이 작품은 샬롯 노스 캐롤라이나 대학 교수 우수성 Wachovia 기초 기금, 그리고 NIGMS (R15GM101571)에서 교부금에 의해 제공 자금에 의해 부분적으로 지원됩니다.

1. LSE 준비 <ol><li> 여성 개구리 (Xenopus laevis)는 계란 수집을 위해 두 번 주입하고 있습니다. 첫 번째 주입 (프라이밍)는 개구리 당 100 U PMSG (임산부 마레 세럼 생식샘 자극 호르몬)입니다. 유도 난자 놓고 중이오 개구리가 2 주에 사용할되기 전에 개구리는 최소한 이틀 중이오해야합니다. 주요 개구리에게, 3 ML의 주사기 27 G 바늘을 사용하여 등쪽 림프 주머니에 피하 주사 PMSG. </li><li> 누워있는 달걀을 유도하기 위해 27 G 바늘을 사용하여 등쪽 림프 주머니에 피하 중이오 개구리 당 500 U hCG (인간 Chorionic Gonadotrophin)을 주입. 1X 마크의 수정 벨소리의 솔루션 (MMR) 2 리터를 포함하는 별도의 물통에 주입 개구리를 품다. 수집하기 전에 알을 낳기 위해 개구리에게 14-20 시간을 허용합니다. </li><li> 버킷에서 개구리를 제거하고 약 100 ML가 왼쪽 때까지 MMR 솔루션을 부어. 250 ML의 비커에 달걀을 전송하여 양동이에서 알을 얻습니다. </li><li> 2 % 시스테인의 100 ML (조정을 추가하여 Dejelly 달걀10 M 코와 7.8에 PH). 역 유리 파스퇴르 pipet (직경 0.7 cm) 약 매 30 초와 부드럽게 소용돌이 계란을. 가만히 따르다과 부화하는 동안 두 번 신선한 시스테인로 교체하십시오. 달걀 비커의 맨 아래에있는 더 압축 된 층을 형성 할 때 dejellying 과정은 5-15 분 정도에 완료됩니다. </li><li> 시스테인 솔루션을 무시하고 0.25x MMR과 계란을 세 번 씻는다. 유리 pipet하여 솔루션의 소용돌이 계란합니다. &quot;나쁜&quot;달걀은 간단한 육안 검사에 의해 결정 및 외관의 &quot;띵띵 한&quot;하얀 있습니다. &quot;나쁜&quot;달걀은 회전 후 비커의 중심에 축적됩니다. 파스퇴르 pipet으로 &quot;나쁜&quot;계란을 제거합니다. </li><li> 달걀 용해 버퍼 (ELB) 세 번에 알을 씻으십시오. 파스퇴르 pipet하여 추가 &quot;나쁜&quot;계란을 제거합니다. 14 ML 팔콘 튜브에 달걀을 넣어. </li><li> 달걀을 압축 스윙 버킷 로터로 CL2 IEC 임상 테이블 상단 원심 분리기를 사용하여 188 XG (1,100 RPM)에서 55 초 동안 매 관을 봐. 에서 초과 버퍼를 제거계란 층의 꼭대기. Aprotinin / 류 펩틴 주식의 0.5 μl와 콤팩트 달걀 ML 당 Cytochalasin B 주식의 0.5 μl를 추가합니다. </li><li> 4에 15 분에 16,500 XG (10,000 RPM)에 달걀을 원심 분리기 ° C HB6 스윙 버킷 로터로 Sorvall RC6 플러스 빠른 속도의 원심 분리기를 사용합니다. 원심 분리 한 후, 계란은 관 3 층에 fractionated입니다 각각 지질, 추출 및 난황 / 위로부터 아래로 안료,. 21 G 바늘로 중간 추출물 층의 낮은 부분에 구멍 팔콘 튜브의 측면을. 펑 쳐링 바늘은 플라스틱에 의해 가려 수 있으므로 조심스럽게 바늘을 제거합니다. 추출물을 수집 할 수있는 주사 사이트에 1 ML의 주사기에 부착 된 새로운 21 G 바늘을 삽입합니다. 천천히 지방질과 난황 / 안료 레이어 기포 및 오염을 방지하기 위해 주사기로 추출물을 대기음. </li><li> 차가운 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 추출물를 놓습니다. 계란 추출물의 각 밀리리터를 들어,에서 다음 화학 주식 솔루션을 추가dicated 최종 농도 (괄호에 표시) : (1) 10 μl Cycloheximide (100 μg / ML), (2) 1 μl Aprotinin / 류 펩틴 (10 μg / ML 각), (3) 1 μl Cytochalasin B (5 μg / ML ), (4) 1 μl Dithiothreitol (1 MM) 및 (5) 0.33 μl Nocodazole (3 μg / ML). 계란이 부드럽게 적어도 10 배의 압축을 풉니 반전. 이 신선한 만들어 4 시간 이내에 사용하셔야합니다 LSE입니다. LSE의 품질은 4 시간이나 동결 - 해동 후 손상됩니다. </li></ol> 2. DNA 손상 접근법과 정자 염색질의 치료 <ol><li> 이전 13 설명한 방법에 따라 정상적인 정자 염색질을 준비합니다. </li><li> MMS - 처리 정자 염색질을 준비 <ol><li> 0.5 ML 버퍼 X.에서 정상적인 정자 염색질을 Resuspend </li><li> 100 mm의 최종 농도에 염색질을 resuspended 500 μl에 MMS의 ~ 5.5 μl (재고 9.1 M)을 추가합니다. </li><li> 회전 30 분 동안 실온에서 microcentrifuge 관 정자 염색질을 품다. </li><li> m을 돌려스윙 버킷 회 전자와 튜브 어댑터와 IEC CL2 임상 원심 분리기를 사용하여 실온에서 10 분에 686 XG (2,100 RPM)에서 icrocentrifuge 관. </li><li> 표면에 뜨는 취소하고 버퍼 X 플러스 BSA (3 %), DTT (0.1 ㎜) 및 Aprotinin / 류 펩틴 (10 μg / ML 각)의 0.5 ML에서 펠렛을 resuspend. </li><li> 단계 (4) 반복 (5) 두 번 정자 염색질을 씻어합니다. </li><li> hemocytometer로 정자 염색질의 농도를 결정하고 100,000 정자 / μl로 희석. 자세한 사용을위한 -80 ° C의 냉동고에 5 μl aliquots를 저장합니다. </li></ol></li><li> UV-처리 정자 염색질을 준비 <ol><li> Parafilm의 한 부분의 표면에 정상적인 정자 염색질의 원하는 금액을 (예 : 10 μl)를 추가합니다. </li><li> UV crosslinker로 Parafilm를 놓습니다. 실험에 따라 원하는 에너지 매개 변수를, 설정하고 UV 빛을 통해 정자 염색질을 손상하기 시작한다. 예를 들어, 1000 J / m 2에 도달하기 약 21 초 정도 소요됩니다. </li><li> UV irra 후diation, UV-처리 정자 염색질은 즉시 계란 추출물에 추가해야합니다. </li></ol></li></ol> 3. DNA 손상 -​​ 모방 구조의 준비 (AT70) <ol><li> 이 합성 oligonucleotides를 해산 폴리 - (다) 각각 70 (A70으로 지정) 및 폴리 (DT) 70 (T70로 지정) 2 μg / μl의 농도로 물에. </li><li> 한 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 A70의 100 μl와 T70 100 μl를 추가합니다. heatblock에서 95시 5 분 ° C에 혼합 합성 oligo 솔루션을 끓일. </li><li> 건조 목욕 블록 아웃을 (거기에 혼합 AT가 포함 된 튜브 사용) 해,하고 실험실 벤치에 실내 온도로 식혀 보자. 이 온도 조정은 45-60 분 주위에 걸립니다. </li><li> 냉각 혼합물은 2 μg / μl의 최종 농도에 AT70입니다. 자세한 사용을위한 -20 ° C의 냉동고에 AT70 aliquots의 스토어 10 μl. </li></ol> 4. 손상된 정자 염색질 또는 DNA의 손상과 LSE에서 DNA의 손상 세키가 실행- 모방 구조 <ol><li> 손상된 정자 염색질과 LSE에 DNA 손상 검사 점을 유도 <ol><li> 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 LSE의 50 μl를 추가하고 에너지 혼합물의 1 μl 및 손상된 정자 염색질 (최종 농도 ~ 4,000 정자 / μl 반응) 2 μl로 보완합니다. </li><li> 90 분 동안 실온에서 반응 관을 배양하고 관마다 10 분 버려야지. </li><li> 30 분 부화 후 핵 염색 솔루션의 1 μl를 보충 현미경 슬라이드에 반응 혼합물의 1 μl을 투여. 반응 혼합물을 통해 커버 슬립을 놓고 형광 현미경을 통해 핵 형성을 확인합니다. 일반적으로 둥근 핵은 DNA 복제가 시작했습니다 나타내는 부화 후 30 분 이후에 형성됩니다. </li><li> 샘플 버퍼의 90 μl로 반응 혼합물 10 μl보십시오. 샘플을 방지 Chk1 P-S344 또는 안티 Chk1 항체를 사용하여 immunoblotting을 통해 분석하고 있습니다. </li></ol></li><li> 와 LSE에 DNA 손상 검사 점을 유도AT70 <ol><li> 에너지 혼합물의 1 μl와 Tautomycin 주식의 1.6 μl를 보충 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 LSE의 50 μl를 추가합니다. </li><li> 각 반응에 미리 만든 AT70 (2 μg / μl) 또는 물 (대조군) 중 1.25 μl를 추가합니다. 90 분 동안 실온에서 반응을 품다. 반응 관마다 10 분 영화. </li><li> 샘플 버퍼의 90 μl로 반응 혼합물 10 μl를 추가합니다. 샘플을 방지 Chk1 P-S344 또는 안티 Chk1 항체를 사용하여 immunoblotting을 통해 검토하고 있습니다. </li></ol></li></ol> 5. 대표 결과 손상된 정자 염색질 또는 DNA 손상 - 모방 구조는 Xenopus 계란 추출물 시스템에서 ATR/Chk1-mediated DNA 손상 검사 점을 실행할 수 있습니다. MMS는의 지표 Ser344에서 Chk1 인산화 (Chk1 P-S344)를 유도하는 그림 2A 쇼는 ATR의 키나제의 활성화. 그림 2B는 AT70, DNA 등의 손상 - 모방 stru 보여줍니다cture도 Chk1 인산화를 트리거합니다. 총 Chk1 샘플은 두 예에서 컨트롤을로드로 사용됩니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4449/4449fig1.jpg" /> 1 그림. DNA 손상 검사 점 신호의 다이어그램. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4449/4449fig2.jpg" /> 그림 2. Chk1 인산화는 MMS 또는 Xenopus 달걀 추출물의 AT70 치료에 의해 ​​유도된다. (A) MMS-손상된 정자 염색질 (MMS) 또는 일반 정자 염색질 (절약)가 90 분에 계란 추출물에 incubated 수 있습니다. Chk1 Ser344의 인산화 (Chk1 P-S344)과 계란 추출물의 총 Chk1는 immunoblotting을 통해 조사하고 있습니다. (B) AT70 또는 물 (절약) 각각, 달걀 추출물에 추가됩니다. 샘플도 (A)에서와 같이 immunoblotting을 통해 분석하고 있습니다.

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

Xenopus 계란 추출물을 사용하여 DNA 손상 검사 점을 연구의 몇 가지 장점이 있습니다. 계란 추출물의 사용은 세포주기의 계면에서 동기화 셀 - 무료 추출물 대량를 제공합니다. 계란 추출물 쉽게 저렴한 비용으로 만들 수 있습니다. 이 DNA 나 염색질을 손상하고 계란 추출물에서 대상 단백질을 immunodepleting 후 DNA 손상 검사 점의 결함을 나타 내기 위해 상대적으로 쉽습니다. 그 후, 잠재적 인 기능 결함은 야생 유형 또는 돌연변이 재조합 단백질의 addback하여 &quot;구조&quot;가 될 수 있습니다. 따라서, Xenopus 계란 추출물은 DNA 손상 검사 점의 구조와 기능 분석을위한 강력한 모델 시스템입니다. LSE 준비는 이전에 14 시연,하지만 우리 프로토콜은 일부 수정이되었습니다. hCG 주사 (18 ° C) 한 후 개구리 잠복기의 온도는 누워있는 계란 매우 중요합니다. 개구리를 처리하고 주입의 더 많은 리소스를 찾을 수 있습니다이전 연구 13,14에서와 같은 인터넷에서 <a href="http://tropicalis.berkeley.edu/home/obtaining_embryos/hcg/hCG.html" target="_blank">tropicalis.berkeley.edu / home에 / obtaining_embryos / hCG.html / hcg</a> . 일반적으로, LSE 1-3의 ML은 한 개구리에서 파생 된 계란에서 준비하실 수 있습니다. 이 LSE를 준비 약 1 시간 소요하고 주변을 4 시간 동안 얼음에 일반적으로 안정적이다. LSE는이 DNA 손상 검사 점 실험에 사용 LSE의 품질을 동결 타협을 해동 후 필요한 경우 신선한 만들어해야합니다. 단계 1.9에서 우리는, 주식 솔루션을 냉동고에 aliquots를 저장하고 각 화학 물질에 대한 냉동 aliquoted 주식을 사용하는 것이 좋습니다. 우리의 경험에서 이러한 aliquots에는 최대 3 개의 냉동 해동 사이클에 대한 사용할 수 있습니다. 이러한 MMS와 같은 DNA 손상 시약은 Chk1 인산화를 (그림 2A 참조) 실행을 위해 LSE에서 검사되었습니다. DNA 손상 시약은 어느 LSE에 직접 추가하거나 SP를 손상하는 데 사용할 수 있습니다LSE에 추가​​하기 전에 음의 염색질. DNA 손상 시약의 농도는 가능성이 가장 높은 Chk1 인산화를 실행하는 가장 좋은 조건을 얻기 위해 특정 실험에 최적화해야합니다. UV 조사도 Chk1 인산화 (데이터 미도시)를 통해 피해 정자 염색질과 DNA 손상 검사 점의 연구 활성화에 활용 할 수 있습니다. Xenopus의 Chk1 인산화 사이트 Ser344 인간 8 Chk1 Ser345에 유사 보존 사이트입니다. 합성 oligo AT70의 혼합물은 DNA 손상의 구조를 모방 한 것이 었지요. Tautomycin (인산 가수 분해 효소 억제제)의 존재에 AT70 유발 Chk1의 인산화가 안정화되고 (그림 2B 참조) immunoblotting을 통해 검사를 할 수 있습니다. 총 내생의 Chk1은로드 제어로 사용됩니다. AT70는 Chk1이 phosphorylated된다 나타내는 서양 얼룩에 시각화 할 수 있습니다 총 Chk1의 이동 변화를 트리거합니다. Chk1 인산화에 대한 항체그리고 총 Chk1는 Xenopus의 DNA 손상 검사 점 신호의 분석을 immunoblotting에 적합합니다. 전반적으로, Xenopus의 알 추출물 시스템은 DNA 손상 검사 점을 조사 할 수있는 강력한 셀 - 무료 모델 시스템입니다. 이 프로토콜은 분석을위한 자세한 절차를 제공합니다. 이 시스템은 서로 다른 DNA 손상 방법의 다양한 사용하여 DNA 손상 검사 점의 분자 메커니즘을 연구 할 수 조절 할 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> 시약 </td></tr><tr><td> 안티 Chk1 P-S344 항체 </td><td> 셀 시그널링 </td><td> 2348L </td><td></td></tr><tr><td> 안티 Chk1 항체 </td><td> 산타 크루즈 (Santa Cruz) </td><td> SC7898 </td><td></td></tr><tr><td> Aprotinin </td><td> MP의 Biomedicals </td><td> 0219115880 </td><td></td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> 시그마 </td><td> C7698-5G </td><td></td></tr><tr><td> Cytochalasin B </td><td> EMD </td><td> 250233 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiothreitol (DTT) </td><td> VWR </td><td> JTF780-2 </td><td></td></tr><tr><td> hCG </td><td> 시그마 </td><td> CG10-10VL </td><td></td></tr><tr><td> L-시스테인 </td><td> 시그마 </td><td> C7352-1KG </td><td></td></tr><tr><td> 류 펩틴 </td><td> VWR </td><td>97063-922 </td><td></td></tr><tr><td> 메틸 methanesulfonate (MMS) </td><td> 시그마 </td><td> 129925-5G </td><td></td></tr><tr><td> Nocodazole </td><td> 시그마 </td><td> M1404-2MG </td><td></td></tr><tr><td> PMSG </td><td> Calbiochem </td><td> 367222 </td><td></td></tr><tr><td> 샘플 버퍼 </td><td> 시그마 </td><td> S3401 </td><td></td></tr><tr><td> Tautomycin </td><td> 와코 화학 USA </td><td> 209-12041 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 장비 </td></tr><tr><td> 누워있는 계란에 대한 버킷 </td><td> Rubbermaid 상용 제품 </td><td> 6308 </td><td></td></tr><tr><td> 스윙 버킷 회와 CL2 IEC의 원심 분리기 </td><td> 열 과학 </td><td> 004260F </td><td></td></tr><tr><td> HB6 스윙 버킷 회 </td><td> 열 과학 </td><td> 11,860 </td><td></td></tr><tr><td> Sorvall RC6 플러스 빠른 속도의 원심 분리기 </td><td> 열 과학 </td><td> 46,910 </td><td></td></tr><tr><td> UV crosslinker </td><td> UVP </td><td> 95-0174-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 솔루션 </td></tr><tr><td> 1X MMR </td><td></td><td></td><td> 100 MM NaCl, 2 MM KCl, 0.5 MM MgSO 4, 2.5 MM CaCl 2, 5 MM HEPES는 10 M NaOH를 7.8로 pH를 조정 </td></tr><tr><td> Aprotinin / 류 펩틴 재고 </td><td></td><td></td><td> 10 MG / ML 각 물 인치 -80 ° C.에 20 μl aliquots를 저장 </td></tr><tr><td> 버퍼 X </td><td></td><td></td><td> 0.2 M의 자당, 80 MM KCl, 15 MM NaCl, 5 MM MgCl 2, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 10 MM의 HEPES는 HCL에서 7.5으로 pH를 조정 </td></tr><tr><td> Cycloheximide 재고 </td><td></td><td></td><td> 1물에 0 MG / ML. -20 ° C.에 저장 한 ML의 aliquots </td></tr><tr><td> Cytochalasin B 주식 </td><td></td><td></td><td> DMSO 5 MG / ML. -20 ° C.에 20 μl aliquots를 저장 </td></tr><tr><td> Dithiothreitol (DTT) 주식 </td><td></td><td></td><td> 물에 1 M. -20 ° C.에 저장 한 ML의 aliquots </td></tr><tr><td> ELB </td><td></td><td></td><td> 0.25 M의 자당, 1 MM DTT, 50 μg / ML cycloheximide, 2.5 MM MgCl 2, 50 MM KCl, 10 MM의 HEPES, pH7.7 </td></tr><tr><td> Nocodazole 주식 </td><td></td><td></td><td> DMSO 10 MG / ML. -80 ° C.에서 5 μl aliquots를 저장 </td></tr><tr><td> 에너지 혼합 </td><td></td><td></td><td> 375 밀리미터 크레아틴 인산, 50 MM ATP, 25 MM MgCl 2. Aliquots는 -80 ° C.에 저장됩니다 </td></tr><tr><td> 핵 염색 솔루션 </td><td></td><td></td><td> 0.4 μg / ML Hoechst 33258, 25 % 글리세롤(V / V)에 1X PBS </td></tr><tr><td> Tautomycin 재고 </td><td></td><td></td><td> DMSO 100 μM. -80 ° C.에서 10 μl aliquots를 저장 </td></tr></tbody></table>

study of the dna damage checkpoint using xenopus egg extracts

매일, 세포 내생과 환경 모욕 다양한를 받게됩니다. 이러한 모욕을 방지하기 위해, 세포가 DNA 손상에 DNA 손상 및 직접 세포 반응을 감지 할 수있는 감시 장치로 신호 DNA 손상 검사 점을 발전시켜 왔습니다. DNA 손상 검사 점 신호 (그림 1)에 참여 센서, 트랜스 듀서 및 effectors라는 단백질의 여러 그룹이 있습니다. 이 복잡​​한 신호 경로에서 ATR (ATM 및 Rad3 관련)은 DNA 손상 및 복제 스트레스에 응답 할 수있는 주요 kinases 중 하나입니다. 활성화 ATR은 Chk1 아니라 그 하류 기판 (세키 키나제 1) phosphorylate 할 수 있습니다. 따라서, phosphorylated 및 세포주기 체포, 전사 활성화, DNA 손상 수리 및 apoptosis 또는 노화 (그림 1)을 포함하여 DNA 손상 검사 점의 여러 다운 스트림 효과 Chk1 리드를 활성화. DNA가 손상되면 unrep에서 DNA 손상 검사 점 결과를 활성화하기 위해 실패방송 손상과, 이후, 게놈 불안정성. DNA 손상 검사 점의 연구는 세포 게놈 무결성을 유지하는 방법 명료하게하다와 같은 암 등 인간의 질병이 개발 방법에 대한 이해를 제공 할 것입니다. Xenopus laevis 계란 추출물은 DNA 손상 검사 점의 연구에 강력한 셀 - 무료 추출 모델 시스템으로 등장하고 있습니다. 저속 추출물 (LSE)가 처음 Masui 그룹 1에 의해 설명되었다. DNA 한 번 세포주기 당 semiconservative 방식으로 복제 핵 형성에 LSE 결과 demembranated 정자 염색질의 추가. ATR/Chk1-mediated 검사 점 신호 경로는 DNA가 손상되거나 복제 스트레스를 2로 실행됩니다. DNA 손상 접근 방식과 DNA 손상 - 모방 구조 3 : 두 가지 방법은 현재 DNA 손상 검사 점을 유발하는 데 사용됩니다. DNA 손상은 자외선 (UV) 조사, γ-방사선, 메틸 나게 의해 유도 될 수esulfonate (MMS), 미토 마이신 C (MMC), 4 nitroquinoline-1-산화물 (4 NQO) 또는 aphidicolin 3, 4. MMS는 DNA 복제를 억제하고 ATR/Chk1-mediated DNA 손상 검사 점은 4-7 활성화 alkylating 요원입니다. UV 조사는 또한 ATR/Chk1-dependent DNA 손상 검사 점 8 트리거합니다. DNA 손상 -​​ 모방 구조 AT70 두 oligonucleotides 폴리 (DA) 70 폴리 (DT) 70 annealed 복잡합니다. AT70 시스템은 빌 Dunphy의 연구실에서 개발 된 널리 9-12 ATR/Chk1 검사 점 (Checkpoint) 신호를 유도하는 데 사용됩니다. 여기, 우리는 (2) DNA 손상 - 모방 구조를 준비하기 위해 두 개의 서로 다른 DNA 손상 방식 (MMS와 UV), (3) Xenopus의 정자 염색질을 치료하는 세포 무료 달걀 추출물 (LSE)를 준비하는 프로토콜은 (1) 설명 AT70, 그리고 (4) 손상된 정자 염색질 또는 DNA 손상 -​​ 모방 구조 LSE에 ATR/Chk1-mediated DNA 손상 검사 점을 실행할 수 있습니다.

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Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Xenopus 계란 추출물은 DNA 손상 검사 점을 조사 할 수있는 유용한 모델 시스템입니다. 이 프로토콜은 Xenopus의 알 추출물과 DNA 손상 검사 점 유도 시약의 준비입니다. 이 기술은 DNA 손상 검사 점 신호의 연구에서 DNA 손상 방식의 다양한에 적용 할 수 있습니다.

사용하여 DNA의 손상 세키의 연구<em&gt; Xenopus</em&gt; 달걀 압축을 풉니 다

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

16.6K 조회수.  University of North Carolina at Charlotte. Xenopus 계란 추출물은 DNA 손상 검사 점을 조사 할 수있는 유용한 모델 시스템입니다. 이 프로토콜은 Xenopus의 알 추출물과 DNA 손상 검사 점 유도 시약의 준비입니다. 이 기술은 DNA 손상 검사 점 신호의 연구에서 DNA 손상 방식의 다양한에 적용 할 수 있습니다.

비디오: Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

도마뱀의 운동의 속도와 방향에 시각 민감도 테스트

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

연구

생물학

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In particular, understanding the constraints on visual signal design for communication has been of great interest. Traditional methods for investigating animal interactions have used basic observational techniques, staged encounters, or physical manipulation of morphology. Less intrusive methods have tried to simulate conspecifics using crude playback tools, such as mirrors, still images, or models. As technology has become more advanced, video playback has emerged as another tool in which to examine visual communication (Rosenthal, 2000). However, to move one step further, the application of computer-animation now allows researchers to specifically isolate critical components necessary to elicit social responses from conspecifics, and manipulate these features to control interactions. Here, I provide detail on how to create an animation using the Jacky dragon as a model, but this process may be adaptable for other species. In building the animation, I elected to use Lightwave  3D to alter object morphology, add texture, install bones, and provide comparable weight shading that prevents exaggerated movement. The animation is then matched to select motor patterns to replicate critical movement features. Finally, the sequence must rendered into an individual clip for presentation. Although there are other adaptable techniques, this particular method had been demonstrated to be effective in eliciting both conspicuous and social responses in staged interactions.

Computer-generated stimuli using the Jacky dragon as a model.

컴퓨터가 만든 동물 모델 자극

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Xenopus laevis 에그의 작성과 분류는 압축을 풉니다

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Fractionated Xenopus 에그 추출물을 사용하여 체외 핵 어셈블리

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to generate maternal-effect mutant animals. Additionally, many of the techniques to overexpress or inhibit gene function in organisms such as Xenopus and zebrafish fail to sufficiently target critical maternal signaling pathways, such as Wnt signaling. In Xenopus, manipulating gene function in cultured oocytes and subsequently fertilizing them can ameliorate these problems to some extent. Oocytes are manually defolliculated from donor ovary tissue, injected or treated in culture as desired, and then stimulated with progesterone to induce maturation. Next, the oocytes are introduced into the body cavity of an ovulating host female frog, whereupon they will be translocated through the host's oviduct and acquire modifications and jelly coats necessary for fertilization. The resulting embryos can then be raised to the desired stage and analyzed for the effects of any experimental perturbations. This host-transfer method has been highly effective in uncovering basic mechanisms of early development and allows a wide range of experimental possibilities not available in any other vertebrate model organism.

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Procedure for fertilizing Xenopus oocytes by the host transfer method.

의 수정 Xenopus의 oocytes 호스트 전송 방법을 사용하여

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate mutations and chromosomal aberrations1. To prevent this trauma from catalyzing genomic instability, it is crucial for cells to detect DSBs, activate the DNA damage response (DDR), and repair the DNA. When stimulated, the DDR works to preserve genomic integrity by triggering cell cycle arrest to allow for repair to take place or force the cell to undergo apoptosis. The predominant mechanisms of DSB repair occur through nonhomologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR) (reviewed in2). There are many proteins whose activities must be precisely orchestrated for the DDR to function properly. Herein, we describe a method for 2- and 3-dimensional (D) visualization of one of these proteins, 53BP1.
The p53-binding protein 1 (53BP1) localizes to areas of DSBs by binding to modified histones3,4, forming foci within 5-15 minutes5. The histone modifications and recruitment of 53BP1 and other DDR proteins to DSB sites are believed to facilitate the structural rearrangement of chromatin around areas of damage and contribute to DNA repair6. Beyond direct participation in repair, additional roles have been described for 53BP1 in the DDR, such as regulating an intra-S checkpoint, a G2/M checkpoint, and activating downstream DDR proteins7-9. Recently, it was discovered that 53BP1 does not form foci in response to DNA damage induced during mitosis, instead waiting for cells to enter G1 before localizing to the vicinity of DSBs6. DDR proteins such as 53BP1 have been found to associate with mitotic structures (such as kinetochores) during the progression through mitosis10.
In this protocol we describe the use of 2- and 3-D live cell imaging to visualize the formation of 53BP1 foci in response to the DNA damaging agent camptothecin (CPT), as well as 53BP1's behavior during mitosis. Camptothecin is a topoisomerase I inhibitor that primarily causes DSBs during DNA replication. To accomplish this, we used a previously described 53BP1-mCherry fluorescent fusion protein construct consisting of a 53BP1 protein domain able to bind DSBs11. In addition, we used a histone H2B-GFP fluorescent fusion protein construct able to monitor chromatin dynamics throughout the cell cycle but in particular during mitosis12. Live cell imaging in multiple dimensions is an excellent tool to deepen our understanding of the function of DDR proteins in eukaryotic cells.

This protocol describes a method for visualizing a DNA double-strand break signaling protein activated in response to DNA damage as well as its localization during mitosis.

DNA의 손상 응답 단백질의 2와 3 차원 라이브 셀 이미징

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Many organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated that the majority of the transcriptome is localized to a nonrandom position in cells and embryos. One approach to identify localized mRNAs is to biochemically purify a cellular structure of interest and to identify all associated transcripts. Using recently developed high-throughput sequencing technologies it is now straightforward to identify all RNAs associated with a subcellular structure. To facilitate transcript identification it is necessary to work with an organism with a fully sequenced genome. One attractive system for the biochemical purification of subcellular structures are egg extracts produced from the frog Xenopus laevis. However, X. laevis currently does not have a fully sequenced genome, which hampers transcript identification. In this article we describe a method to produce egg extracts from a related frog, X. tropicalis, that has a fully sequenced genome. We provide details for microtubule polymerization, purification and transcript isolation. While this article describes a specific method for identification of microtubule-associated transcripts, we believe that it will be easily applied to other subcellular structures and will provide a powerful method for identification of localized RNAs.

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

We describe the collection of unfertilized Xenopus tropicalis eggs and production of a meiosis II-arrested egg extract. This egg extract can be used to purify microtubules and microtubule-associated RNAs.

생산<em&gt; Xenopus의 tropicalis</em&gt; 달걀은 미세 소관 관련 RNA를 식별하기 위해 추출

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

β-catenin의 저하의 재구성<em&gt; Xenopus의</em&gt; 계란 추출

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

마우스 골격근에있는 검색, 탐지 DNA 손상 분석<em&gt; 현장에서</em&gt; TUNEL 방법을 사용하여

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

레트로 바이러스 통합 사이트의 증폭, 차세대 시퀀싱 및 게놈 DNA 매핑

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

사용하여 DNA의 손상 세키의 연구

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