 한 후, 전달 효율을 결정하는 turboGFP 형광 (shRNA를 발현에 대한 메이커)를 검사합니다. </li><li> 세포가 turboGFP을 표현하기 시작하면 잘 열 변환에 추가 mTeSR1 매체 300 μl를 추가합니다. </li><li> 12 ~ 16 시간 배양 한 후, 터보-GFP 발현을 재검토. </li><li> 72 시간 이내에 형질 세포로 원하는 후속 실험을 수행합니다. </li></ol>

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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+to+culture+of+human+embryonic+stem+cells+and+oncogenesis+in+vivo.">Adaptation to culture of human embryonic stem cells and oncogenesis in vivo.</a> Nat Biotechnol. 25, 207-215 (2007).</li><li>Lee, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumorigenicity+as+a+clinical+hurdle+for+pluripotent+stem+cell+therapies.">Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies.</a> Nat Med. 19, 998-1004 (2013).</li><li>Domogatskaya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin-511+but+not+-332,+-111,+or+-411+enables+mouse+embryonic+stem+cell+self-renewal+in+vitro.">Laminin-511 but not -332, -111, or -411 enables mouse embryonic stem cell self-renewal in vitro.</a> Stem Cells. 26, 2800-2809 (2008).</li><li>Domogatskaya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+of+laminins.">Functional diversity of laminins.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 523-553 (2012).</li><li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+self-renewal+of+human+pluripotent+stem+cells+on+human+recombinant+laminin-511.">Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511.</a> Nat Biotechnol. 28, 611-615 (2010).</li><li>Liew, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+and+stable+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells.">Transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 25, 1521-1528 (2007).</li><li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+human+embryonic+stem+cells+in+serum+and+feeder-free+media.">Genetic manipulation of human embryonic stem cells in serum and feeder-free media.</a> Methods Mol Biol. 584, 413-423 (2010).</li><li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+genetic+manipulation+of+human+embryonic+stem+cells.">Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells.</a> Nat Methods. 5, 389-392 (2008).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

기존의 (피더 또는 세포 외 매트릭스에 세포의) 식민지 형 문화와 지류 6없이 집계로 hPSCs의 현탁 배양 : 체외에서 배양 hPSCs에 두 가지 주요 방법이 있습니다. 식민지 형 서스펜션 모두 배양 방법의 한계는 축적 된 이질성 및 상속 성적인 변경 내용이 포함되어 있습니다. NCM 배양, 단세포 계대 및 고밀도 세포 도금 양에 기초 hPSC 성장 6,18위한 새로운 배양 방법을 나타낸다. 다?...

multilineage의 성인 조직으로 분화하는 hPSCs의 용량은 심장, 간, 췌장, 및 신경 시스템 1-4을 포함하는 심각한 질병으로 고통받는 환자를 치료에 새로운 길을 열었습니다. hPSCs에서 파생 된 다양한 종류의 세포는 질병 모델링, 유전 공학, 약물 검사 및 독성 시험 1,4에 대한 강력한 휴대폰 플랫폼을 제공 할 것이다. 미래 임상 약리학 응용 프로그램을 보장하는 중요한 문제는 체외 세포 배양을 통해 임상 수준의 hPSCs 많은 수의 세대입니다. 그러나, 현재의 문화 시스템은 식민지 5,6 등 hPSCs의 다양한 장치와 피더 무료 문화를 포함, 부족하거나 본질적으로 변수 중 하나입니다. hPSCs 공유 초기 포유류 배아의 내부 세포 덩어리 (ICM)의 많은 구조적 특징의 식민지 형 성장. ICM은 세 가지 세균 층으로 분화하는 경향이있다때문에 이종 신호 그라디언트의 존재 다세포 환경에서. 따라서, 초기 배아 발달에 이성의 인수는 차별화를위한 필수 과정으로 간주하지만, hPSC 문화의 원치 않는 기능입니다. hPSC 문화의 이질성은 종종 인해 차선의 성장 조건에 과도한 세포 사멸 신호와 자발적 분화에 의해 유도된다. 따라서, 콜로니 식 배양에서, 이종 세포는 종종 7,8 콜로니의 주위에서 관찰된다. 또한 인간 배아 줄기 세포 (hESC의)에서 세포는 BMP-4와 같은 구 신호 분자로 전시 차동 응답 콜로니 것으로 밝혀졌다. 또한, 식민지 배양 방법으로 인해 통제 할 수없는 성장 속도와 세포 사멸 신호가 6,9를 경로에 낮은 세포 수율뿐만 아니라 냉동 보존에서 매우 낮은 세포 회수율을 생산하고 있습니다. 최근 몇 년 동안, 다양한 서스펜션 문화, 배양 hPSCs에 particul을 개발 한피더 행렬없는 조건 6,10-13에 hPSCs 많은 양의 확장을위한 아 흘리. 물론, 다른 문화 시스템은 자신의 장점과 단점이있다. 일반적으로, hPSCs의 이질적인 성격은 유전 공학 6에 hPSCs에 DNA와 RNA 자료를 제공하기위한 차선이다 식민지 유형 및 집계 문화 방법의 주요 단점 중 하나를 나타냅니다. 명백하게, 현재의 배양 방법의 몇 가지 단점을 회피 새로운 시스템을 개발하는 필수적인 필요가있다. 단일 세포의 생존을 개선 (예 : ROCK 억제제 Y-27632 및 JAK 억제제 1과) 작은 분자 억제제의 발견은 해리 - hPSC 문화 (14, 15)에 대한 방법을 포장. 이러한 작은 분자의 사용으로, 우리는 최근 비 식민지 유형 해리 - hPSCs 9 (NCM)의 성장에 따라 배양 방법을 개발했습니다. 이 신규 한 배양 방법은 단일 세포 계대 고밀도 모두 결합, 도금 방법을 우리가 주요 염색체 이상 9없이 안정적인 성장주기에 따라 균일 한 hPSCs 많은 양을 생산할 수 있도록. 또한, NCM 문화는 다양한 응용 프로그램에 대한 배양 방법을 최적화하기 위해 다른 작은 분자 (예 : 라미닌 등) 정의 행렬로 구현 될 수 있습니다. 여기, 우리는 NCM 문화를 기반으로 몇 가지 상세한 프로토콜을 제시하고 유전 공학에 대한 자세한 절차를 서술. NCM 프로토콜의 다양성을 설명하기 위해, 우리는 또한 다양한 ROCK 억제제와 하나의 라미닌 이소 521 (즉, LN-521)와 NCM 문화를 테스트했다.

<table><tbody><tr><td>Countess automated cell counter</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>C10227</td><td>Automatic cell counting</td></tr><tr><td>Faxitron Cabinet X-ray System</td><td>Faxitron X-ray Corporation, Wheeling, IL&amp;nbsp;</td><td>Model RX-650</td><td>X-ray irradiation of MEFs</td></tr><tr><td>MULTIWELL 6-well plates</td><td>Becton Dickinson Labware</td><td>353046</td><td>Polystyrene plates</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>11965&amp;ndash;092</td><td>For MEF medium</td></tr><tr><td>Mitomycin C</td><td>Roche</td><td>107409</td><td>Mitotic inhibitor</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>25300-054</td><td>For MEF dissociation</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>11330&amp;ndash;032</td><td>For hPSC medium</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>31985-062</td><td>For hPSC transfection</td></tr><tr><td>Heat-inactivated FBS</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>16000&amp;ndash;044</td><td>Component of MEF medium</td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>10828&amp;ndash;028</td><td>KSR, Component of hPSC medium</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate-Buffered Saline</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>14190-144</td><td>D-PBS, free of Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Non-essential amino acids</td><td>Invitrogen</td><td>11140&amp;ndash;050</td><td>NEAA, component of hPSC medium</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>25030&amp;ndash;081</td><td>Component of hPSC medium</td></tr><tr><td>mTeSR1 &amp;amp; Supplements</td><td>StemCell Technologies</td><td>5850</td><td>Animal protein-free</td></tr><tr><td>TeSR2 &amp;amp; Supplements</td><td>StemCell Technologies</td><td>5860</td><td>Xeno-free medium</td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>M7522</td><td>Component of hPSC medium</td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; MEF (CF-1) ATCC</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)&amp;nbsp;</td><td>SCRC-1040</td><td>For feeder culture of hPSCs</td></tr><tr><td>hESC-qualified Matrigel</td><td>BD Bioscience</td><td>354277</td><td>For feeder-free culture of hPSCs</td></tr><tr><td>Laminin-521</td><td>BioLamina</td><td>LN521-02</td><td>Human recombinant protein</td></tr><tr><td>FGF-2 (recombinant FGF, basic)</td><td>R&amp;amp;D Systems, MN</td><td>223-FB</td><td>Growth factor in hPSC medium</td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>StemCell Technologies</td><td>7930</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT-104</td><td>1X mixed enzymatic solution</td></tr><tr><td>JAK inhibitor I</td><td>EMD4 Biosciences</td><td>420099</td><td>An inhibitor of Janus kinase</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>EMD4 Biosciences</td><td>688000</td><td>ROCK inhibitor</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Stemgent</td><td>04-0012</td><td>ROCK inhibitor</td></tr><tr><td>Y-39983</td><td>Stemgent</td><td>04-0029</td><td>ROCK I inhibitor</td></tr><tr><td>Phenylbenzodioxane</td><td>Stemgent</td><td>04-0030</td><td>ROCK II inhibitor</td></tr><tr><td>Thiazovivin</td><td>Stemgent</td><td>04-0017</td><td>A novel ROCK inhibitor</td></tr><tr><td>BD Falcon Cell Strainer</td><td>BD Bioscience</td><td>352340</td><td>40 &amp;micro;m cell strainer</td></tr><tr><td>Nalgene 5100-0001 Cryo 1 &amp;deg;C</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>C6516F-1</td><td>&amp;ldquo;Mr. Frosty&amp;rdquo; Freezing Container</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>11668-027</td><td>Transfection reagents</td></tr><tr><td>DharmaFECT Duo</td><td>Thermo Scientific</td><td>T-2010-02</td><td>Transfection reagent</td></tr><tr><td>Non-targeting miRIDIAN miRNA Transfection Control</td><td>Thermo Scientific</td><td>IP-004500-01-05</td><td>Labeled with Dy547, to monitor the delivery of microRNAs&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SMART-shRNA</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>To be determined</td><td>Lentiviral vector</td></tr><tr><td>pmaxGFP</td><td>amaxa Inc (Lonza)</td><td>Included in every transfection kit</td><td>Expression plasmid for transfection control</td></tr><tr><td>Oct-4</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-5279</td><td>Mouse IgG2b, pluripotent marker</td></tr><tr><td>SSEA-1</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-21702</td><td>Mouse IgM, differentiation marker</td></tr><tr><td>SSEA-4</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-21704</td><td>Mouse IgG3, pluripotent marker</td></tr><tr><td>Tra-1-60</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-21705&amp;nbsp;</td><td>Mouse IgM, pluripotent marker</td></tr><tr><td>Tra-1-81</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-21706</td><td>Mouse IgM, pluripotent marker</td></tr><tr><td>CK8 (C51)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8020</td><td>Mouse IgG1, against cytokeratin 8</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-fetoprotein</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8399</td><td>AFP, mouse IgG2a</td></tr><tr><td>HNF-3&amp;beta; (P-19)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-9187</td><td>FOXA2, goat polyclonal antibody</td></tr><tr><td>Troponin T (Av-1)</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-295-P0</td><td>Mouse IgG1</td></tr><tr><td>Desmin</td><td>Thermo Scientific</td><td>RB-9014-P1</td><td>Rabbit IgG</td></tr><tr><td>Anti-NANOG</td><td>ReproCELL Inc, Japan</td><td>RCAB0004P-F</td><td>Polyclonal antibody&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Rat anti-GFAP</td><td>Zymed</td><td>13-0300</td><td>Glial fibrillary acidic protein</td></tr><tr><td>Albumin (clone HSA1/25.1.3)</td><td>Cedarlane Laboratories Ltd.</td><td>CL2513A</td><td>Mouse IgG1</td></tr><tr><td>Smooth muscle actin (clone 1A4)</td><td>DakoCytomation Inc</td><td>IR611/IS611</td><td>Mouse IgG2a</td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Chemicon International</td><td>MAB5326</td><td>Rabbit polyclonal antibody</td></tr><tr><td>TUBB3</td><td>Convance Inc</td><td>MMS-435P</td><td>Tuj1, mouse IgG2a</td></tr><tr><td>HNF4&amp;alpha; (C11F12)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>3113</td><td>Rabbit monoclonal antibody</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (solution)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>PFA, fixative, diluted in D-PBS</td></tr></tbody></table>

alternative cultures for human pluripotent stem cell production, maintenance, and genetic analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

NCM 문화의 일반적인 스키마 그림 1은 ROCK 억제제 Y-27632의 존재 고밀도 단일 셀 도금 후 hPSCs의 역동적 인 변화를 보여주는 전형적인 NCM 문화 스키마를 나타냅니다. 이러한 형태 변화는 세포의 클러스터 형성을 도금, 세포 응축 다음에 지수 세포 성장 (그림 1A) 후 세포 간 연결이 (가) 있습니다. 대표적인 실험이 1 일에서 10 μM Y-27632의 존재 /...

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Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

인간 다 능성에 대한 대안 문화는 전지 생산, 유지 보수 및 유전 분석을 줄기

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

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12.3K 조회수.  National Institutes of Health. Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

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Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System

Continued advancement in pluripotent stem cell culture is closing the gap between bench and bedside for using these cells in regenerative medicine, drug discovery and safety testing. In order to produce stem cell derived biopharmaceutics and cells for tissue engineering and transplantation, a cost-effective cell-manufacturing technology is essential. Maintenance of pluripotency and stable performance of cells in downstream applications (e.g., cell differentiation) over time is paramount to large scale cell production. Yet that can be difficult to achieve especially if cells are cultured manually where the operator can introduce significant variability as well as be prohibitively expensive to scale-up. To enable high-throughput, large-scale stem cell production and remove operator influence novel stem cell culture protocols using a bench-top multi-channel liquid handling robot were developed that require minimal technician involvement or experience. With these protocols human induced pluripotent stem cells (iPSCs) were cultured in feeder-free conditions directly from a frozen stock and maintained in 96-well plates. Depending on cell line and desired scale-up rate, the operator can easily determine when to passage based on a series of images showing the optimal colony densities for splitting. Then the necessary reagents are prepared to perform a colony split to new plates without a centrifugation step. After 20 passages (~3 months), two iPSC lines maintained stable karyotypes, expressed stem cell markers, and differentiated into cardiomyocytes with high efficiency. The system can perform subsequent high-throughput screening of new differentiation protocols or genetic manipulation designed for 96-well plates. This technology will reduce the labor and technical burden to produce large numbers of identical stem cells for a myriad of applications.

The protocols described allow laboratories to perform scalable, adherent stem cell culture in high throughput with minimal labor, experience and equipment investment cost using a programmable liquid handling robot and 96-well plates. iPSCs passaged more than 20 times on this system maintained pluripotency, normal karyotypes and differentiated into cardiomyocytes.

로봇 액체 처리 시스템을 사용하여 확장 가능한 96 웰 IPSC 문화 기반 플레이트 및 생산

Continued advancement in pluripotent stem cell culture is closing the gap between bench and bedside for using these cells in regenerative medicine, drug ...

연구

발생학

A Novel Culture Model for Human Pluripotent Stem Cell Propagation on Gelatin in Placenta-conditioned Media

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of interest. Nevertheless, an ideal humanized ex vivo feeder-free propagation method for hPSCs has not been developed; currently, additional exogenous substrates including basic fibroblast growth factor (bFGF), a master hPSC-sustaining factor, is added to all of culture media and synthetic substrata such as Matrigel or laminin are used in all feeder-free cultures. Recently, our group developed a simple and efficient protocol for the propagation of hPSCs using only conditioned media derived from the human placenta on a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or synthetic substrata specific to hPSCs. This protocol has not been reported previously and might enable researchers to propagate hPSCs efficiently in humanized culture conditions. Additionally, this model obviates hPSC contamination risks by animal products such as viruses or unknown proteins. Furthermore, this system facilitates easy mass production of hPSCs using the gelatin coating, which is simple to handle, dramatically decreases the overall costs of ex vivo hPSC maintenance.

This protocol provides a simple and efficient way to propagate human pluripotent stem cells (hPSCs) using only conditioned media derived from the human placenta in a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or hPSC-specific synthetic substrata.

소설 문화 모델은 인간 다 능성에 대한 태반 에어컨 미디어에서 젤라틴에 세포 전파 줄기

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety cabinets (BSCs) and incubators have long been the standard for culturing and expanding cell lines for basic and preclinical research. However, as the focus of many stem cell laboratories shifts from basic research to clinical translation, additional requirements are needed of the cell culturing system. All processes must be well documented and have exceptional requirements for sterility and reproducibility. In traditional incubators, gas concentrations and temperatures widely fluctuate anytime the cells are removed for feeding, passaging, or other manipulations. Such interruptions contribute to an environment that is not the standard for cGMP and GLP guidelines. These interruptions must be minimized especially when cells are utilized for therapeutic purposes. The motivation to move from the standard BSC and incubator system to a closed system is that such interruptions can be made negligible. Closed systems provide a work space to feed and manipulate cell cultures and maintain them in a controlled environment where temperature and gas concentrations are consistent. This way, pluripotent and multipotent stem cells can be maintained at optimum health from the moment of their derivation all the way to their eventual use in therapy.

Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.

기본 및 전임상 연구 밀폐 세포 배양 시스템에서 인간 다 능성 및 신경 줄기 세포를 배양

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Small-scale Propagation of Human iPSCs in Serum-free Conditions for Routine Immunocytochemical Characterization

There is great interest in utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) for disease modeling and cell therapeutics due to their patient specificity and characteristic stemness. However, the pluripotency of iPSCs, which is essential to their functionality, must be confirmed before these cells can be used in such applications. While a rigorous characterization of iPSCs, through different cellular and functional assays is necessary to establish their pluripotency, routine assessment of pluripotency maintenance can be achieved more simply and effectively through immunocytochemical techniques. Here, we present a systematic protocol for culturing hiPSCs, in a scaled-down manner, to particularly facilitate the verification of their pluripotent state using immunocytochemistry. More specifically, this methodology encompasses an efficient and cost-effective means of growing iPSCs in serum-free conditions and plating them on small chamber slides or glass coverslips ideal for immunocytochemistry.

Regular characterization of induced pluripotent stem cells (iPSCs), to ascertain maintenance of their pluripotent state, is an important step before these cells are used for other applications. Here we describe a method for the small-scale propagation of human iPSCs specifically designed to enable their easy and routine characterization via immunocytochemistry.

일상적인 면역 세포 화학 특성에 대한 혈청이없는 조건에서 인간 iPSCs의 소규모 전파

There is great interest in utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) for disease modeling and cell therapeutics due to their patient ...

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a Na&#239;ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

Na&#239;ve human pluripotent stem cells (N-hPSC) with improved functionality may have a wide impact in regenerative medicine. The goal of this protocol is to efficiently revert lineage-primed, conventional human pluripotent stem cells (hPSC) maintained on either feeder-free or feeder-dependent conditions to a na&#239;ve-like pluripotency with improved functionality. This chemical na&#239;ve reversion method employs the classical leukemia inhibitory factor (LIF), GSK3&#946;, and MEK/ERK inhibition cocktail (LIF-2i), supplemented with only a tankyrase inhibitor XAV939 (LIF-3i). LIF-3i reverts conventional hPSC to a stable pluripotent state adopting biochemical, transcriptional, and epigenetic features of the human pre-implantation epiblast. This LIF-3i method requires minimal cell culture manipulation and is highly reproducible in a broad repertoire of human embryonic stem cell (hESC) and transgene-free human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. The LIF-3i method does not require a re-priming step prior to the differentiation; N-hPSC can be differentiated directly with extremely high efficiencies and maintain karyotypic and epigenomic stabilities (including at imprinted loci). To increase the universality of the method, conventional hPSC are first cultured in the LIF-3i cocktail supplemented with two additional small molecules that potentiate protein kinase A (forskolin) and sonic hedgehog (sHH) (purmorphamine) signaling (LIF-5i). This brief LIF-5i adaptation step significantly enhances the initial clonal expansion of conventional hPSC and permits them to be subsequently na&#239;ve-reverted with LIF-3i alone in bulk quantities, thus obviating the need for picking/subcloning rare N-hPSC colonies later. LIF-5i-stabilized hPSCs are subsequently maintained in LIF-3i alone without the need of anti-apoptotic molecules. Most importantly, LIF-3i reversion markedly improves the functional pluripotency of a broad repertoire of conventional hPSC by decreasing their lineage-primed gene expression and erasing the interline variability of directed differentiation commonly observed amongst independent hPSC lines. Representative characterizations of LIF-3i-reverted N-hPSC are provided, and experimental strategies for functional comparisons of isogenic hPSC in lineage-primed vs. na&#239;ve-like states are outlined.

We present a protocol for efficient, bulk, and rapid chemical reversion of conventional lineage-primed human pluripotent stem cells (hPSC) into an epigenomically-stable na&#239;ve preimplantation epiblast-like pluripotent state. This method results in decreased lineage-primed gene expression and marked improvement in directed multilineage differentiation across a broad repertoire of conventional hPSC lines.

향상 된 Multilineage 차별화 힘으로 순진한 같은 상태로 기존의 인간의 Pluripotent 줄기 세포의 화학 귀선

Na&#239;ve human pluripotent stem cells (N-hPSC) with improved functionality may have a wide impact in regenerative medicine. The goal of this protocol is ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

인간 배아 줄기 세포의 문화 및 유지 관리

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

생물학

Feeder-Free Adaptation, Culture and Passaging of Human IPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

The discovery in 2006 that human and mouse fibroblasts could be reprogrammed to generate iPS cells 1-3 with qualities remarkably similar to embryonic stem cells has created a valuable new source of pluripotent cells for drug discovery, cell therapy, and basic research.
GIBCO media and reagents have been at the forefront of pluripotent stem cell research for years. Knockout DMEM supplemented with Knockout Serum Replacement is the media of choice for embryonic stem cell growth and now iPS cell culture 3-9. This gold standard media system can now be used for feeder-free culture with the addition of Knockout SR Growth Factor Cocktail.
Traditional human ES and iPS cell culture methods require the use of mouse or human fibroblast feeder layers, or feeder-conditioned medium. These culture methods are labor-intensive, hard to scale and it is difficult to maintain hiPS cells undifferentiated due to the undefined conditions. Invitrogen has developed Knockout SR Growth Factor Cocktail to allow you to easily transition your hiPS cell cultures to feeder-free while still maintaining your use of Knockout SR.

The following protocol provides instruction for adapting human induced Pluripotent Stem (iPS) Cells to feeder-free culture using complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free medium (KSR-FF). Once adapted, instructions for continual maintenance are also provided.

완료 녹아웃 세럼 교체 피더 - 무료 매체를 사용하여 인간의 IPS 세포 피더 - 자유 적응력, 문화와 Passaging

The discovery in 2006 that human and mouse fibroblasts could be reprogrammed to generate iPS cells 1-3 with qualities remarkably similar to embryonic stem ...

자동 배양 시스템을 사용한 유도 만능 줄기세포 분화

An Automated Culture System for Maintaining and Differentiating Human-Induced Pluripotent Stem Cells

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with infinite self-proliferating ability have been expected to have applications in numerous fields, including the elucidation of rare disease pathologies, the development of new medicines, and regenerative medicine aiming to restore damaged organs. Despite this, the social implementation of hiPSCs is still limited. This is partly because of the difficulty of reproducing differentiation in culture, even with advanced knowledge and sophisticated technical skills, due to the high sensitivity of iPSCs to minute environmental changes. The application of an automated culture system can solve this issue. Experiments with high reproducibility independent of a researcher's skill can be expected according to a shared procedure across various institutes. Although several automated culture systems that can maintain iPSC cultures and induce differentiation have been developed previously, these systems are heavy, large, and costly because they make use of humanized, multi-articulated robotic arms. To improve on the above issues, we developed a new system using a simple x-y-z axis slide rail system, allowing it to be more compact, lighter, and cheaper. Furthermore, the user can easily modify parameters in the new system to develop new handling tasks. Once a task is established, all the user needs to do is prepare the iPSC, supply the reagents and consumables needed for the desired task in advance, select the task number, and specify the time. We confirmed that the system could maintain iPSCs in an undifferentiated state through several passages without feeder cells and differentiate into various cell types, including cardiomyocytes, hepatocytes, neural progenitors, and keratinocytes. The system will enable highly reproducible experiments across institutions without the need for skilled researchers and will facilitate the social implementation of hiPSCs in a wider range of research fields by diminishing the obstacles for new entries.

저자 스포트라이트: 재현성 향상을 위한 iPSC 문화 자동화 

Here, we present a protocol for an automated cell culture system. This automated culture system reduces labor and benefits the users, including researchers unfamiliar with handling induced pluripotent stem (iPS) cells, from the maintenance of iPS cells to differentiation into various types of cells.

인간 다 능성에 대한 대안 문화는 전지 생산, 유지 보수 및 유전 분석을 줄기

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

로봇 액체 처리 시스템을 사용하여 확장 가능한 96 웰 IPSC 문화 기반 플레이트 및 생산

소설 문화 모델은 인간 다 능성에 대한 태반 에어컨 미디어에서 젤라틴에 세포 전파 줄기

기본 및 전임상 연구 밀폐 세포 배양 시스템에서 인간 다 능성 및 신경 줄기 세포를 배양

일상적인 면역 세포 화학 특성에 대한 혈청이없는 조건에서 인간 iPSCs의 소규모 전파

향상 된 Multilineage 차별화 힘으로 순진한 같은 상태로 기존의 인간의 Pluripotent 줄기 세포의 화학 귀선

인간 배아 줄기 세포의 문화 및 유지 관리

완료 녹아웃 세럼 교체 피더 - 무료 매체를 사용하여 인간의 IPS 세포 피더 - 자유 적응력, 문화와 Passaging

인간 유도 만능 줄기 세포의 유지 및 분화를 위한 자동 배양 시스템

인간 유도 만능 줄기 세포의 유지 및 분화를 위한 자동 배양 시스템

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