우리는 NIH (상 번호 MKL에 R00 NS072192, 까악 까악로 AS.L.에 HD029178, 2 RO1 NS032457)의 지원에 감사합니다. MKL은 어린이 병원 보스턴의 경력 개발 친목 / 하버드 의과 대학의 쇼어 친목과 알프레드 P. 슬로안 재단의 연구원의 수상자이다. 까악 까악는 하워드 휴즈 의학 연구소의 탐정입니다.

1. 배아 절연 / 준비 이 기술은 마우스 또는 쥐 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 CSF 수집 기술 및 마우스 배아의 뇌와 대뇌 피질 explant의 절개를 보여줍니다. 우리는 쥐 대 일반 기술 내에 존재 마우스의 중요한 차이점에 대해 언급합니다. 태아 연령 준비 시스템, E1은 쥐의 플러그 당일로 분류하고 있으며, E0.5는 마우스의 플러그 당일로 분류되어 있습니다. <ol><li> Sylgard 실리콘 탄성체와 마이크로 분해 요리를 준비합니다. Sylgard 184 실리콘 탄성체는 A와 파트 B. 부품은 A와 파트 B는 무게 나 부피 10시 1분 비율 혼합되어 두 부분 액체 구성 요소 부분으로 제공됩니다. 액체 구성 요소가 혼합 한 후, 음식의 전체 표면을 충당하기 위해 페트리 접시에 sylgard 탄성체를 따르다. 일부 기포가 경화 과정에서 사라지고 존재 할 수 있습니다. 에 페트리 접시 뚜껑을 놓고 elastom 수응급실은 치료가 있습니다. 엘라스토머는 24 시간 동안 실온에서 치유하거나, 빠른 경화 높은 온도 (예 : 37 ° C)에서. 할 수 있습니다 액체 구성 요소가 더욱 강화되면, 분해 요리 사용할 수 있습니다. 요리는이 절차에 따라 잘 청소되어 제공 여러 실험 반복적으로 사용할 수 있습니다. </li><li> 마이크로 모세관 피펫 (바늘)의 준비. 마이크로 모세관 피펫은 열을 적용하여 준비하고 다음 설정을 사용하여 Narishige PC-10 수직 micropipette의 풀러를 사용 당겨됩니다 : 한 단계 끌어 오기를, 히터 # 2 58로 설정, 100g의 풀다운 무게. micropipette의 고급 팁 신중하게 잘 # 55 포셉을 사용하여 해제 부러 있습니다. 바늘의 결과 평균 내경 85 μm이다. </li><li> CSF의 흡인에 대한 흡인기 어셈블리를 준비합니다. 마이크로 플런저는 모세관 바늘로 마이크로 모세관 피펫와 함께 제공 넣습니다. 또는 t를 연결되어있는 흡인기 튜브 조립체의 끝 부분에 플라스틱 일회용 필터를 부착마이크로 모세관 피펫을 O. 흡인기 조립체의 반대편에 위치에 가스켓을 통해 바늘을 밀어. </li><li> 쓰레기에서 Sylgard로 만든 마이크로 해부 접시에 절연 배아를 전송합니다. </li><li> 배아는 명확하게 노출되어 있도록 특별히 배아 멤브레인 및 조직을 제거합니다. 각 조직 레이어 먼저 자궁 벽과 다음 decidua가 - 수 고급 iridectomy 가위 (예 : 정밀 과학 도구 # 15000-02)를 사용하여 해부. 각 주입 사이트에서 먼저 자궁 벽은 다음 decidua는 자궁의 긴 축에 평행 예리하게 찔 할 수 있으며, 절개 그런 다음 고급 집게를 사용하여 추가로 열 수 있습니다. decidua은 태아 세포막을 노출 비슷한 절개 후 제거 할 수 있습니다. 케어는 태아 막의은 예리하게 찔 또는 구멍되지 않도록 행사되어야한다. </li><li> 멸균 행크스 균형 소금 솔루션 (HBSS)으로 세척하고 피펫뿐만 아니라 kimwipe 또는 필터를 사용하여 주변의 배아에서 초과 액체를 제거신문은 삼각형으로 자른다. </li></ol> 2. 심실 CSF 컬렉션 <ol><li> 해부 현미경 아래에서 배아를 시각화 : 마우스, 배 하나가 난자의 시상 전망을 같은 것으로, 그 옆에 누워해야합니다. 배아는 뒷면에 거짓말처럼 쥐 배아 E16 이상으로, 꼬리 방향으로 두개골에서의 긴 평면 차원을 따라, 그 등쪽 척추의 배아를 배치. 이러한 방식에서 CSF는 오른쪽과 왼쪽 모두 측면 심실에서 수령하실 수 있습니다. </li><li> 꾸준히 피펫가 삽입 된 후에 neuroepithelial 세포를 문의하지 시도, 측 방향 심실, mesencephalic 심실 또는 cisterna 마그나에 마이크로 모세관 피펫를 삽입합니다. 마우스 배아 E14.5 이상은 CSF는 우심실에서 흡입 한 후 바늘을 제거하고 왼쪽 심실에 삽입 할 수 있습니다. 태아의 심실과 신경 튜브의 명백으로 인해 젊은 E14.5보다전체 CSF 볼륨은 종종 하나의 바늘 삽입과 측면 심실에서 흡입 할 수 있습니다. 연결 심실의 발달 시간과 명백이 약간 다를 수 있으며, 따라서, 마이크로 모세관 피펫도 최대 CSF 볼륨을 수집하는 cisterna 마그나에 삽입 할 수 있습니다 그러나, 항상 그런 것은 아닙니다. </li><li> 마이크로 모세관 피펫은 신중하게, 측 방향 심실, mesencephalic 심실 또는 cisterna 마그나에 삽입하고 부드럽게 부정적인 압력을 생성하고 CSF를 대기음하는 중 마이크로 플런저를 사용하여 피펫으로 CSF를 aspirating 시작되면, 또는를 제공하여 CSF는 부드럽게 천천히 제어 방식으로 마이크로 모세관 피펫으로 흘러 시작되도록 입으로 만들어 부드러운 부정적인 압력. 우리는 뷰어가 이러한 방식에 대한 제도적 정책에 대한 자신의 지역 당국과 함께 확인하는 것이 좋습니다. </li><li> 부정적인 압력을 적용하고 마이크로 모세관 피펫으로 CSF를 수집하고 있습니다.E16.5/E17 이하의 마우스와 쥐 배아에서 모두는, 마이크로 모세관 피펫 나이 배아에서 인치입니다 머리의 측면에 형성 디 보트의 모습으로 약간 심실 붕괴를 관찰 할 수 있습니다 뇌의 큰 크기로 인해, 그것은 머리를 축소 관찰 할 수없는 경우가 있습니다. </li><li> 압력을 가해 그만하고 부드럽게 측면 심실에서 마이크로 모세관 피펫을 제거합니다. </li><li> 부드럽게 얼음에 냉각 된 Eppendorf 튜브에 CSF 샘플을 배출. </li><li> 동물의 전체 쓰레기에서 CSF를 계속 수집하고 같은 튜브에 샘플을 수영장을 보유하고 있습니다. </li><li> 모든 오염 세포를 제거하는 10 분 동안 4 ° C에서 10,000 XG에 원심 분리기. </li><li> neuroepithelial 셀이나 적혈구를 오염의 흔적에 대한 샘플을 분석합니다. 오염의 징후는 일반적으로 흐릿하거나 핑크 / 레드 나타나는 유체, 또는 혈액 물들어있는 곳이있는 펠릿의 존재에 의해 표시됩니다. 원심 분리 후, CSF는 셀이나 세포 파편의 증거에 대한 미세 분석 할 수 있습니다. 오염의 징후가있는 경우 유체는 폐기해야합니다. 추가 제어 기능으로, 펠릿 내용은 셀에 물들 일 수 있습니다. 깨끗한 CSF 샘플은 세포 배양, 대뇌 피질의 문화, 분석법, 서부 얼룩, 엘리사, 기타 assays에 사용하실 수 있습니다. 맑은 CSF는 새로운 살균 Eppendorf 튜브로 전송해야합니다. 샘플은 현재 액체 질소로 냉동 기타 샘플, 또는 스냅과 풀링 및 -80 ° C.에 저장, 분석에 사용될 수 있습니다 유체의 작은 샘플의 동결 융해는 작은 볼륨 감소 및 단백질 농도의 변화가 발생할 수 있습니다. 이 문제는 샘플을 건조 동결하여 방지 할 수 있습니다. </li></ol> 3. 대뇌 피질의 Explant의 해부 <ol><li> Sylgard로 만든 마이크로 해부 요리로 쓰레기 분리 E14.5 배아를 전송합니다. </li><li> 단계 1.5에서 설명 된대로 추가 - 배아 멤브레인 및 조직에서 배아를 제거합니다. </li> &lt;멸균 행크스 균형 소금 솔루션 (HBSS)과 피펫을 사용하여 주변의 배아에서 초과 액체를 제거와 리&gt; 워시. </li><li> 배의 나머지 (그림 1A)에서 머리를 분리 자궁 경부 지역을 해부. </li><li> 고급 메스 (안과 칼을)를 사용, 두피의 중간 선을 끊을. 고급 집게로이 절개의 각 측면을 파악하고 피부를 제거합니다. 다음, 개발 두개골의 중간 선의 길이를 실행 절개를 만들기 위해 iridectomy 가위를 사용합니다. 그 후, 개발 두개골의 앞쪽과 뒤쪽 끝에서 두 개의 절개, 거리의 약 1 / 3합니다. 두개골의 &quot;날개&quot;를 파악하기 위해 고급 집게를 사용하십시오 절개의이 부분으로 인해, 그리고 피질 (그림 1B) 노출 개발 두개골 조직을 제거합니다.주세요 </li><li> 오른쪽과 왼쪽 대뇌 피질의 뇌를 (그림 구분 중반 sagital 비행기에서 중간 선을 따라 메스를 이등분에게 뇌를 사용1B, C). 피아와 거미집 모양의은 피질에 부착 남아 있으며, 경질은 개발 두개골과 함께 제거됩니다. </li><li> 각각 대뇌 피질 반구를 준비합니다. 왜 그렇게 당신이 ganglionic 예하와 개발 피질 (그림 1C, D)를 참조 할 수있는 반구 안쪽면을 넣습니다. </li><li> 메스를 사용, 개발 후각 망울에 꼬리 대뇌 피질의 neuroepithelium을 통해 코로나 절개를합니다. 이 절개는 측면과 안쪽 ganglionic eminences의 앞쪽 경계에서 시작하고, 개발 대뇌 피질의 퇴화 기관 (그림 1E)의 앞 cingulate 지역을 확장해야합니다. </li><li> 측면 ganglionic 예하 (그림 1 층)의 뒤쪽 경계에서 불과 꼬리 또 다른 코로나 절개를합니다. 이 절개는 또한 개발 대뇌 피질의 퇴화 기관의 안쪽 벽에 ganglionic 예하의 측면 경계에서 연장해야합니다. </li><li> 대뇌 피질의 &quot;플랩&quot;crea를 철회피질에 기계적 손상을 방지하기 위해 200 μl pipettor 함께 제공 HBSS의 스트림에서 메스 나 부드러운 압력을 사용하여 단계 3.7 및 3.8에서 만든 두 개의 절개로 테드. 그런 다음 개발 피질 (그림 1G, H)에서 측면 ganglionic 예하 분리의 경계를 따라 횡 방향 절개를합니다. 그런 다음, 측 방향 대뇌 피질의 표면이 interhemispheric 벽을 충족 네크로의 꼭대기에서 개발 해마와 내측 telencephalon의 대뇌 피질의 신발을 멀리 해부. </li><li> 개발 피질 (그림 1H)에서 측면 ganglionic 예하 분리의 경계를 따라 횡 방향 절개를합니다. </li><li> 해부하는 대뇌 피질의 explant에서 Sylgard 판에 여분의 해부 조직을 제거합니다. 하나는 여분의 해부 조직을 멀리 피펫에 신선한 HBSS 버퍼로 부드럽게 pipetting을 사용할 수 있습니다. 해부 피질 아래에 직면 수막 측 (그림 1I)와 지금입니다. </li></ol><ol><li> 유리 피펫에 연결된 백금 와이어 루프를 준비합니다. 유리 피펫의 끝 부분에 삽입 접힌 백금 와이어로 유리 피펫을 가열. 백금 와이어 루프의 끝을 비틀으로 루프의 크기는 증가 또는 감소, 그리고 루프는 원하는 explant의 크기에 맞게 형성 될 수있다 할 수 있습니다. (이것은 사전에 준비 재사용 할 수 있습니다.) </li><li> 루프를 소독하기 위해 백금 와이어의 끝을 가열. </li><li> 해부하는 대뇌 피질의 explant를 분리하고 와이어 루프와 함께 사용하기 위해 작은 금액을두고, 부드러운 pipetting하여 추가 HBSS 미디어를 제거합니다. </li><li> 4cm 직경 이미징 요리에 1cm 폴리 카보네이트 막를 놓습니다. </li><li> 수막 사이드가 직면 있도록 백금 와이어 루프의 측면을 사용하여 부드럽게 피질을 플립. </li><li> 루프의 중간에 explant를 삽입 할 수있는 고유 수압의 힘을 사용하여, 해부 접시에서 대뇌 피질의 explant을 들어평면 비행기에 explant을 들어. </li><li> 부드럽게 폴리 카보네이트 막에 explant을 배치하고, 멀리 explant은 심실 표면 막과 접촉을 시청할 수있는 평면 비행기에서 막에 남아 있도록 백금 와이어 루프를 올린다. </li><li> 부드럽게 멤브레인을 들고 막 아래 CSF 또는 다른 미디어의 50 μl를 피펫. </li><li> 이미징 요리를 표지, 지속적인 세포 증식 및 explant의 성장을 지원하기 위해 24 시간에 5 ​​% CO 2에서 humidified 차 컨테이너에 배치하고, 37 ° C에서 알을 품다. 그림 2는 최종 대뇌 피질의 explant 요리 준비의 개략도를 도시한다. </li></ol>

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A., Callejo, S., Parada, C., Martin, P., Carnicero, E., Gato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF2+plays+a+key+role+in+embryonic+cerebrospinal+fluid+trophic+properties+over+chick+embryo+neuroepithelial+stem+cells.">FGF2 plays a key role in embryonic cerebrospinal fluid trophic properties over chick embryo neuroepithelial stem cells.</a> Developmental Biology. 297 (2), 402-416 (2006).</li><li>Zappaterra, M. W., Lehtinen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cerebrospinal+fluid:+regulator+of+neurogenesis,+behavior,+and+beyond.">The cerebrospinal fluid: regulator of neurogenesis, behavior, and beyond.</a> Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 69 (17), 2863-2878 (2012).</li></ol>

제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.

심실 CSF 수집에 대한 설명 방법은 세포 assays 9 수의 안정적인 단백질 구성하고 일관된 활동과 배아 CSF의 비교적 순수한 샘플을 굴복했다. 좋은 수집 기술 개 E14.5 마우스 쓰레기의 크기로, 하나는 CSF의 10-15 μl를 수집하는 기대 수 있으며, E16 쥐의 쓰레기로부터, 하나는 CSF의 50-90 μl에 대해 수집 기대할 수 있습니다. 이 컬렉션 기술은주의 관찰, 원심 분리하고, 세포 파편 또는 혈액 가미의 증거 샘플 폐기하여, 혈액 및 조직에서 오염을 최소화합니다. 우리는 원심 분리 후 CSF 내에서 세포 부스러기 또는 셀에 대한 평가 미세 유체를 분석하고, 원심 분리 후 더 펠릿이없는 샘플 세포 오염에서 무료로 제공되는 것으로 나타났습니다. 개발 뇌 조직의 프로테옴이나 CSF 추출이 방법을 사용하여 오염 CSF (데이터 미도시)의 샘플에 대조적으로,질량 분석계 6 분석 할 때 CSF 프로테옴는 mitochondrial 단백질을 포함하지 않았다. telencephalic 소포 및 신경 튜브 내에서 심실 CSF의 물리적 현지화, 절연의 개발 피부, 두개골, 그리고 telencephalon를 통해 피어스에게의 유일한 방법을 기반으로합니다. 따라서 이러한 조직을 통해 바늘 삽입이 가능합니다 오염에 대한 소스입니다. 바늘의 끝은 바늘이 조직 통해 심실에 부드럽게 삽입 할 수 있도록 최대한 슬림해야합니다. 마이크로 모세관 피펫은 심실로 바늘의 삽입시 바늘의 구멍 안에 조직을 수집 할 수 있습니다. 배의 나이에 따라, 그리고 맥락막 얼기는 심​​실에서 개발 한 경우에는 피펫에 맥락막 얼기의 내용을 기음하지하는 것이 중요합니다. 그러나, CSF는 t으로 수집하는 등 충분한 부정적인 압력을 만드는 것이 중요합니다그는 주변 개발 뇌 조직이나 맥락막 얼기를 방해하지 않으면 서, 피펫. 조직 오염의 존재는 유리 커버 슬립이있는 유리 슬라이드에 CSF를 pipetting 직접 세포 파편에 대한 시각화하여 해부 현미경으로 시각화 할 수 있습니다. 우리가 현재까지 결정으로 우리는 CSF 절연에 대한 설명 방법은 CSF의 비교적 순수한 샘플을 제공합니다. 오염 된 CSF 샘플은 질량 분광법을 사용하여 분석 한 유명 때, mitochondrial 단백질 (데이터 미도시)의 존재를 공개했다. 기술에 내재 된 결함은 CSF가 개발 두개골, 피질를 펑 쳐링하여 얻을 수 있으며, 따라서 세포 및 조직의 CSF에있을 수 있다는 것입니다. , CSF를 centrifuging 펠릿에 대한 시금 및 미세 현미경 CSF를 분석함으로써, 우리는 CSF의 비교적 순수한 샘플을 산출 CSF 격리하는 방법을 최적화했습니다. 기술의 F또는 심실 배아 CSF 수집 및 뇌성 대뇌 피질의 explants가 기술과 배아 마우스 영화에 표시되어 있습니다. 그러나,이 기술은 모든 배아 설치류에서 심실 CSF 수집 및 뇌성 대뇌 피질의 explants에 사용 할 수 있으며, 쥐와 생쥐 모두에 적용되었습니다. 이 프로토콜에 설명 된 방법은 심실 CSF의 분리를 위해 특별히 설계되었습니다, 그리고 subarachnoid 공간에서 CSF를 수집하기위한 것이 아닙니다. 대뇌 피질 explants에 대한 기술은 개별 실험에 사용할 수 배아 CSF의 제한된 양에 따라, 미디어의 감소 볼륨과 explants 성장을 할 수 있도록 만들어졌습니다. 24 시간에 안정적으로 explants를 성장하는 데 사용되는 매체의 가장 작은 볼륨은 50 μl이었다. 경우에 따라, explants은 72 시간되는 가장 긴 기간으로, 이상 24 시간에 배양 하였다. 더 이상 실험을 통해, 그것은 성장 미디어마다 24 시간을 보충하는 것이 가장 좋습니다. 일단 explants AR전자 시간이 원하는 기간 동안 배양, explants는 neurospheres, 세포 죽음, 또는 RNA 추출을 생성, immunofluoresence 등 다양한 assays의 번호를 사용할 수 있습니다.

CSF는 개발 neuroepithelium 1-6 bathes 및 개발 뇌 8-12에 대한 단서를 홍보하는 중요한 압력 7 성장을 제공하는 복잡한 유체입니다. 뇌 개발의 과정을 통해 CSF를 연구하기 위해, 우리는 개발 6,9의 다양한 단계에서 쥐 또는 마우스 배아를 개발에서 심실 CSF를 분리하는 기술을 개발했다. 고립 이전 방법은 유리 마이크로 바늘을 사용하고 마이크로 주사기 1,2을 사용하여 CSF를 분리 포함되어 있습니다. 우리의 방법 누구의 팁 향상된 조직 침투를위한 초 미립 지점을 만들 당겨 된 유리 마이크로 모세관 피펫을 이용하고 있습니다. 그 심실 CSF 모음 압력 부드러운 변화를 제어 할 수 있도록 유리 마이크로 모세관 피펫는 흡인기에 연결되어 있습니다. CSF 신호의 줄기 세포 영향을 조사하기 위해, 우리는 대뇌 피질의 explants를 해부 폴리 카보네이트 멤브레인에 넣어, 그리고 적절한 세제곱에 흘려 보내곤lture 매체 CSF 샘플을 9 보충. 이 기술을 통해 미디어의 감소 권 CSF 9 효율적으로 사용할 수 있도록, 문화, 조직을하기에 충분한 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 재료의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> Wiretrop II 모세관 바늘 </td><td> Drummond 과학 </td><td> # 5-000-2020 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> 엘스 워드 접착제 </td><td> # 184 SIL ELAST 키트 </td><td></td></tr><tr><td> 흡인기 관 조립 </td><td> 시그마 </td><td> # A5177-5EA </td><td></td></tr><tr><td> 일회용 필터 </td><td> 벤 투리 관 또는 지방 약국 </td><td> 사용할 수 없습니다 </td><td> 표준 담배 필터 </td></tr><tr><td> Roundstock의 opthalmic의 칼 (15도 찔린 칼) </td><td> 세계 정밀 기기 주식회사 </td><td> # 500250 </td><td></td></tr><tr><td> 35mm 유리 바닥 문화 요리 </td><td> MatTek 주식회사 </td><td> # P35G - 1.5-14-C </td><td&gt; </td></tr><tr><td> 백금 - 이리듐 와이어 </td><td> Tritech 연구 </td><td> # PT-9010-010-3FT </td><td></td></tr><tr><td> Nuclepore 트랙 - 에칭 막 </td><td> 워트 먼지 </td><td> # 09-300-57 </td><td></td></tr><tr><td> 행크스 균형 소금 솔루션 </td><td> 피셔 과학 </td><td> # SH30031.FS </td><td></td></tr><tr><td> Iridectomy의 가위 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> # 15000-02 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of cerebrospinal fluid from rodent embryos for use with dissected cerebral cortical explants

CSF 개발 전역과 성인에서 동적으로 변화 프로테옴과 복잡한 유체입니다. 배아 개발 과정 초기 CSF는 앞쪽 신경 튜브의 폐쇄시 양수에서 차별화합니다. CSF 볼륨는 심실과 맥락막 얼기 생성 CSF 릴 neuroepithelial 전구 세포 등의 후속 일 동안 증가합니다. 개발 뇌와 척수의 신경 줄기 세포의 배아 CSF 연락처는 꼭대기, 심실 표면. CSF는 개발 뇌의 확장을위한 중요한 유체 압력을 제공하며, 시간적 특정 방식으로 신경 전구 세포에 요소를 홍보하는 중요한 성장을 배포합니다. CSF의 기능을 조사하기 위해 피하거나 개발 telencephalic 조직에서 오염없이 배아 CSF의 순수한 샘플을 분리하는 것이 중요합니다. 여기, 우리는 사용할 수있는 심실 배아 CSF의 비교적 순수한 샘플을 분리 할 수​​있는 기술을 설명질량 분광법, 단백질 전기 영동, 그리고 세포와 기본 explant 문화 등의 실험 assays 다양한. 우리는 미디어 또는 CSF의 감소 볼륨과 개발 대뇌 피질의 조직을 성장하기 위해 다공성 폴리 카보네이트 멤브레인에 대뇌 피질의 explants를 해부과 문화하는 방법을 보여줍니다. 이 방법을 실험 대상 세포에 CSF 프로테옴의 생물학적 활동을 조사하기 위해 다양한 연령이나 조건에서 CSF를 사용하여 수행 할 수 있습니다.

CSF 컬렉션은 깨끗하고 투명한 액체를 얻을 수 있습니다. 기음과 Eppendorf 튜브에 빨간색이나 노란색 물들어 유체에 의해 증명으로 혈액의 오염의 증거가 없어야합니다. 또한 기음과 Eppendorf 튜브에 조직의 증거가 없어야합니다. CSF가 centrifuged 때, 하나는 오염이 없다는 것을 보장하기 위해 미세 CSF를 평가 할 수 있습니다. 오염의 징후가있는 경우, CSF는 폐기해야합니다. 한 E14.5 마우스 쓰레기에서 한 10-15 μl CSF를 수집하는 예상 할 수 있습니다. 표 1은 다양한 배아 세에서 모두 마우스 및 쥐 평균 쓰레기 크기에서 수집 한 CSF의 평균 볼륨을 도시한다. 순수 CSF 샘플이 수집 된 경우, CSF는 다른 기술을 사용하여 분석 할 수 있습니다. 그림 3은 마우스 E14.5 CSF의 2ug를 사용하여 대표적인 실버 스테인드 젤을 보여줍니다. 뇌 피질 explants는 지혜를 재배 할 수 있습니다H는 CSF의 볼륨 플러스 기저 매체 전체 볼륨이 50 μl이되도록 필요한 경우를 변화. 그림 4는 24 시간 100 % 배아 CSF의 50 μl로 재배 대표 explants을 보여줍니다. explants는 살아 남기 위해 표시 및 100 %의 CSF와 세포 분열 따위에 의해 번식과 심실 따라 같은 phospho-히스톤 H3 (PH3), 세포 분열의 마커에 immunoreactivity로 표시 같은 임신 9 살에서 쥐 배아와 유사한 조직 조직학이되었습니다 표면 BrdU, 개발 대뇌 피질 판의 DNA 합성, 심실 구역을 따라 설립, 그리고 Tuj1, neuronal 마커의 표시. <table border="1"><tbody><tr><td> Sprague Dawley 쓰레기 배아 시대 </td><td> 쓰레기 당 볼륨 </td><td> CD1 쓰레기 배아 시대 </td><td> 쓰레기 당 볼륨 </td></tr><tr><td> E13 </td><td> 30-50 μl </td><td> E10.5 </td><td> 15-20 μl </td></tr><tr><td> E14 </td><td> 40-75 μl </td><td> E12.5 </td><td> 15-20 μl </td></tr><tr><td> E16 </td><td> 50-90 μl </td><td> E14.5 </td><td> 10-15 μl </td></tr><tr><td> E18 </td><td> 40-75 μl </td><td> E16.5 </td><td> 5-10 μl </td></tr></tbody></table> 표 1. 표준 크기의 Litters에서 얻은 CSF의 평균 볼륨. <img src="/files/ftp_upload/50333/50333fig1.jpg" alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50333/50333fig1highres.jpg"/> 1 그림. 뇌 두피 Explant의 절개를 개요 설계도. <img src="/files/ftp_upload/50333/50333fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 최종 요리 준비의 개략도. 그림 3. 실버 마우스 E14.5 CSF의 얼룩.이 대표 실버는 Invitrogen에서 비스 - 트리스 NuPAGE 그라데이션 젤 4~12%에서 실행 2ug 마우스 E14.5 CSF 단백질의 얼룩입니다. 실버 5 분 40 초 개발 SilverQuest 실버 얼룩 키트 짓을 얼룩. <img src="/files/ftp_upload/50333/50333fig4.jpg" alt="그림 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50333/50333fig4highres.jpg"/> 4 그림. 24 시간에 성장 E15 쥐 대뇌 피질의 explants가.이 백퍼센트 배아 CSF에서 24 시간에 성장 뇌성 대뇌 피질의 explants의 대표적인 이미지입니다. 이 explants는 Carnoy의 방법, sectioned 파라핀으로 고정하고, immunostaining 준비되어 있습니다. PH3 (빨간색) 및 Tuj1 (녹색), BrdU (파란색).

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Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

심실 뇌척수 (CSF)는 배아의 초기 뇌 발달 동안 neuroepithelial과 대뇌 피질 전구 세포를 bathes. 여기에는 생물학적 기능을 조사하기 위해 다양한 연령대의 쥐 배아에서 심실 CSF를 분리하기 위해 개발 된 방법을 설명합니다. 또한, 우리는 우리의 대뇌 피질 explant의 해부와 문화 매체 또는 CSF의 최소한의 볼륨으로 explant 성장을 허용 문화 기술을 보여줍니다.

해부하는 뇌 두피 Explants와 함께 사용하기위한 쥐 태아의 뇌척수의 절연

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

22.9K 조회수.  VA Greater Los Angeles Healthcare System. 심실 뇌척수 (CSF)는 배아의 초기 뇌 발달 동안 neuroepithelial과 대뇌 피질 전구 세포를 bathes. 여기에는 생물학적 기능을 조사하기 위해 다양한 연령대의 쥐 배아에서 심실 CSF를 분리하기 위해 개발 된 방법을 설명합니다. 또한, 우리는 우리의 대뇌 피질 explant의 해부와 문화 매체 또는 CSF의 최소한의 볼륨으로 explant 성장을 허용 문화 기술을 보여줍니다.

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Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Astrocytes are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be learned about their molecular and functional characteristics. In vitro astrocyte cell culture systems can be used to study the biological functions of these glial cells in detail. This video protocol shows how to obtain pure astrocytes by isolation and culture of mixed cortical cells of mouse pups. The method is based on the absence of viable neurons and the separation of astrocytes, oligodendrocytes and microglia, the three main glial cell populations of the central nervous system, in culture. Representative images during the first days of culture demonstrate the presence of a mixed cell population and indicate the timepoint, when astrocytes become confluent and should be separated from microglia and oligodendrocytes. Moreover, we demonstrate purity and astrocytic morphology of cultured astrocytes using immunocytochemical stainings for well established and newly described astrocyte markers. This culture system can be easily used to obtain pure mouse astrocytes and astrocyte-conditioned medium for studying various aspects of astrocyte biology.

Astrocytes have been recognized to be versatile cells participating in fundamental biological processes that are essential for normal brain development and function, and central nervous system repair. Here we present a rapid procedure to obtain pure mouse astrocyte cultures to study the biology of this major class of central nervous system cells.

마우스 두피 Astrocytes의 분리와 문화

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

연구

신경과학

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and associated extracellular matrix. Because they provide a suitable organotypic environment, cortical slice explants are often used to investigate those interactions that control neuronal differentiation and development. Although beneficial, the slice explant model can suffer from drawbacks including aberrant cellular lamination and migration. Here we report a whole cerebral hemisphere explant system for studies of early cortical development that is easier to prepare than cortical slices and shows consistent organotypic migration and lamination. In this model system, early lamination and migration patterns proceed normally for a period of two days in vitro, including the period of preplate splitting, during which prospective cortical layer six forms. We then developed an ex utero electroporation (EUEP) approach that achieves ~80% success in targeting GFP expression to neurons developing in the dorsal medial cortex.
The whole hemisphere explant model makes early cortical development accessible for electroporation, pharmacological intervention and live imaging approaches. This method avoids the survival surgery required of in utero electroporation (IUEP) approaches while improving both transfection and areal targeting consistency. This method will facilitate experimental studies of neuronal proliferation, migration and differentiation.

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

This protocol describes an improved explant procedure that involves ex utero electroporation, dissection and culture of entire cerebral hemispheres from the embryonic mouse. The preparation facilitates pharmacological studies and assays of gene function during early cortical development.

예 자궁 Electroporation 및 전체 반구의 Explants : 초기 두피 개발 연구 간단한 실험 방법

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. Studying neurons in vivo can be challenging due to their complexity, their varied and dynamic environments, and technical limitations. For these reasons, studying neurons in vitro can prove beneficial to unravel the complex mysteries of neurons. The well-defined nature of cell culture models provides detailed control over environmental conditions and variables. Here we describe how to isolate, dissociate, and culture primary neurons from chick embryos. This technique is rapid, inexpensive, and generates robustly growing sensory neurons. The procedure consistently produces cultures that are highly enriched for neurons and has very few non-neuronal cells (less than 5%). Primary neurons do not adhere well to untreated glass or tissue culture plastic, therefore detailed procedures to create two distinct, well-defined laminin-containing substrata for neuronal plating are described. Cultured neurons are highly amenable to multiple cellular and molecular techniques, including co-immunoprecipitation, live cell imagining, RNAi, and immunocytochemistry. Procedures for double immunocytochemistry on these cultured neurons have been optimized and described here.

Cell culture models provide detailed control over environmental conditions and thus provide a powerful platform to elucidate numerous aspects of neuronal cell biology. We describe a rapid, inexpensive, and reliable method to isolate, dissociate, and culture sensory neurons from chick embryos. Details of substrata preparation and immunocytochemistry are also provided.

병아리 배아에서 분리 및 해리 감각 뉴런의 문화

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

배아 쥐의 뇌에서 차 중뇌 도파민 신경 세포의 분리, 문화 및 장기 유지 보수

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles

Intracerebral parenchymal arterioles (PAs), which include parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles, are high resistance blood vessels branching out from pial arteries and arterioles and diving into the brain parenchyma. Individual PA perfuse a discrete cylindrical territory of the parenchyma and the neurons contained within. These arterioles are a central player in the regulation of cerebral blood flow both globally (cerebrovascular autoregulation) and locally (functional hyperemia). PAs are part of the neurovascular unit, a structure that matches regional blood flow to metabolic activity within the brain and also includes neurons, interneurons, and astrocytes. Perfusion through PAs is directly linked to the activity of neurons in that particular territory and increases in neuronal metabolism lead to an augmentation in local perfusion caused by dilation of the feed PA. Regulation of PAs differs from that of better-characterized pial arteries. Pressure-induced vasoconstriction is greater in PAs and vasodilatory mechanisms vary. In addition, PAs do not receive extrinsic innervation from perivascular nerves &#8212; innervation is intrinsic and indirect in nature through contact with astrocytic endfeet. Thus, data regarding contractile regulation accumulated by studies using pial arteries does not directly translate to understanding PA function. Further, it remains undetermined how pathological states, such as hypertension and diabetes, affect PA structure and reactivity. This knowledge gap is in part a consequence of the technical difficulties pertaining to PA isolation and cannulation. In this manuscript we present a protocol for isolation and cannulation of rodent PAs. Further, we show examples of experiments that can be performed with these arterioles, including agonist-induced constriction and myogenic reactivity. Although the focus of this manuscript is on PA cannulation and pressure myography, isolated PAs can also be used for biochemical, biophysical, molecular, and imaging studies.

This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

분리 및 대뇌 실질 세동맥의 캐 뉼러

Intracerebral parenchymal arterioles (PAs), which include parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles, are high resistance ...

Sample Preparation for Endopeptidomic Analysis in Human Cerebrospinal Fluid

This protocol describes a method developed to identify endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose, a previously developed method based on molecular weight cut-off (MWCO) filtration and mass spectrometric analysis was combined with an offline high-pH reverse phase HPLC pre-fractionation step.
Secretion into CSF is the main pathway for removal of molecules shed by cells of the central nervous system. Thus, many processes in the central nervous system are reflected in the CSF, rendering it a valuable diagnostic fluid. CSF has a complex composition, containing proteins that span a concentration range of 8 - 9 orders of magnitude. Besides proteins, previous studies have also demonstrated the presence of a large number of endogenous peptides. While less extensively studied than proteins, these may also hold potential interest as biomarkers.
Endogenous peptides were separated from the CSF protein content through MWCO filtration. By removing a majority of the protein content from the sample, it is possible to increase the sample volume studied and thereby also the total amount of the endogenous peptides. The complexity of the filtrated peptide mixture was addressed by including a reverse phase (RP) HPLC pre-fractionation step at alkaline pH prior to LC-MS analysis. The fractionation was combined with a simple concatenation scheme where 60 fractions were pooled into 12, analysis time consumption could thereby be reduced while still largely avoiding co-elution.
Automated peptide identification was performed by using three different peptide/protein identification software programs and subsequently combining the results. The different programs were complementary rather than comparable with less than 15% of the identifications overlapped between the three.

A method for mass spectrometric analysis of endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF) is presented. By employing molecular weight cut-off filtration, chromatographic pre-fractionation, mass spectrometric analysis and a subsequent combination of peptide identification strategies, it was possible to expand the known CSF peptidome nearly ten-fold compared to previous studies.

인간의 중추 신 경계에서 Endopeptidomic 분석을 위한 시료 준비

This protocol describes a method developed to identify endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose, a previously developed ...

A Rat Model of Mild Intrauterine Hypoperfusion with Microcoil Stenosis

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies of this phenomenon have been performed in either models with severe intrauterine ischemia or models with gradient degree of intrauterine hypoperfusion. No study has been performed in a model on uniform mild intrauterine hypoperfusion (MIUH). Two models have been used for studies of MIUH: a model based on suture ligation of either side of the arterial arcade formed with the uterine and ovarian arteries, and a transient model based on clipping the bilateral ovarian arteries and aorta having patency. Those two rodent models of MIUH have some limitations, e.g., not all fetuses are subjected to MIUH, depending on their position in the uterine horn. In our MIUH model, all fetuses are subjected to a comparable level of intrauterine hypoperfusion. MIUH was achieved by mild stenosis of all four arteries feeding the uterus, i.e., the bilateral uterine and ovarian arteries.
Arterial stenosis was induced by metal microcoils wrapped around the feeding arteries. Producing arterial stenosis with microcoils allowed us to control, optimize, and reproduce decreased blood flow with very little inter-animal variability and a low mortality rate, thus enabling accurate evaluation. When microcoils with an inner diameter of 0.24 mm were used, the blood flow in both the placenta and fetus was mildly decreased (approximately 30% from the pre-stenosis level in the placenta). The offspring of our MIUH model clearly demonstrates long-lasting alterations in neurological, neuroanatomical and behavioral test results.

Mild intrauterine hypoperfusion was produced by artery stenosis with metal microcoils wrapped around the uterine and ovarian arteries in rats at embryonic day 17. This procedure produced prenatal hypoperfusion and intrauterine growth restriction.

Microcoil 협와 가벼운 자궁내 Hypoperfusion의 쥐 모델

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies ...

An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central nervous system and thus, can be used to analyze the diseased state of the brain or spinal cord without directly accessing these tissues. However, in mice it is difficult to obtain from the cisterna magna due to its closeness to blood vessels, which often contaminate samples. The area for CSF collection in mice is also difficult to dissect to and often only small samples are obtained (maximum of 5-7 &#181;L or less). This protocol describes in detail a technique that improves on current methods of collection to minimize contamination from blood and allow for the abundant collection of CSF (on average 10-15 &#181;L can be collected). This technique can be used with other dissection methods for tissue collection from mice, as it does not impact any tissues during CSF extraction. Thus, the brain and spinal cord are not affected with this technique and remain intact. With greater CSF sample collection and purity, more analyses can be used with this fluid to further aid neuroscience research and better understand diseases affecting the brain and spinal cord.

This protocol describes an improved technique for the abundant collection of cerebrospinal fluid (CSF) with no contamination from blood. With greater sample collection and purity, more analyses can be performed using CSF to further our understanding of diseases that affect the brain and spinal cord.

마 취 쥐에서 척수의 컬렉션에 대 한 개선된 방법

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic strategies that hold the promise to enhance brain drug delivery, improve brain protection, and treat brain disorders. However, studying the human blood-brain barrier function is challenging. Thus, there is a critical need for appropriate models. In this regard, brain capillaries isolated from human brain tissue represent a unique tool to study barrier function as close to the human in vivo situation as possible. Here, we describe an optimized protocol to isolate capillaries from human brain tissue at a high yield and with consistent quality and purity. Capillaries are isolated from fresh human brain tissue using mechanical homogenization, density-gradient centrifugation, and filtration. After the isolation, the human brain capillaries can be used for various applications including leakage assays, live cell imaging, and immune-based assays to study protein expression and function, enzyme activity, or intracellular signaling. Isolated human brain capillaries are a unique model to elucidate the regulation of the human blood-brain barrier function. This model can provide insights into central nervous system (CNS) pathogenesis, which will help the development of therapeutic strategies for treating CNS disorders.

Isolated brain capillaries from human brain tissue can be used as a preclinical model to study barrier function under physiological and pathophysiological conditions. Here, we present an optimized protocol to isolate brain capillaries from fresh human brain tissue.

신선한 인간의 뇌 조직에서 뇌 모세 혈관의 절연

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Rat Model of Widespread Cerebral Cortical Demyelination Induced by an Intracerebral Injection of Pro-Inflammatory Cytokines

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and death, caused by white matter lesions in the spinal cord and cerebellum, as well as by demyelination in grey matter. Whilst conventional models of experimental allergic encephalomyelitis are suitable for the investigation of the cell-mediated inflammation in the spinal and cerebellar white matter, they fail to address grey matter pathologies. Here, we present the experimental protocol for a novel rat model of cortical demyelination allowing the investigation of the pathological and molecular mechanisms leading to cortical lesions. The demyelination is induced by an immunization with low-dose myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) in an incomplete Freund&#39;s adjuvant followed by a catheter-mediated intracerebral delivery of pro-inflammatory cytokines. The catheter, moreover, enables multiple rounds of demyelination without causing injection-induced trauma, as well as the intracerebral delivery of potential therapeutic drugs undergoing a preclinical investigation. The method is also ethically favorable as animal pain and distress or disability are controlled and relatively minimal. The expected timeframe for the implementation of the entire protocol is around 8 - 10 weeks.

The protocol presented here allows the reproduction of a widespread grey matter demyelination of both cortical hemispheres in adult male Dark Agouti rats. The method comprises of intracerebral implantation of a catheter, subclinical immunization against myelin oligodendrocyte glycoprotein, and intracerebral injection of a pro-inflammatory cytokine mixture through the implanted catheter.

프로 염증 성 사이토카인의 인트레이스렐 주입에 의해 유도된 광범위한 대뇌 피질 탈량의 쥐 모델

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and ...