우리는 많은 도움이 토론 이브 Couder에게 특별한 감사를드립니다. 우리는 캔틸레버와 토론의 교정을 위해 테프 Asnacios 감사합니다. 우리는 비판적 읽기 리사 윌리스, 엘리엇 Meyerowitz, 올리버 Hamant 감사합니다. 이 작품은 인간 프론티어 과학 프로그램 보조금 RGP0062/2005-C에 의해 부분적으로 투자되었습니다; 직원은 국립 드 라 공들인는 &#39;&#39; &#39;&#39; Growpec, &#39;&#39;과 &#39;&#39; Mechastem를 투영합니다.

1. 샘플 장착 용 유리 슬라이드를 준비합니다 <ol><li> 아가로 오스 매체 복제 인간의 DNA 준비 : 10 % 만니톨 (물)의 0.7 % 저 융점 아가. </li><li> 강한 금속기구 (예를 들면 드릴 팁, 라임)을 사용하여 현미경 유리 슬라이드의 중심에 0.5 × 0.5 cm의 영역을 에칭. 또는 그 대신, 아랄 다이 접착제를 사용하여 유리 슬라이드에 유리 라멜라 (약 20 × 200 ㎛)의 작은 조각을 접착제. NOTE :이되도록하여 아가로의 부착을 용이하게하기 위해 표면을 거칠게하는 슬라이드 아가 미디어 스틱 또는 수정. 이 슬라이드는 재사용 할 수 있습니다. </li><li> 유리 슬라이드의 에칭 지역에 아가로 오스 매체 복제 인간의 DNA의 약 20 μL의 방울을 배치합니다. 따라서, 아가 로스의 박막을 준다. </li><li> 습기가 상자에 유리 슬라이드를 저장하고 아가 로스 미디어가 응고 될 때까지 기다립니다. </li></ol> 2. 분열 조직 샘플을 해부 및 설치 <ol><li> 공 초점 이마 기위한 Microdissect 분열 조직NG : 초 미세 핀셋을 아래로 당겨서 줄기에서 꽃 봉오리 하나 하나를 제거합니다. 그것은 (P1 원기 14 즉) 꽃받침 잎을 나타내지 않는 꽃 봉오리에 모든 꽃 봉오리를 제거하는 것이 중요합니다. </li><li> 면도날이나 핀셋의 끝 부분을 사용하여, 멀리 줄기에서 분열 조직을 잘라. 컷은 AFM으로 측정한다 분열 조직 표면의 영역에 평행해야한다. 얻어진 정점은 300 μm의 AFM 팁 아래에 맞게 높은 600 μm의 사이에 있어야한다. </li><li> 단계 1.1.4에서 준비 아가로 오스 미디어의 영화로 정점을 밀어 넣습니다. 유리 슬라이드 / 아가로 오스의 위치를​​ 선택하고 분열 조직은 유리 슬라이드에 접촉 직접적이며, 아가로 오스에서 밖으로 돌출 부드럽게 등을 밀어 넣습니다. 그것은 줄기에서의 컷을 따라 몇 초 내에 아가로 오스의 분열 조직의 위치를​​ 매우 중요합니다. NOTE :이 건조로부터 분열을 방지하기 위해서이다. 이 단계에서, 분열 조직은 CRAC 서한다아가로 오스는 압력의인가시 골절 때문에 K. </li><li> 그들은 같은 높이의이고 하나의 슬라이드에 서로 미만 500 μm의 위치하도록 제공하고, 여러 분열 조직에게 일괄 이미징이 방법을 준비합니다. 추가 샘플을 해부하는 동안 습기 상자에 준비 분열 조직을 유지. 참고 : 교정에서 오는 변화를 제한합니다. 각 조건의 적 2 샘플을 준비하고 무작위로 측정 할 수있다. 지금까지 측정 (스트레스 유발 응답)에 배치 영상의 더 관찰 된 효과가 없습니다. 이 한천 및 / 또는 설치 솔루션 스트레스 신호 전달 분자의 희석에 대한 감사가 될 수 있습니다. 대안 적 스트레스 반응에 관계없이 제조 된 샘플의 양과 동일하다. </li><li> 다음 단계로 이동하기 전에 분열과 꽃 봉오리의 경계가 건조해야합니다. 그렇지 않으면, 완만하게 여과지를 사용하여 과잉의 물을 제거한다. 이것은 녹은 다음 단계에 방지해야아가로 인해 모세관 힘에 샘플을 홍수. </li><li> 20 μL 피펫으로 충분히 추가 단계 1.2.3에서 생성 된 균열을 채우기 위해 아가로 오스 장착 녹아있다. 각 분열 조직을 둘러싸. 아가로 오스가 제거 된 꽃 봉오리 (primordium)의 흉터의 수준에 도달해야한다. 이것을 달성하기 위해서는, 균열의 각 단부에 아가 로스를 첨가 할 필요가있을 수도있다. </li><li> 아가 로스를 첨가되면 신속 균열로 범람 할 것이다; 피펫을 사용하여, 분열 조직 슬라이드의 가장 높은 지점에 있는지 확인하는 아가로 오스 장착 용융의 일부를 빨아. 이 영상 중에 이동할 수 있도록이 분열을 해결합니다. </li></ol> 3. 설치 루트 또는 배축 샘플 <ol><li> 뿌리와 배축의 경우, 절개가 필요하지 않습니다. 제조 된 유리 슬라이드에 아가로 오스의 박막에서 직접 유리에 에칭 위 또는 유리의 얇은 판을 따라 하나 홈을합니다. 그것과 접촉하는 것을 보장이 홈에 루트 또는 배축을 놓고그것의 전체 길이를 따라 유리. </li><li> 다음 단계로 이동하기 전에 샘플 표면에 건조해야합니다. 그렇지 않으면, 완만하게 여과지를 사용하여 과량의 물을 제거한다. </li><li> 추가 단계 1.2.6에서와 같이 시료의 주위에 아가로 오스 장착 녹아있다. </li></ol> 4. AFM 준비 및 감도 교정 (JPK Nanowizard AFM 용) <ol><li> AFM의 캔틸레버를 탑재합니다. 캔틸레버는 둥근 모양 인 덴터에 장착해야합니다. 반경은 X, Y, Z의 해상도와 정확한 측정이 보관 될 수있는에 압입 깊이를 결정합니다. <ol><li> 표피의 표면에서 메조 나노 측정을 수행하려면, 50 nm의 반경 라운드 압자를 사용; , 중규모 측정을 0.5 μm의 반경 라운드 압자를 사용하는; (2 ~ 3 세포를 통해) 마이크로 측정을 위해, 2.5 μm의 반경 라운드 압자를 사용합니다. </li></ol></li><li> 캔틸레버의 끝에서 레이저의 위치. 중간에 레이저를 맞 춥니 다미러를 사용한 포획의. </li><li> AFM에서 깨끗한 유리를 배치합니다. NOTE : 다음은 캔틸레버의 변형에 AFM 수용체에 레이저의 위치 신호를 변환하도록 설정하고, 강제로 번역하기 위해, 캔틸레버의 스프링 정수를 평가하는 것이다. </li><li> 1 V.의 목표 힘 &quot;세트 포인트&quot;로 접근 </li><li> &quot;힘 분광&quot;를 선택합니다. 2 V에 최대 &quot;상대 세트 포인트&quot;를 설정하여 들여 쓰기를 수행, 40 μm의 / 초에 &quot;속도를 확장&quot;, 5 μm의 &quot;Z 길이&quot;. </li><li> &quot;교정 관리&quot;메뉴에서 &quot;적합 범위를 선택&quot;버튼을 사용하여 감도에 맞게 앞으로 곡선의 선형 부분을 선택합니다. &quot;상대 세트 포인트&quot;는 &quot;m&quot;에 &quot;볼트&quot;에서 변형되어야한다. </li><li> &quot;교정 관리&quot;메뉴에서 엘에게 평가하는 &quot;스프링 상수&quot;를 선택열적 변동을 이용하여 캔틸레버의 asticity. 캔틸레버의 스펙트럼 밀도 플롯을 얻기를 눌러 &quot;실행&quot;. 가장 낮은 주파수와 공진 피크를 찾을 수 있습니다. &quot;맞는 범위를 선택&quot;버튼을 사용하여 장착합니다. 주 1 :. 열 변동 조정에 대한 자세한 내용은 쿡 등 15 읽기 NOTE 2 : 이것은 (알려진 또는 강성 소재) 참조 캔틸레버를 이용하여 캔틸레버의 탄성을 평가하는 직접적인 방법을 사용하는 것이 바람직하다. 여기에 사용 된 하나 친절하게 테프 Asnacios (16)에 의해 기증되었다. </li><li> 캔틸레버 끝에서 10 % 만니톨 용액 200 μl를 추가합니다. 미러를 사용한 포획의 중앙에 레이저를 재조정. </li><li> 감도를 재 보정 : &quot;교정 관리&quot;메뉴에서, &quot;알 수없는&quot;버튼을 클릭; 반복 2.5을 통해 2.3 단계를 반복합니다. </li></ol> . 5 데이터 수집 : 명백한 영률지도 제작 <ol&gt; <li> AFM 아래에 장착 된 샘플의 위치를​​ 샘플에 10 % 만니톨 용액 500 μL 방울을 추가합니다. 만니톨 용액 분 이내에 세포를 plasmolyzes. </li><li> 20 윈의 목표 힘 ( &quot;지점을 설정&quot;)에 접근 ( &quot;설정 포인트는&quot;3 개 이상 V이어야한다) </li><li> 200 윈의 &quot;상대 세트 포인트&quot;와 들여 쓰기, 40 μm의 / 초 &quot;속도를 확장&quot;, 5 ㎛, &quot;Z 길이&quot;. </li><li> 캔틸레버 또는 1 μm의 / 5 μm의 장착 캔틸레버 0.5 μm의 장착 뉴 멕시코 200 100 ㎚의 들여 쓰기를 얻기 위해 &quot;상대 설정치를&quot;조정합니다. </li><li> , 분열 조직을 위해, 해상도 64 X 64 ( &quot;픽셀&quot;)와 70 μm의 X 70 μm의 &quot;힘 매핑&quot;모드에서 스캔 할 영역을 선택 배축과 뿌리, 64 X 64의 해상도와 100 μm의 × 100 μm의. </li><li> 를 눌러 실험을 시작하기 위해 검사합니다. 출력을 저장합니다. </리&gt; </ol> . 6 데이​​터 분석 : 명백한 영의 계수 계산 <ol><li> 데이터 분석 소프트웨어로 데이터 파일을 연다. </li><li> 단일 맵의 모든 곡선에 같은 분석을 적용하는 &quot;일괄 처리&quot;를 선택합니다. </li><li> 그래서 압입 깊이를 추출하는 &quot;캔틸레버의 휨의 높이를 수정&quot;을 선택합니다. </li><li> 힘이 들여 쓰기의 영역에 비례 가정합니다 &quot;탄성 계수 맞는 기능&quot;을 선택합니다. 들여 쓰기 형태가 포물선이라고 가정 할 포물선하기 위해 &quot;팁 모양&quot;을 설정합니다. </li><li> 팁의 반경을 나타냅니다. </li><li> 는 &quot;확장&quot;곡선보다 지형에 덜 민감하기 때문에 우선적으로 분석을위한 &quot;후퇴&quot;커브를 선택합니다. 프로브의 중요한 고집이 동안이 경우, &quot;후퇴&quot;고집에 민감하다 &quot;확장&quot;곡선을 사용합니다. </li><li> 세트0.5 포아송 비. 눌러에서 분석하고 결과를 저장합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+in+vitro+extensibility+of+growing+plant+cell+walls.">Measuring in vitro extensibility of growing plant cell walls.</a> Methods in molecular biology. 715, 291-303 (2011).</li><li>Durachko, D. M., Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+plant+cell+wall+extension+(creep)+induced+by+acidic+pH+and+by+alpha-expansin.">Measuring plant cell wall extension (creep) induced by acidic pH and by alpha-expansin.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , 1263 (2009).</li><li>Durachko, D. a. n. i. e. l. M., C, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Plant+Cell+Wall+Extension+(Creep)+Induced+by+Acidic+pH+and+by+Alpha-Expansin.">Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin.</a> J. Vis. Exp.. , 25 (2009).</li><li>Suslov, D., Verbelen, J. P., Vissenberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onion+epidermis+as+a+new+model+to+study+the+control+of+growth+anisotropy+in+higher+plants.">Onion epidermis as a new model to study the control of growth anisotropy in higher plants.</a> Journal of experimental botany. 60, 4175-4187 (2009).</li><li>Parre, E., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pectin+and+the+role+of+the+physical+properties+of+the+cell+wall+in+pollen+tube+growth+of+Solanum+chacoense.">Pectin and the role of the physical properties of the cell wall in pollen tube growth of Solanum chacoense.</a> Planta. 220, 582-592 (2005).</li><li>Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+growth+in+pollen+tubes+is+associated+with+spatially+confined+dynamic+changes+in+cell+mechanical+properties.">Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties.</a> Developmental biology. 334, 437-446 (2009).</li><li>Radotic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+stiffness+tomography+on+living+Arabidopsis+thaliana+cells+reveals+the+mechanical+properties+of+surface+and+deep+cell-wall+layers+during+growth.">Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth.</a> Biophysical journal. 103, 386-394 (2012).</li><li>Milani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+local+wall+stiffness+at+the+shoot+apical+meristem+in+Arabidopsis+using+atomic+force+microscopy.">In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 67, 1116-1123 (2011).</li><li>Peaucelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pectin-induced+changes+in+cell+wall+mechanics+underlie+organ+initiation+in+Arabidopsis.">Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis.</a> Current biology : CB. 21, 1720-1726 (2011).</li><li>Braybrook, S. A., Hofte, H., Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+mechanical+contributions+of+the+pectin+matrix:+Insights+for+cell+growth.">Probing the mechanical contributions of the pectin matrix: Insights for cell growth.</a> Plant signaling &amp; behavior. 7, 1037-1041 (2012).</li><li>Routier-Kierzkowska, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+force+microscopy+for+in+vivo+measurements+of+plant+tissue+mechanics.">Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics.</a> Plant physiology. 158, 1514-1522 (2012).</li><li>Agudelo, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TipChip:+a+modular,+MEMS-based+platform+for+experimentation+and+phenotyping+of+tip-growing+cells.">TipChip: a modular, MEMS-based platform for experimentation and phenotyping of tip-growing cells.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 1057-1068 (2013).</li><li>Miedes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xyloglucan+endotransglucosylase/hydrolase+(XTH)+overexpression+affects+growth+and+cell+wall+mechanics+in+etiolated+Arabidopsis+hypocotyls.">Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase (XTH) overexpression affects growth and cell wall mechanics in etiolated Arabidopsis hypocotyls.</a> Journal of experimental botany. 64, 2481-2497 (2013).</li><li>Byrne, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+leaves1+mediates+leaf+patterning+and+stem+cell+function+in+Arabidopsis.">Asymmetric leaves1 mediates leaf patterning and stem cell function in Arabidopsis.</a> Nature. 408, 967-971 (2000).</li><li>Cook, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+implementation+of+dynamic+methods+for+measuring+atomic+force+microscope+cantilever+spring+constants.">Practical implementation of dynamic methods for measuring atomic force microscope cantilever spring constants.</a> Nanotechnology. 17, 20135-22145 (2006).</li><li>Desprat, N., Richert, A., Simeon, J., Asnacios, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creep+function+of+a+single+living+cell.">Creep function of a single living cell.</a> Biophysical journal. 88, 2224-2233 (2005).</li><li>Peaucelle, A., Braybrook, S., Hofte, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+mechanics+and+growth+control+in+plants:+the+role+of+pectins+revisited.">Cell wall mechanics and growth control in plants: the role of pectins revisited.</a> Frontiers in plant science. 3, 121 (2012).</li><li>Mittler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+signaling:+the+new+wave.">ROS signaling: the new wave.</a> Trends in plant science. 16, 300-309 (2011).</li><li>Braybrook, S. A., Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechano-chemical+aspects+of+organ+formation+in+Arabidopsis+thaliana:+the+relationship+between+auxin+and+pectin.">Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin.</a> PLoS. 8, e57813 (2013).</li><li>Asnacios, A., Hamant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanics+behind+cell+polarity.">The mechanics behind cell polarity.</a> Trends in cell biology. 22, 584-591 (2012).</li><li>Meister, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FluidFM:+combining+atomic+force+microscopy+and+nanofluidics+in+a+universal+liquid+delivery+system+for+single+cell+applications+and+beyond.">FluidFM: combining atomic force microscopy and nanofluidics in a universal liquid delivery system for single cell applications and beyond.</a> Nano letters. 9, 2501-2507 (2009).</li><li>Lintilhac, P. M., Wei, C., Tanguay, J. J., Outwater, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ball+tonometry:+a+rapid,+nondestructive+method+for+measuring+cell+turgor+pressure+in+thin-walled+plant+cells.">Ball tonometry: a rapid, nondestructive method for measuring cell turgor pressure in thin-walled plant cells.</a> Journal of plant growth regulation. 19, 90-97 (2000).</li><li>Kroeger, J. H., Zerzour, R., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulator+or+driving+force?+The+role+of+turgor+pressure+in+oscillatory+plant+cell+growth.">Regulator or driving force? The role of turgor pressure in oscillatory plant cell growth.</a> PloS one. 6, e18549 (2011).</li><li>Forouzesh, E., Goel, A., Mackenzie, S. A., Turner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+extraction+of+Arabidopsis+cell+turgor+pressure+using+nanoindentation+in+conjunction+with+finite+element+modeling.">In vivo extraction of Arabidopsis cell turgor pressure using nanoindentation in conjunction with finite element modeling.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 509-520 (2013).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

식물에서, 기계적 특성 변화는 성장 및 형태 형성을 연출에서 중요한 역할을한다. 현재까지이 식물 성장을 제어하는​​ 유전 및 화학 네트워크를 이루는에 큰 진전되고 있지만, 이러한 네트워크에 기여하고 기계적 특성의 변화에​​ 의해 영향을받는 방법에 대한 우리의 지식은 초보했다. 이 방법은이 공백을 채울 할 수있게해야하고, 그래서 식물의 성장이나 형태 형성의 모든 측면을 연구 과학자에 강한 관심을 끌 수있을 것입니다. 우리는 지금 문제 및 제한 방법, 그리고 미래의 전망을 요약합니다. 프로토콜에서 가장 어려운 단계는 샘플 준비입니다. 이 샘플은 단단히 아가로 오스와 유리 슬라이드에 고정해야하지만,이 아가 로스를 측정 할 수있는 샘플의 모든 영역을 커버하지 않아야합니다. 미묘 건조를 방지하기 위하여 조직의 손상을 방지하기 위해 한층 제제 (분 이내) 충분히 빠르게 완료 할 수있다 : 부상차 가뭄은 셀 벽 (18)의 기계적 특성에 돌이킬 수없는 변화로 이어질 것으로 예상된다. 또 다른 도전 단계는 올바른 AFM 마이크로 들여 쓰기 설정을 선택하는 것입니다 : 과학적 질문에 따라, 조직, 세포, 또는 세포 내 해상도가 다른 압자와 압입 깊이를 달성 할 수있다. 자세한 내용은 9, 10을 참조하십시오. 이 방법은 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째,이 방법은 장기의 표면에 기계적 성질을 측정 제한된다; 절제된 장기의 내부 영역을 측정하기위한 프로토콜을 개발하려는 시도가 우리 실험실에서 진행되고있다. 둘째, 높은 변수 지형 차별화 된 조직은 측정하기가 매우 어렵습니다; 예를 들어, 상체 (trichome)는 잎의 표피에 AFM 팁의 액세스를 차단하고 줄기와 유사하게, 루트 머리카락 뿌리 표피에 AFM 팁의 액세스를 차단합니다. 셋째, 방법이 가장 좋은 길이 100 μm의 르의 샘플에 적용된다SS; 그것은 최대 1mm까지 큰 샘플들에 사용될 수 있지만, (도 1D 및 1E에 도시 된 바와 같이)이 시간 소모적 순차 제작법 측정을 필요로한다. 마지막으로, AFM 측정 세포벽의 기계적 복잡성의 일부만 : 셀 벽이 변형의 유형 (압축 VS 예 장력)에 따라 서로 다른 기계적 특성을 보여줄 수 복잡한 겔이다하면서, 압축 압입 실험에 한한다. 처음에는 압축에 제한이 방법은 프로세스를 스트레칭 turgor 유래 세포 벽, 이는 성장에 알리기 위해 비 또는 원격으로 할 수있는 것 같다. 그러나 분열 9, 19 또는 배축 (게시되지 않은 데이터)에 대한 우리 자신의 초대형 측정에 명백한 젊은 계수 및 성장을 통해 측정 된 탄성 사이의 놀라운 상관 관계를 나타냅니다. 우리는 미래에이 기술의 개발이 수수께끼를 이해하는 데 도움이되기를 바랍니다. 방법은 위에서 설명한대로 만, 식물 조직의 탄성 기계적 특성의 특정 측면을 측정 여기에 제시된. 그러나 조직 생활도 viscously 행동과 결합 된 점성과 탄성 거동은 성장과 발전 16,20 중요 할 것으로 예상된다. 지금까지 언급되지 않은, 우리는 시간에 따라 수십 초 이상했다 마이크로 들여 쓰기 AFM하는 세포 벽의 반응을 관찰 -이 응답은 점탄성 특징으로했다. 우리의 이전 연구에서 우리는이 점탄성 응답 9를 평가하는 하나의 AFM 방법을 제시했다. 조직의 또 다른 중요한 성장 매개 시설은 세포의 지방 팽압입니다. 팽압을 측정하기 위해, 우리는 유사한 도전에 직면 : 조직에서 중규모 해상도로 측정하는 기술은 아직 존재하지 않습니다. 식물에 사용되는 압력 microprobes은 분열 세포의 사이즈 (5 μM) (12), (21) 인 유리 팁 반경에 의해 한정되는, 최근까지,되었습니다. 다른연구의 매우 유망한 수단이 아닌 plasmolyzed 조직에서 사용하기 위해이 AFM 방법을 개발하는 것입니다; 우리는 단일 세포 팽압 및 조직의 성장 사이의 관계를 나타 내기 위해, 이러한 방식으로, 희망한다. (24) -이 방법은 기본적으로 다른 장치를 사용하여 개별 셀 (22)에 사용되는 들여 쓰기를 통해 이미 개발 AFM의 turgor 측정에 적용됩니다.

식물의 성장은 유기체의 각각의 셀을 둘러싸 강성 세포벽 코디 팽창에 의해 달성된다. 증거를 축적하는 것은 식물이 로컬이 확장을 제어하는​​ 세포 벽 화학의 변경을 나타냅니다. 팽창은 셀의 높은 팽압 기인 셀벽에 변형에 의해 주로 구동되는 것으로 생각된다; 팽압이 변형 응답은 셀 벽 (1)의 기계적 특성에 의해 지배된다. 약간은 이러한 기계적 특성으로 알려져 있으며, 그들이 개발하는 동안 변경하는 방법. 더욱이 작은 이러한 기계적 특성은 피드백 명백하게 조직에 걸쳐 조정되는 방식으로 셀 벽 화학을 변경할지 여부를 올릴 제어되는 방법으로 알려져있다. 우리는 화학 및 기계적 개발 중에 식물 세포벽의 변화, 그리고 궁극적으로 이러한 방법에 미세한 상호 작용을 제어하는​​ 발전소 사이의 연결을 이해하는 경우에의 거시적 성장, 세포 또는 조직 규모로 장기를 개발하는 셀 벽의 기계적 특성을 모니터링 할 방법이 요구된다. 원자 힘 현미경 (AFM) 방법은 마이크로 미터 또는 나노 미터 티슈 압박 또는 만입 부에 기초하는, 기재, 세포 이하의 해상도에서 동시에 장기를 개발하고 조직의 전 영역에 걸쳐 세포 벽의 기계적 성질을 측정하기 위해 정밀하게 개발되었다. 다른 방법이 하나 너무 낮거나 너무 높은 해상도 : 신율은 밀리미터 규모 2-4, 초기 이벤트를 측정하기에 너무 큰 예를 들어 인 규모로 전체 조직의 평균 기계적 특성을 측정하기 만 할 수있다 기관 형성; microindenter는 나노 미터 스케일에서 세포 이하의 해상도로 측정 할 수 있지만, 고립 된 세포가 아닌 세포 또는 장기 5-7의 그룹을 측정으로 제한됩니다. AFM으로는 필요D 조직, 세포 및 세포 이하의 해상도는 8 ~ 10을 달성 할 수있다. 최근 여러 프로토콜도 11, 12을 사용할 수 식물 조직의 역학을 측정하기 위해 특별히 개발되었다. 우리는 명백 영률 (13)의 측정을 통해 조직의 탄성을 평가하는 방법을 여기에 제시한다. 영 모듈러스는 일반적으로 재료의 강성을 설명하는 데 사용된다. 작은 변형 중에 재료를 변형 시키는데 필요한 힘은 압입의 면적에 비례한다. 젊은 계수이 계수이다. 연속 균질 재료의 경우에는 동일 계수에 관계없이 압입 타입 (크기 및 형상)의 측정되지만 둘레의 속도로 변화 할 것이다. 식물 조직의 복잡한 구조의 경우에, 우리는 지금까지 힘이 판단을 허용하는 변형에 비례한다는 관찰우리가 &quot;명백한 젊은 계수&quot;의 이름을 비례 계수. 식물의 연속 MEDIAS에서 대조적으로,이 명백한 젊은 계수는 들여 쓰기의 크기에 민감합니다. 그것은 순수 세포벽의 젊은 계수에 대응하지 않는다. 그것은 최고의 조직의 세포 벽의 발판의 신축성을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>AFM</td><td>JPK</td><td>NanoWizard</td><td>All the 3-generation are able to do the work with the same preferment.</td></tr><tr><td>AFM stage</td><td>JPK</td><td>CellHesion</td><td>Required for sample with low topography (less than 11 &amp;micro;m between the lowest and the highest point in the area of force scanning).</td></tr><tr><td>AFM optics</td><td>JPK</td><td>Top View Optics</td><td>Very important in order to position the sample. Could be replaced by long range binoculars or a microscope.</td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Leica</td><td>M125</td><td>Any type of stereo microscope could do.</td></tr><tr><td>150 nm mounted cantilever</td><td>Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland</td><td>R150-NCL-10</td><td>To measure only the cell wall at the surface of the epidermis use.</td></tr><tr><td>1 &amp;micro;m mounted cantilever</td><td>Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland</td><td>SD-Sphere-NCH-S-10</td><td>To measure the mechanics of the cell wall orthogonal to the surface of the epidermis.</td></tr><tr><td>Tipless cantilever</td><td>Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland</td><td>TL-NCH-20</td><td>To measure the local mechanics of the tissue (2-3 cell wide) use a 5 &amp;micro;m mounted cantilever. We attached a 5 &amp;micro;m borosilicate bead to a tipless cantilever.</td></tr><tr><td>5 &amp;micro;m silicon microspheres</td><td>Corpuscular</td><td>C-SIO-5</td><td></td></tr><tr><td>Araldite</td><td>Bartik S.A. 77170 Coubet, France</td><td></td><td>Araldite for fixing the bead to the tipless cantilever.</td></tr><tr><td>Low melting agarose</td><td>Fisher Scientific Fair Lawn, New Jersey 07410</td><td>BP160-100</td><td>34-45 &amp;#176;C gelation temperature</td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 USA</td><td>M4125-500G</td><td></td></tr><tr><td>2 Stainless Steel No. 5 Tweezers</td><td>Ideal-Tek 6828 Balerna, Switzerland&amp;nbsp;</td><td>951199</td><td></td></tr></tbody></table>

afm-based mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions

우리는 JPK AFM 위해, 원자 힘 현미경 (AFM)의 마이크로 / 나노 만입를 사용 식물 조직의 표면의 기계적 성질을 측정하기 위해 최근 개발 된 방법을 서술. 특히,이 프로토콜에서 우리는 꽃 분열 조직, 배축, 뿌리의 × 100 μm의 최대 100 μM의 지역에 걸쳐 세포 내 해상도에서 세포벽의 겉보기 탄성 계수를 측정한다. 이 샘플의주의 준비, 마이크로 압자 및 압입 깊이의 올바른 선택이 필요합니다. 단, 측정 셀 plasmolyze 따라서 세포 팽압의 기여를 제거하기 위해 만니톨의 고농도 용액으로 수행되어 세포벽 특성을 고려하여. 다른 현존하는 기술과 대조적으로, 다른 덴터 및 압입 깊이를 사용함으로써,이 방법은, 동시 다중 스케일의 측정을 허용 <em&gt; 세포 이하의 해상도에서와 조직을 포함하는 수백 개의 셀에 걸쳐 즉. 이 때문에 공간적, 시간적으로 성장 및 분화와 상관되는 이러한 변경을 가능하게 개발 중에 셀 벽의 기계적 특성에서 일어나는 변화를 특성화하는 것이 가능하다는 것을 의미. 이 조정 미세한 세포 변화가 거시적 인 형태 발생 이벤트를 가져올 방법을 이해하는 중요한 단계를 나타냅니다. 그러나, 몇 가지 제한 사항이 남아 있습니다 방법은 (직경 100 μm의 정도) 만 외부 조직에 매우 작은 샘플을 사용할 수 있습니다; 이 방법은 조직의 지형에 민감하다; 그것은 조직의 복잡한 기계적 특성의 특정 측면을 측정합니다. 기술이 급속도로 개발되고 있으며 이러한 제한의 가장 가까운 미래에 해결 될 가능성이있다.

그림 1에서 우리는 꽃 분열 조직의 전형적인 젊은 계수 맵 (그림 1A 및 1B), 젊은이와 노인 배축 (그림 1C-F), 및 루트 분열 조직 (그림 1G 및 1H)를 제시. 모든 실험에서 압자는 반구형이지만, 다른 공간 해상도를 달성 할 수 있도록 그 반경이 다른 1C 및 1D는 메조 나노 압입 (50 nm의 깊이)과 메조 나노 인 덴터 (50 nm의 반경)에 대한 전형적인 결과를 보여준다.; . cartographs이 배축 표피 세포의 표면 세포 벽에있는 마이크로 이질성을 공개 1A, 1E, 그리고 1G 피규어 꽃 분열 조직, 배축 및 루트 중규모 톱니 (500 nm의 깊이)와 중규모 압자 (500 nm의 반경)에 대한 일반적인 결과를 보여줍니다; 압자 반경이 메소 압입 평가하는 칸막이 벽의 직경을 초과하기 때문에을주지배사 세포벽의 &#39;명백한&#39;젊은 계수는 (Peaucelle 등. 9,17 및 자세한 내용은 브레이브 룩 등. 10 참조). 마지막으로, 그림 1B는 중규모 톱니 (500 nm의 깊이)와 마이크로 압자 (2.5 μm의 반경)에 대한 cartograph을 보여줍니다; 흥미롭게도,이 해상도의 영상은 9 눈에 띄는 성장을 앞에 기관 개시시 조직 연화을 공개했다. 현재 하이라이트 식물 기관을 개발하여, 물성을 측정 AFM을 사용할 때 일반적으로 발생하는 네 기술적 인 어려움에 부분적 해결책을 제안한다. 첫째, 샘플이 잘못 아가로 오스에 박혀 될 수있다 : 아가로 오스로 덮여 영역이 제대로 (그림 1E 화살표의 가장자리를 참조)을 측정 할 수 없습니다. 이 문제를 해결하려면 단계 1.2.6을 반복하려고합니다. 둘째, 잘못 유리 슬라이드에 고정되는 샘플은 실험하는 동안 이동할 수있다; 다음 탈선 줄무늬는 이미지에 표시 ...에 기인하는왼쪽과 오른쪽 전진 스캔 (그림 1 층) 사이에 역 상관합니다. 이 문제를 해결하려면, 샘플 준비를 반복주의​​ 깊게보십시오. 셋째, 시료의 높이의 Z 범위는 특정 임계 값 미만이어야합니다. 이 수직 Z 방향 시료의 평균 높이에 대한 제한은 없지만, Z 방향 (최고 및 최저 지점 간의 거리)의 높이 범위 미만 15 μM이어야하며, 그렇지 않으면 스캔이 중단 될 것이다 (참조 그림 1B, 설정) AFM의 nanowizard에 있습니다. 스캔하는 동안, AFM 자동 시료의 높이와 일치하도록 캔틸레버의 높이를 조정하지만, 단일 스캔으로 캔틸레버의 높이가 15 μM에 따라 다를 수 있기 때문이다. 이 문제를 해결하려면, 그림 1E-G에서와 같이, 100 μm의 Z-범위를 증가 JPK의 cellHesion 모듈을 사용합니다. 넷째,이 방법은 표면 지형에 민감한 : 시료 표면 더 오리 엔테입니다들여 쓰기의 방향에 D 평행 측정 덜 믿을 수있는. 도 1G-H로 표시 루트 샘플에서 세포벽이 뿌리의 장축에 평행 한 스캔의 상하 가장자리에서 보이지 않는다 : 여기서 루트면은 작게 압입에 직교되는 것이다. 분열 조직에서 유사하게, 꽃 봉오리 가장자리의 세포 벽이 제대로 (그림 1A)를 측정되지 않았다. 메조 나노 압입 (그림 1C)의 경우, 다시 지형 효과는 관찰 : 세포의 가장자리를 잘못 소프트 정확하게 것으로 측정되는 곳에 떨어져 캔틸레버의 평면에서 세포 곡선. 이러한 지형 효과를 설명 할 수있는 데이터 분석 도구는 앞으로이 이슈를 해결할 수 있지만, 이러한 도구는 아직 사용할 수 없습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/51317/51317fig1highres.jpg" /> <strong&gt; 그림 1. 애기 장대의 plasmolyzed 개발 기관에 대한 일반적인 AFM 젊은 계수 측정. (A, B) 꽃 분열 조직, (CF) 어두운 성장 배축 (G, H) 루트 분열 조직. (A, E, F, G, H ) 중규모에서 배사 세포벽의 영 모듈러스를 측정하고 0.5 ㎛의 반경의 구형 팁을 가진 캔틸레버를 이용하여 이미징. (B) 2.5 ㎛의 반경의 구형 팁을 가진 캔틸레버를 이용하여 측정 꽃 분열 조직은, tissular &#39;명백한&#39;의 감소를 보여준다 미래의 장기의 위치에서 젊은 계수는 화살표를 참조하십시오. (C, D) 50 나노 미터 반경 구형 팁 캔틸레버를 이용하여 측정 어두운 성장 배축의 표면 세포벽 젊은 계수의 세포 이하의 해상도. (B) 검사 낙태로 인해 AFM의 최대 Z-범위를 초과하는 시료 높이의 범위. (F) 모호한 검사는 동안 샘플 운동으로 인한부적당 고정으로 실험. (E) 스캔 아가의 박막 시료의 상단에 (화살표). 스케일 바 (AC, EH) 10 ㎛, (D) 1 μm의. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51317/51317fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions at JoVE.com

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

셀 벽의 탄성 특성의 AFM 기반의 매핑 : 조직, 세포 및 세포 이하의 해상도에서

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

afm-based-mapping-elastic-properties-cell-walls-at-tissue-cellular

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

12.9K 조회수.  Université Paris Diderot. We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

비디오: AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

원자 힘 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 기계적 특성을 측정

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

연구

생체공학

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.

A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.

기계 스트레치 동안 라이브 세포 이미징

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues

We present here the use of atomic force microscopy to indent plant tissues and recover its mechanical properties. Using two different microscopes in indentation mode, we show how to measure an elastic modulus and use it to evaluate cell wall mechanical properties. In addition, we also explain how to evaluate turgor pressure. The main advantages of atomic force microscopy are that it is non-invasive, relatively rapid (5~20 min), and that virtually any type of living plant tissue that is superficially flat can be analyzed without the need for treatment. The resolution can be very good, depending on the tip size and on the number of measurements per unit area. One limitation of this method is that it only gives direct access to the superficial cell layer.

Here, we present atomic force microscopy (AFM), operated as a nano- and micro-indentation tool on cells and tissues. The instrument allows the simultaneous acquisition of 3D surface topography of the sample and its mechanical properties, including cell wall Young's modulus as well as turgor pressure.

식물 세포 및 식물 조직의 기계적 특성 및 터거 압력을 측정하기 위해 원자력 현미경 검사법 사용

We present here the use of atomic force microscopy to indent plant tissues and recover its mechanical properties. Using two different microscopes in ...

발생학

Atomic Force Microscopy Cantilever-Based Nanoindentation: Mechanical Property Measurements at the Nanoscale in Air and Fluid

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by the probe tip and its contact area with the sample can be quantified, it is possible to determine the nanoscale mechanical properties (e.g., elastic or Young&#39;s modulus) of the surface being probed. A detailed procedure for performing quantitative AFM cantilever-based nanoindentation experiments is provided here, with representative examples of how the technique can be applied to determine the elastic moduli of a wide variety of sample types, ranging from kPa to GPa. These include live mesenchymal stem cells (MSCs) and nuclei in physiological buffer, resin-embedded dehydrated loblolly pine cross-sections, and Bakken shales of varying composition.
Additionally, AFM cantilever-based nanoindentation is used to probe the rupture strength (i.e., breakthrough force) of phospholipid bilayers. Important practical considerations such as method choice and development, probe selection and calibration, region of interest identification, sample heterogeneity, feature size and aspect ratio, tip wear, surface roughness, and data analysis and measurement statistics are discussed to aid proper implementation of the technique. Finally, co-localization of AFM-derived nanomechanical maps with electron microscopy techniques that provide additional information regarding elemental composition is demonstrated.

Quantifying the contact area and force applied by an atomic force microscope (AFM) probe tip to a sample surface enables nanoscale mechanical property determination. Best practices to implement AFM cantilever-based nanoindentation in air or fluid on soft and hard samples to measure elastic modulus or other nanomechanical properties are discussed.

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by ...

공학

Atomic Force Microscopy to Study the Physical Properties of Epidermal Cells of Live Arabidopsis Roots

A method is described here to characterize the physical properties of the cell wall of epidermal cells of living Arabidopsis roots through nanoindentations with an atomic force microscope (AFM) coupled with an optical inverted fluorescence microscope. The method consists of applying controlled forces to the sample while measuring its deformation, allowing quantifying parameters such as the apparent Young's modulus of cell walls at subcellular resolutions. It requires a careful mechanical immobilization of the sample and correct selection of indenters and indentation depths. Although it can be used only in external tissues, this method allows characterizing mechanical changes in plant cell walls during development and enables the correlation of these microscopic changes with the growth of an entire organ.

Atomic Force Microscopy to Study the Physical Properties of Epidermal Cells of Live Arabidopsis Roots

The atomic force microscopy indentation protocol offers the possibility to dissect the role of the physical properties of the cell wall of a particular cell of a tissue or organ during normal or constrained growth (i.e., under water deficit).

살아있는 애기장대 뿌리의 표피 세포의 물리적 특성을 연구하기 위한 원자력 현미경

A method is described here to characterize the physical properties of the cell wall of epidermal cells of living Arabidopsis roots through ...

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record forces curves on 1000 cells in 4 hours automatically. To maintain a 4 hour analysis time, the number of force curves per cell is reduced to 9 or 16. The method combines a Jython based program and a strategy for assembling cells on defined patterns. The program, implemented on a commercial Bio-AFM, can center the tip on the first cell of the array and then move, automatically, from cell to cell while recording force curves on each cell. Using this methodology, it is possible to access the biophysical parameters of the cells such as their rigidity, their adhesive properties, etc. With the automation and the large number of cells analyzed, one can access the behavior of the cell population. This is a breakthrough in the Bio-AFM field where data have, so far, been recorded on only a few tens of cells.

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

This protocol aims to automate AFM measurements on hundreds of microbial cells. First, microbes are immobilized into PDMS stamp microstructures and then force spectroscopy measurements are performed automatically on hundreds of immobilized cells.

수백 개의 알비칸스 세포에 대한 생체 원자력 현미경 측정 자동화

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells

Techniques available for micro- and nano-scale mechanical characterization have exploded in the last few decades. From further development of the scanning and transmission electron microscope, to the invention of atomic force microscopy, and advances in fluorescent imaging, there have been substantial gains in technologies that enable the study of small materials. Conpokal is a portmanteau that combines confocal microscopy with atomic force microscopy (AFM), where a probe &#8220;pokes&#8221; the surface. Although each technique is extremely effective for the qualitative and/or quantitative image collection on their own, Conpokal provides the capability to test with blended fluorescence imaging and mechanical characterization. Designed for near simultaneous confocal imaging and atomic force probing, Conpokal facilitates experimentation on live microbiological samples. The added insight from paired instrumentation provides co-localization of measured mechanical properties (e.g., elastic modulus, adhesion, surface roughness) by AFM with subcellular components or activity observable through confocal microscopy. This work provides a step by step protocol for the operation of laser scanning confocal and atomic force microscopy, simultaneously, to achieve same cell, same region, confocal imaging, and mechanical characterization.

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy Conpokal on Live Cells

Presented here is the protocol of the Conpokal technique, which combines confocal and atomic force microscopy into a single instrument platform. Conpokal provides same cell, same region, near simultaneous confocal imaging and mechanical characterization of live biological samples.

라이브 셀에서 동시 레이저 스캐닝 공초점 및 원자력 현미경 검사(Conpokal) 근처

Techniques available for micro- and nano-scale mechanical characterization have exploded in the last few decades. From further development of the scanning ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

에서 결정 셀룰로오스 축적의 높은 해상도 정량<em&gt; 애기 장대</em&gt; 뿌리 조직 특이 세포 벽 수정을 모니터링하는

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

생물학

Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two decades ago and since then continues to contribute greatly to our understanding of the filamentous fungal lifestyle. This paper provides a practical guide for the utilization of the two membrane dyes FM 1-43 and FM 4-64 and the four cell wall stains Calcofluor White M2R, Solophenyl Flavine 7GFE 500, Pontamine Fast Scarlet 48 and Congo Red. The focus is on their low-dose application to ascertain artefact-free staining, their co-imaging properties, and their quantitative evaluation. The presented methods are applicable to all filamentous fungal samples that can be prepared in the described ways. The fundamental staining approaches can serve as starting points for adaptations to species that might require different cultivation conditions. First, biophysical and biochemical properties are reviewed as their understanding is essential for using these dyes as truly vital fluorescent stains. Secondly, step-by-step protocols are presented that detail the preparation of various fungal sample types for fluorescent live-cell imaging. Finally, example experiments illustrate different approaches to: (1) identify defects in the spatio-temporal organization of endocytosis in genetic mutants, (2) comparatively characterize shared and distinct co-localization of GFP-labeled target proteins in the endocytic pathway, (3) identify morphogenetic cell wall defects in a genetic mutant, and (4) monitor cell wall biogenesis in real time.

Vital fluorescent dyes are essential tools for live-cell imaging analyses in modern fungal cell biology. This paper details the application of established and lesser-known fluorescent dyes for tracking plasma membrane dynamics, endo-/exocytosis and cell wall morphogenesis in filamentous fungi.

필라멘트 곰팡이의 살아있는 세포 이미징을 위한 막 및 세포벽 선택적 형광 염료의 적용

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two ...