연구는 전문 개발 및 연구 시작 자금 기술 온타리오 연구소 (UOIT)의 대학에서 박사 존 A. Samis와 이리나 레비 타스 라에 건강 연구 건강 전문 학생 연구 상 캐나다 연수를 지원했다. 저자는 동영상을 준비 그녀의 도움 섀넌 에버렛 (Everett)을 (교육 및 학습 센터, UOIT)을 인정합니다. 저자는 자신의 멘토링, 통찰력, 그리고 도움이 토론에 박사는 마이클 E. Nesheim을 (생화학 부, ON 여왕의 대학, 킹스턴)을 인정합니다. 저자는 또한 연구에 사용 된 DIC 환자 플라즈마를 제공하는 박사 쳉 호크 토를 (로알 드 달의 Haemostasis 및 혈전증 센터, 로얄 리버풀 대학 병원, 리버풀, 영국)을 인정합니다.

1. FV-부족한 인간 플라즈마의 작성 <ol><li> 이 방법은 원래 블룸 외 4에 기술 된 절차의 수정입니다. </li><li> 어떤 약을 복용하지 않습니다 - 동의 건강한 성인 자원 봉사자 (50 세 남성 또는 여성, 18 세)에서 전체 인간의 피를 구합니다. 라텍스 장갑과 절차를 통해 실험실 코트를 착용하십시오. </li><li> 3.2 % (w / V) 증류수에 trisodium의 구연산의 100 ML을 준비합니다. 별도의 60 ML의 주사기에이 솔루션의 6.0 ML를로드합니다. 조심스럽게 주사기에 6.0 ML 마크에 대한 우울한 플런저에 의해 공기를 제거합니다. </li><li> bicep와 팔 사이 cubital 정맥의 장소를 청소하기 위해 알코올 면봉을 사용합니다. 3 ML의 주사기 20 게이지 나비 장치를 연결합니다. cubital 정맥에 나비 바늘을 삽입하고 혈액은 3 ML 마크에 가득 할 때까지 플런저를 부드럽게립니다. 피를 주사기를 폐기하십시오. 이 단계는 바늘에 손상된 내피에서 출시 조직의 요소를 제거하는 수행됩니다응고 과정을 활성화하고 FV-결함 플라즈마의 준비를 방해 할 수 있습니다 부상 사이트입니다. </li><li> 나비 바늘 60 ML의 주사기와 &#39;로드&#39;6.0 ML trisodium의 구연산으로 연결하고 피가 주사기에 60 ML에 도달 할 때까지 플런저를 부드럽게립니다. (최종 구연산 농도 10.9mM). </li><li> 나비 바늘에서 주사기를 제거하고 주사기 콘센트에 장갑 낀 손가락 또는 엄지 손가락을 유지하면서 부드럽게 주사기를 섞는다. </li><li> 60 ML 주사기 위에서 설명한대로 3.2 % trisodium의 구연산의 6.0 ML로 가득 각각에 혈액을 그리기 계속합니다. 하나는 원심 분리 후와 FV-결함 플라즈마의 50 μl가 microplate 분석에서 샘플 당되는 플라즈마로 citrated 혈액 양의 약 50 % 회복을 예상해야합니다. 저희 연구실은 정기적으로 3.2 % trisodium의 구연산 / 주사기의 6.0 ML로 5-7 X 60 ML의 주사기 각을 사용하여 한 번에 citrated 혈액 300-420 ML을 처리합니다. 이 약 3,000 마이크로에 대한 충분한 FV-결함 플라즈마입니다판 assays (아래 참조). </li><li> 자원 봉사의 팔에서 나비 바늘을 제거하고 1.0 분 동안 정맥 주사의 사이트를 통해 멸균 거즈 패드를 누르십시오. 멸균 붕대로 정맥 주사의 사이트를 다룹니다. </li><li> 실온에서 20 분에 3,300 XG에서 citrated 혈액을 원심 분리기. 하단 빨간색과 흰색 혈액 세포 레이어를 방해하지 돌봐 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 저어 바있는 플라스틱 비커에 상단 노란색 플라즈마 층을 복구 할 수 있습니다. </li><li> 측정 ML의 플라즈마의 볼륨과 미래 프로트롬빈 응고 시간 (PT) 테스트 (아래 참조)를 얼음에 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 첨가하기 전에 플라즈마의 100 μl을 유지합니다. </li><li> 천천히 5mM 달성하기 위해 실온에서 부드럽게 저어을 citrated 플라즈마에 고체 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 추가 (최종 농도). EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)가 해산되면, 부드러운 감동과 1.0M NaOH의 dropwise 추가하여 7.0으로 산도를 조정합니다. </li><li> 37 교반하지 않고 8-10 시간에 비닐 랩 및 배양과 비커를 커버 ° C. </li><li> 모든 2 시간은 100 μl를 복구EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 취급 얼음에 플라즈마하고 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 부화시 태평양 표준시를 결정하는 사​​전 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 추가 (위 참조)에 플라즈마의 태평양 표준시에 비교합니다. </li><li> 태평양 표준시의 결정에 대해, microplate 리더로 ​​플라스틱 템플릿 홀더와 인서트로 대신 이동식 팔 잘 immunomodule 스트립. </li><li> 등의 microplate 리더의 동양의 immunomodule 스트립 : 빈, 비어있는, 샘플, 빈, 빈, 샘플, 샘플이 포함 된 스트립 이웃에서 빛이 산란 간섭을 최소화 할 빈, 그리고 왼쪽에서 템플릿 홀더의 오른쪽에있는 빈. 또한, 플라스틱 템플릿 소유자의 가장자리에서 빛이 산란 간섭을 최소화하기 위해 각 8 잘 immunomodule 스트립의 하단으로 상단에서 단 우물 2-7 사용합니다. </li><li> FV microplate 분석 동시에 12 개 이상의 서로 다른 샘플 (2 immunomodule 스트립 이상 immunomodule 스트립 당 6 샘플)에서 섬유소 응고 형성을 측정 할 수 있습니다. </li><li> 멀티 채널 피펫 사용에 HBS의 50 μl를 (20mM HEPES, 150mM NaCl, 산도 7.4) 추가각 microplate 잘 샘플의 각 assayed되어 있어야합니다. 하나의 피펫 사용하여 microplate 우물을 분리 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 추가 한 후 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 또한 전이나 다양한 배양 시간에 정상적인 인간 풀링 참조 플라즈마 (NHP) 또는 플라즈마의 50 μl를 추가합니다. </li><li> 멀티 채널 피펫 사용 assayed 할 플라즈마를 사용하는 모든 microplate 우물 50 μl thromboplastin을 (준비 방법은 아래를 참조)를 추가합니다. 1 분 및 1 분 부화의 15-25 초 동안 판을 흔들 수있는 프로그램 microplate 리더에 대해 25 ° C에서 microplate 리더에 품다. </li><li> microplate 리더, 액세스 SoftMax Pro 소프트웨어 microplate 응용 프로그램을 연결할 컴퓨터를 사용합니다. 흡광도, 405nm에 파장, 키네틱, 온도 모드 25 ° C 및 프로그램 microplate 리더는 5 초에 흔들, 6 분 동안 매 5 초 405nm에서 흡광도를 읽어.에 독자를 설정 </li><li> 2.1mM 에서야, 멀티 채널 피펫 사용 (증류수에 25mM의 50 μl 염화칼슘을 추가난 농도)는 microplate 우물의 모든 15 초를 기다린 분석을 시작하기 위해 microplate SoftMax 프로 메뉴에서 &#39;시작&#39;아이콘을 누릅니다. </li><li> 시간이 405nm에서 흡광도의 반 최대 증가 (thromboplastin과 칼슘 염화물 추가 한 후에 생산 sigmoidal 흡광도 대 시간 곡선의 중간 지점. 아래를 참조를 도달하기로 SoftMax Pro의 흡광도 대 시간 프로필에서 포인트를 결정 그림 1). </li><li> 그림 2A에 아래 그림과 같이 로그 응고 시간 (초) 대 로그 FV 활동 (단위 / ML)에서 FV 1 단계 활동을 계산할 수 있습니다. quantitation를 위해, FV 활동 1Unit는 사전 추가 트롬빈 (FV 1 단계 및 2 단계 microplate 응고 분석과 인간의 플라즈마 샘플을 시금 아래 참조) 의도적 활성화에 1.0 ML NHP의 활동 선물로 정의됩니다. </li><li> 부드러운 저어와 증류수에 0.15M NaCl을 포함하는 20mM HEPES의 4.0l를 준비합니다. 속도가 느린 dropw과 7.4로 pH를 조정5.0M NaOH의 이세 추가 (HBS, 산도 7.4). </li><li> 투석 튜브의 충분한 길이를 확보하고 증류수로 철저히 씻어. 튜브의 한쪽 끝에서 매듭을 묶게. 전송 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)는 플라스틱 전송 피펫으로 투석 튜브에 플라즈마를 처리, 공기를 제거하고 튜브의 다른 쪽 끝에서 매듭을 묶게. </li><li> 조심스럽게 부드러운 저어와 HBS에 튜브에서 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 처리 플라즈마을 설치하면 되요. 비닐 랩으로 덮어, 4 ° C.에 부드럽게 저어와 14-16h에 대한 dialyze </li><li> 주의 깊게 15.0 ML 나사 덮인 관에 3.0 ML의 aliquots에 EDTA-treated/dialyzed 플라즈마를 제거하고 얼음에서 &#39;최종&#39;FV-결함 플라즈마의 태평양 표준시 분석 100 μl을 유지합니다. -80 ° C에서 사용까지의 FV-결함 플라즈마를 저장합니다. 위에 설명 된 조건 하에서, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 첨가 한 후 90-100 초 8-10 시간에 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 첨가하기 전에 10-15 초에서 포인트 증가. 이 방법으로 준비 FV-결함 플라즈마는 정기적으로 시작의 활성 FV 존재 미만 0.1 %를 포함신선한 인간의 플라즈마. </li></ol> 2. Thromboplastin의 작성 <ol><li> 투석은 응고 과정을 시작하려면 칼슘 염화물 추가의 시간에서 정확하게 타이밍 섬유소 응고 형성을 허용하기 위해이 시약의 모든 칼슘을 제거해야합니다. </li><li> 부드러운 저어와 플라스틱 비커에 증류수에 100 ML와 4.0l 20mM HEPES와 0.15M NaCl을 준비합니다. 5.0M NaOH (HBS, 산도 7.4)의 느린 dropwise 추가로 7.4로 산도를 조정합니다. </li><li> thromboplastin 시약의 각 유리 병에 HBS, 산도 7.4의 6.0 ML를 추가 뚜껑을 교체하고, 분해하고 부드럽게 흔들. 말린 재료를 해산하기 위해 상온에서 15 분에 덮힌 시험관에 시약을 품다. 완전히 용해에 부드럽게 흔들어. </li><li> , 투석 튜브의 충분한 길이를 잘라 증류수에 잘 헹구고, 매듭과 튜브의 한쪽 끝을 묶어. 투석 튜브에 thromboplastin을 전송, 공기를 제거하고 매듭과 튜브의 다른 쪽 끝을 묶을. </li><li> 칼슘refully HBS, 산도 7.4의 4.0l에 투석 튜브를 다짐하고 부드럽게 14-16 시간에 대해 4 ° C에서 비닐 랩으로 덮여 젓는다. </li><li> 사용 ° C까지 -80에서 15 ML 나사 덮인 튜브 및 저장소에 dialyzed thromboplastin의 3.0 ML의 aliquots를 전송합니다. </li></ol> 3. FV의 준비 1 단계 Microplate 응고 분석 활동 표준 곡선 <ol><li> 10 분 동안 37 ° C에서 FV-결함 플라즈마, NHP, 그리고 thromboplastin을 해동. 부드럽게, 독립적 FV-결함 플라즈마 및 thromboplastin를 섞어 플라스틱 세탁기 트레이를 분리 전송하고 얼음에 품다. 부드럽게 혼합 한 후 얼음에 NHP를 저장합니다. 실온에서 별도의 세척 작업 표시 줄의 저장 염화칼슘 (증류수에 25mM). </li><li> , 2 - - 4 -, 8 -, 16 -, 32 -, 64 -, 128 -, 256-200 μl 0에서 NHP의 2 배 시리얼 dilutions의 각 준비, HBS의 512 배, 산도 7.4 1.5을 사용하여 ML의 microcentrifuge 튜브. 잘 와동과 얼음을 품다. </li><li> P에 이동식 팔 잘 immunomodule 스트립을 삽입합니다microplate 리더로 ​​lastic 템플릿 홀더와 삽입합니다. </li><li> 등의 microplate 리더의 동양의 immunomodule 스트립 : 빈, 비어있는, 샘플, 빈, 빈, 샘플, 샘플이 포함 된 스트립 이웃에서 빛이 산란 간섭을 최소화 할 빈, 그리고 왼쪽에서 템플릿 홀더의 오른쪽에있는 빈. 또한, 플라스틱 템플릿 소유자의 가장자리에서 빛이 산란 간섭을 최소화하기 위해 각 8 잘 immunomodule 스트립의 하단으로 상단에서 단 우물 2-7 사용합니다. </li><li> FV microplate 분석 동시에 12 개 이상의 서로 다른 샘플 (2 immunomodule 스트립 이상 immunomodule 스트립 당 6 샘플)에서 섬유소 응고 형성을 측정 할 수 있습니다. </li><li> microplate 리더 및 액세스 SoftMax 프로 microplate 응용 프로그램 소프트웨어를 사용합니다. </li><li> 멀티 채널 피펫 사용하여, 모든 샘플 microplate 우물에 FV-결함 플라즈마 (50 μl)의 동시 추가를합니다. microplate 우물을 분리하려면 위의 준비 NHP의 10 시리얼 dilutions의 50 μl를 추가 한 피펫을 사용합니다.</li><li> 멀티 채널 피펫 사용하여, 모든 샘플 우물에 thromboplastin을 (50 μl)를 추가합니다. 1 분 부화의 15-25 초 동안 판을 흔들 1 분 및 프로그램 microplate 리더에 대한 25 microplate 리더 ° C에서 알을 품다. </li><li> microplate 리더, 액세스 SoftMax Pro 소프트웨어 microplate 응용 프로그램을 연결할 컴퓨터를 사용합니다. 흡광도, 405nm로 파장, 키네틱, 25에 온도 ° 이후 6 분마다 5 초 405nm에서 C, 그리고 칼슘 염화물 추가 한 후 처음 5 초에 대항 할 프로그램 microplate 리더 및 측정 흡광도.에 모드로 독자를 설정 5 초 진동 간격은 (아래) 계산 된 응고 시간에 포함되지 않습니다. </li><li> 채널 피펫을 사용하여 염화칼슘 (증류수에 25mM의 50 μl, 최종 농도 3.5mM)을 추가하는 샘플 microplate 우물까지를 시작하려면 컴퓨터에서 15 초, 보도 SoftMax Pro의 microplate 응용 프로그램에서 &#39;시작&#39;아이콘을 기다리 검정. </li><li> 티그는 응고 시간은 thromboplastin과 칼슘 염화물 추가 한 후에 405nm에서 최소 및 최대 흡광도 사이의 중간 지점에 도달하는 시간 (초)의 시간으로 계산됩니다. </li><li> 응고 형성의 초기 속도는 흡광도 대 시간 곡선의 선형 부분에 응고 형성의 첫 5 번 포인트를 포함 405nm에서 흡광도 증가의 속도 (mUnits / 분)로 계산됩니다. </li><li> 응고 형성의 정도는 응고 형성 이벤트 기간 동안 달성 405nm (단위)에서 최대와 최소한의 흡광도의 차이로 계산되었다. </li></ol> 4. FV 1 단계 및 2 단계 Microplate 응고 분석과 인간 플라즈마 샘플을 시금 <ol><li> 10 분 동안 37 ° C에서 FV-결함 플라즈마, NHP, 샘플 플라즈마 및 thromboplastin을 해동. 부드럽게, 독립적 FV-결함 플라즈마 및 thromboplastin를 섞어 플라스틱 엘리사 세척 트레이를 분리 전송하고 얼음에 품다. 얼음에 NHP 및 샘플 플라즈마를 저장부드럽게 혼합 후. 실온에서 별도의 엘리사 세척 작업 표시 줄에 저장 염화칼슘 (증류수에 25mM). </li><li> 200 μl 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브를 사용하여 HBS, 산도 7.4의 NHP 및 샘플 플라즈마의 40 배 dilutions을 각각 준비합니다. 잘 와동과 얼음을 품다. </li><li> 플라스틱 템플릿 홀더에 이동식 팔 잘 immunomodule 스트립을 삽입하고 microplate 리더에 삽입합니다. </li><li> 왼쪽에서 샘플 함유 스트립 이웃에서 빛이 산란 간섭을 최소화 할 수있는 템플릿 홀더의 오른쪽에 다른 빈, 빈, 샘플, 빈, 빈, 샘플, 빈, 그리고 빈 immunomodule 스트립. 플라스틱 템플릿 소유자의 가장자리에서 빛이 산란 간섭을 최소화하기 위해 각 immunomodule 스트립의 하단으로 상단에서 단 우물 2-7 사용합니다. </li><li> microplate 리더 및 액세스 SoftMax 프로 microplate 응용 프로그램 소프트웨어를 사용합니다. </li><li> 멀티 채널 피펫 사용하여, 모든 샘플 microplate 우물에 FV-결함 플라즈마 (50 μl)을 추가합니다. singl를 사용하여전자 피펫은 40 배 희석 NHP 또는 microplate 우물을 분리하려면 위의 준비 샘플 플라즈마의 50 μl를 추가합니다. </li><li> 멀티 채널 피펫 사용하여, 모든 샘플 우물에 thromboplastin을 (50 μl)를 추가합니다. 1 분 부화의 15-25 초 동안 판을 흔들 1 분 및 프로그램 microplate 리더에 대한 25 microplate 리더 ° C에서 알을 품다. </li><li> microplate 리더, 액세스 SoftMax Pro 소프트웨어 microplate 응용 프로그램을 연결할 컴퓨터를 사용합니다. 흡광도, 405nm로 파장, 키네틱, 25에 온도 ° 이후 6 분마다 5 초 405nm에서 C, 그리고 칼슘 염화물 추가 한 후 처음 5 초에 대항 할 프로그램 microplate 리더 및 측정 흡광도.에 모드로 독자를 설정 5 초 진동 간격은 (아래) 계산 된 응고 시간에 포함되지 않습니다. </li><li> 모든 샘플 microplate 우물과 즉시 홍보, 다중 채널 피펫을 사용하여 염화칼슘을 (6.25mM 최종 농도가 증류수에 25mM의 50 μl)을 추가분석을 시작하기 위해 컴퓨터에서 SoftMax Pro의 microplate 응용 프로그램에서 &#39;시작&#39;아이콘을 ESS. </li><li> 실행의 끝에서 시간, 초기 속도, 그리고 SoftMax Pro의 흡광도 대 시간 프로필에서 40 배 희석 NHP 및 샘플 플라즈마에 대한 응고 형성의 범위를 결정합니다. </li><li> 계좌로 40 배 희석을 고려, 유닛에 / FV 로그 응고 시간 대 로그 FV 활동 (그림 2A)의 1 단계 활동을 표준 곡선으로부터 ML FV 활동을 계산하기 위해 각 샘플에 대한 응고 시간을 사용합니다. 이 트롬빈으로 &#39;의도적&#39;인증없이 FV-1 무대 활동 또는를 나타냅니다. </li><li> FV는 활성 cofactor로 트롬빈으로 활성화되어 있기 때문에, FVa 1, 트롬빈과 더불어과 부화 후 두 번째 분석은 정확하게 플라즈마 샘플의 FV 2 단계 활동을 (추가 트롬빈에 의한 &#39;의도적&#39;활성으로)을 측정하는 것이 중요합니다. </li><li> FV 2 단계 분석의 경우, 트롬빈 18을 정화의 200-300 μl를 준비t HBS, 산도 7.4의 100nM하고 얼음에 품다. FV 2 단계 분석과 assayed 할 각 플라즈마 샘플 희석 트롬빈의 10 μl를 사용 할 계획입니다. </li><li> 2.8mM 염화칼슘을 포함하는 HBS, 산도 7.4의 170 μl 100 배 ~ 40 배에서 위의 NHP 및 샘플 플라즈마 120 μl를 희석. 각 샘플에 10 μl 트롬빈을 (10nM 최종 농도)를 추가합니다. 소용돌이 잘 1 분에 37 ° C에서 혼합 품다합니다. </li><li> 위에서 설명한대로 1 단계 microplate 분석 FV 각 플라즈마 샘플의 50 μl를 HBS, 산도 7.4 400 μl를 추가, 소용돌이 잘하고, 분석하여 500 배에 NHP 및 샘플 플라즈마를 희석. </li><li> NHP와 SoftMax Pro의 흡광도 대 시간 프로필에서 assayed 각 플라즈마 샘플의 응고 시간을 확인합니다. 계좌로 500 배 희석을 고려, FV FV에서 2 단계 활동을 계산하기 위해 각 샘플에 대한 응고 시간을 사용 로그 응고 시간 대 로그 FV 활동의 1 단계 표준 곡선 (그림 2A). </li><li> 총 FV activiFV 1 단계 활동 - 티 그 다음 FV 2 단계 활동으로 계산 될 수있다. </li></ol>

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

운동 microplate 분석 방법이 소설하지 않은 (FV 1 단계 분석) 또는 인간의 플라즈마의 샘플에서 FV 응고 활동의 측정을위한 신속한 저렴하고 편리한 기술의 발전을 설명하는 것은 의도적으로 추가 된 트롬빈 (FV로 활성화 된 2 단계 분석). 검정은 운동 microplate 리더를 활용하여 필요한 모든 자료와 시약은 상업적으로 사용할 수 있습니다 또는 집에​​서 만들어 질 수있다. 검정은 지속적으로 405nm에서 섬유소 응고 형성 동안 플라즈마의 빛 분산의 변화를 모니터링합니다. microplate 분석 작은 플라즈마 샘플 볼륨을 (μl)를 사용의 장점을 가지고 있으며 동시에 여러 샘플 (12)의 분석을위한 의무입니다. 고가의 장비와 시약은 (자동 분석기 및 팩터 - 결함 플라즈마)를 사용하는 경우이 검정 속성은 유리이다; 만 작은 샘플 볼륨을 사용할 수 있습니다 (환자 플라즈마) 또는 FV 정화 F에는 샘플의 큰 번호 (분석ROM 플라즈마). FV microplate 분석은 빠르고 편리있는 추가 이점을 가지고 있으며, 필요한 구성 요소의 절연 및 정화를 필요로하지 않습니다. 수동 경사 관 3, 4,보고 된 자동 5-7 FV의 assays에 비해, FV microplate 분석이 응고 시간 비교 유용한 범위 (25-75 초) 및 샘플에 해당 FV 수준 (0.5-0.005 단위가 / ML) 및 감도 / 검출 한계 (20 80pM). 응고 형성 3, 4의 주관적인 시각적 평가에서 고통을 수동 경사 관 FV의 assays에 비해, FV microplate 분석은 응고 시간을 객관적이고 정량적 측정, 초기 속도, 그리고 섬유소 응고 형성의 정도를 할 수 있습니다. 5-7 고가의 분석기 및 시약의 요구로 고통 자동 FV의 assays에 비해, FV microplate 분석의 시약 및 재료는 저렴하고 필요한 모든 자료는 purcha 수 있습니다상업적으로 SED 또는 집에​​서했다. 수동 경사 관 3, 4 및 자동화 5-7 FV의 assays는 일반적으로 만 응고 형성을위한 시간을 제공,하지 시간, 초기 속도, 그리고 정확하게 FV microplate 분석과 spectrophotometrically 측정 섬유소 응고 형성의 범위. 마지막으로, 3,4 경사 관 수동 및 자동 5-7 FV의 assays는 플라즈마 샘플을 한 번에 하나의 FV 활동을 측정 할 수없는 고통, FV microplate 분석은 높은 처리량 의무가 있으며, 12 샘플 수 있습니다 반면, 동시에 assayed. microplate 분석은 9 DIC 환자 플라즈마의 FV 때문에 지연 응고 시간 및 FV 1 단계 분석에서 응고 형성의 낮은 초기 속도의 조합의 NHP에보다 적극적이라고 설명하는 데 사용되었습니다. DIC 환자 플라즈마의 FV 2 단계 분석에서 응고 형성의 초기 요금은 NHP에서 변경되지 않았습니다. DIC patien에서 응고 형성의 범위t 플라즈마는 FV 1 단계 및 2 단계 assays의 NHP에서 변경되지 않았습니다. FV 감소 1 단계, 2 단계 및 총 활동이 획득 혈액 장애의 pathogenesis 동안 다른 연구에 따라 증가 FV 소비 19 및 / 또는 불 활성화 여섯으로 인해 발생했을 수 있습니다. DIC 플라즈마에서 응고 형성의 정도는 같은 NHP와 함께 관찰 그대로였다 감안할 때,이 변수는 대부분의 FV-결함 플라즈마에서 피브리노겐 농도의 결과 가능성과 환자 플라즈마의 특성에 관한 아니 었습니다. microplate 분석의 결과는 인간의 플라즈마의 샘플에서 FV 활동의 측정은 FV 1 단계 분석에서 응고 형성 시간과 초기 속도와 FV 2에서 응고 형성과 총 활동 시간에서 구할 수 있습니다 표시 - 단계 분석. 그것은 t의 응고 형성의 정도에 따라 플라즈마 샘플에 FV 활동의 양적 측정을 얻기 위해 불가능했다그는 FV 1 - 및 2 단계 assays 또는 FV 2 단계 분석에서 응고 형성의 초기 속도. 모든 반응은 약 0.35의 응고 형성의 동일한 범위에 도달 감안할 때 - 전에 초기 흡광도와 thromboplastin과 칼슘 염화물 추가 후 최대 흡광도 사이에 0.45 단위, 응고 형성의 범위 측정에 FV 활동의 양적 평가를 제공하지 않습니다 플라즈마 샘플을 제공. 소설 microplate 분석은 인간과 동물 플라즈마로부터 정화하는 동안 인간의 플라즈마와 분수의 샘플에서 FV 활동의 측정을위한 연구 및 임상 설정에서 사용을 찾을 수 있습니다. microplate 분석은 시간, 초기 속도, 그리고 응고 형성의 정도를 측정하는 데 사용할 수 있습니다, 매개 변수는 일반적으로 수동 경사 관 assays 및 자동 응고 분석기로 동시에 모니터링 없습니다. 이 정보는 응고 형성 이벤트 기간 동안 FV의 참여의 전체 정량 평가의 자세한 내용을 제공합니다인간의 플라즈마에 이상이 이전에 3-7보고되었습니다. 플라즈마의 샘플에 FV 활동 또는 FV 또는 FVa을 정화로 큰 변화를 측정 할 때이 정보는 연구와 임상 실험실 모두에서 특히 중요합니다. FV microplate 분석도 특성화하고 측정 FV 및 FVa을 활성화하거나 비활성화 할 수 있습니다 화합물을 정맥 혈전증에 대한 위험에 환자의 FV 활동을 측정 FV 레이덴 돌연변이의 결과로 20, 21하고의 활동을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다 플라즈마로부터 정화 기간 동안 FV. FV microplate 분석은 해당 요소 - 결함 플라즈마를 사용하고 섬유소 형성을위한 시약을 시작 외부, 고유, 또는 일반적인 경로에서 모든 응고 인자의 활동을 측정 할 쉽게 적응합니다. 분석 연구 및 임상 실험실에서의 활동의보다 정확하고 완벽한 측정을 통해 FV 생화학 대한 우리의 이해를 높일 수 있습니다. 최고의지적인,이 정보는 긍정적 이전에 진단 및 DIC와 같은 응고 장애와 고통 사람들을위한 더 효과적인 치료법의 개발을 통해 의료 환경에 영향을 미칠 것입니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 의견 (선택 사항) </td></tr><tr><td> 운동 microplate 리더 </td><td> 분자 장치 </td><td> 스펙트럼 최대 190 </td><td> SOFTmax PRO 4.3 LS 소프트웨어 </td></tr><tr><td> 일반 풀링 된 인간의 기준 플라즈마 </td><td> 정밀 체액 </td><td> CCN-10 </td><td></td></tr><tr><td> Trisodium 구연산 </td><td> Becton Dickenson </td><td> B10242 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Becton Dickenson </td><td> B10093 </td><td></td></tr><tr><td> FV-부족한 인간 플라즈마 네 </td><td></td><td></td><td> 신선한 인간의 플라즈마에서 만든 -70에서 aliquots에 저장 ° C. </td></tr><tr><td> 3 60ML의 주사기 </td><td> Becton Dickenson </td><td> 309585 및 136898 </td><td></td></tr><tr><td> 나비 장치 </td><td> Vacutainer </td><td> 367251 </td><td> 20 게이지 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 시그마 / 올드리치 </td><td> H-3375 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 어부 </td><td> BP358-212 </td><td></td></tr><tr><td> Thromboplastin </td><td> 트리니티 생명 공학 </td><td> T1106 </td><td> Dialyzed 대 HBS, pH를 7.4와 -70에서 aliquots에 저장 ° C. </td></tr><tr><td> 염화칼슘 </td><td> Becton Dickenson </td><td> B10070 </td><td></td></tr><tr><td> 인간 트롬빈 15 </td><td></td><td></td><td> 인간의 플라즈마에서, 50 % -20 ° C (V / V) 글리세롤에 저장됩니다. </td></tr><tr><td> 투석 막 </td><td> 어부 </td><td> 21-152-6 </td><td> 6 8kDa 분자량의 컷오프, 50mm X 3m. </td></tr><tr><td> 템플릿 홀더 및 이동식 팔 잘 스트립. </td><td> Nunc </td><td> 14-245-63와 469,957 </td><td></td></tr><tr><td> 엘리사 세척 트레이 </td><td> BioRad </td><td> 224-4872 </td><td></td></tr><tr><td> 1.5 ML의 microfuge 15 ML 나사 덮인 관. </td><td> Sarstedt </td><td> 72690과 62554205 </td><td></td></tr><tr><td> 멀티 채널 피펫 </td><td> 어부 </td><td> 2703630 </td><td> 8 채널 모델입니다. </td></tr></tbody></table>

measurement of factor v activity in human plasma using a microplate coagulation assay

부상에 대응하여, 혈액 응고가 활성화하고 혈액 응고 단백 분해 효소, 트롬빈​​의 생성의 결과입니다. 섬유소로 트롬빈 cleaves의 피브리노겐 이는 출혈을 중지 불용성 응고를 형성한다. 의 활성 형태, FVa에서 요소 V (FV)는 prothrombinase 1, 2의 일부로 섬유소 응고 형성시 트롬빈 생성의 단백 분해 효소 FXa과 가속을위한 중요한 cofactor이다. 수동 FV의 assays는 3, 4 설명 된 있지만 시간이 소요 및 주관적입니다. 자동 FV의 assays는 5-7보고 있지만 분석기 및 시약 비싼 일반적으로는 응고 시간,하지 섬유소 형성의 속도와 범위를 제공합니다되었습니다. microplate 플랫폼 때문에 편리 효소 촉매 이벤트를 측정하는 것이 바람직하다, 시간, 비용, 작은 볼륨, 지속적인 모니터링, 9, 8 높은 처리량. Microplate의 assays는 응고의 용해 10, 혈소판 응집에 대해보고 된11 및 응고 요인 12,하지만 인간의 플라즈마에 FV 활동에 대한. 방법의 목적은 인간의 플라즈마에서 피브린 형성하는 동안 FV 활동을 측정 microplate 분석을 개발하는 것이 었습니다. 이 소설 microplate 방법은 인간의 플라즈마에 FV 활동의 간단 저렴하고 빠른 분석을 설명합니다. 검정은 인간의 플라즈마에서 피브린 형성 (그림 1) 13시 405nm에서 흡광도의 변화를 모니터링하는 운동 microplate 리더를 활용합니다. 검정 정확하게 시간, 초기 속도, 그리고 섬유소 응고 형성의 정도를 측정합니다. 그것은 플라즈마 만 μl 양을 필요로 6 분에 완료, 높은 처리량이, 24 80pM FV에 민감하며,의 양을 측정 실수로 활성화 (1 단계 활동)과 트롬빈 활성화 FV (2 단계 활동 1 단계 활동) -)의 총 기능 활동의 전체 평가 (2 단계 활동을 구하십시오. 전파 intravascular 응고 (DIC)가 가장 많이 기존의 감염을 14 일부터 개발 획득 coagulopathy입니다. DIC는 기존의 병리 15 위 가난한 예후 (豫后)와 증가 사망률과 연결되어 있습니다. 검정은 DIC, FV 1 단계, 2 단계 및 총 활동 9 환자 일반 풀링 된 인간에 비해 각각 54 %, 44%, 42 %의 평균에 감소 된 것을 보여주기 위해 사용되었다 참조 플라즈마 (NHP). FV microplate 분석은 응고 인자의 활동을 측정 할 쉽게 적응합니다. 이 분석은 연구 및 임상 설정에서의 활동의보다 정확하고 완벽한 측정을 통해 FV 생화학 대한 우리의 이해를 높일 수 있습니다. 이 정보는 긍정적 이전에 진단 및 DIC와 같은 응고 장애에 대한 더 효과적인 치료법의 개발을 통해 의료 환경에 영향을 미칠 것입니다.

대표 결과 - FV의 작성 1 단계 microplate 응고 분석 활동 표준 곡선 microplate 독자에 의해 생성 시간이 지남에 따라 FV 분석의 섬유소 응고 형성의 대표 예는 그림 1에 도시된다. FV 분석은 정확하게 시간, 초기 속도, 그리고 섬유소 응고 형성의 정도를 측정합니다. 분석이 완료되면 우물의 검사는 응고 형성이 발생 확인. 전에 시작 흡광도와 thromboplastin과 칼슘 염화물 추가 후 최대 흡광도 사이에 0.45 단위 - 모든 반응은 0.35의 405nm에서 흡광도의 일반적인 변화 응고 형성의 약 동일한 범위에 도달했습니다. FV 대표 예제는 1 단계 로그 응고 시간의 활동 표준 곡선 (초) 대 로그 FV 활동 (단위 / ML)와 응고 형성의 초기 속도를 기록 (mUnits / 분)을 대 로그 FV 활동 (단위 / ML NHP의 일련 dilutions 용)는에 표시됩니다 <stron각각 g&gt; 그림 2A와 그림 2B. FV 대 응고 시간의 로그인 로그 음모를 맞는 1 활동 (, R 2 = 0.980 그림 2A) 선형 회귀 분석 한 후 이러한 변수 사이의 강한 관계를 지적했다. FV 활동 대 응고 형성의 초기 속도의 로그인 로그 음모를 맞는하면 (; R 2 = 0.983 그림 2B) 선형 회귀 분석 한 후 이러한 변수 사이의 강한 관계를 지적했다. NHP 512 배까지 희석을 위해 모두 로그 응고 시간의 관계와 응고 형성 대 로그 FV 활동의 초기 속도를 로그 선형 남아 있었다. FV는 12 40nM 약 16에서 NHP에서 순환하기 때문에, microplate 분석은 약 NHP의 24 80pM FV에 민감합니다. prothrombinase의 FVa - FXa - 지질의 상호 작용의 일정한 분리는 약 1nM 17 점을 감안할 때, FV microplate 분석은 생리 학적 relevan에 FV 수준의 측정을위한 완전히 적합합니다prothrombinase의 FVa 기능에 대한 t의 nm의 범위. FV microplate 분석 사용, 또한 15 건강한 통제 플라즈마의 FV 1 단계 활동 분석 (남성과 여성, 나이 18 20yrs)에 FV 활동의 정상적인 범위 (± 표준 편차 평균, 범위)이라고 결정했습니다 : 0.96 ± 0.14U/ml, 0.68-1.11U/ml. 이 커틀러 외에 의해보고되는 일반적인 건강 FV 활동 및 범위 (0.66-1.14U/ml)과 잘 동의합니다. FV에 대해 1 단계 활동은 자동 분석기 7 결정. 간 검정 시간, 범위의 다양성, 그리고 8 개의 다른 일 6 우물에있는 FV 1 단계 분석에서 응고 형성의 초기 속도는 각각 3.4 %, 4.4 %, 그리고 3.1 %였다. 간 검정 시간, 범위의 다양성, 그리고 8 개의 다른 일에 8 개의 다른 실험 6 우물에있는 FV 1 단계 분석에서 응고 형성의 초기 속도는 각각 7.1 %, 7.8 %, 그리고 9.2 %였다. 따라서,이 세 measu의 내부 및 남북 검정 다양성빨간색 변수 (최대 12) 내에서 동시에 여러 샘플 microplate 분석 사이의 강력한 분석 성능을위한 낮은 허용 수준이었다. 대표 결과 - FV 1 단계 및 2 단계 microplate 응고 분석과 인간의 플라즈마 샘플을 시금 로그 응고 시간 대 로그 FV 활동의 표준 곡선 (그림 2A)은 의도적으로 추가 된 트롬빈 (FV 1 단계 활동)으로 활성화되지 않았거나 의도적으로 활성화 된 NHP, 9 DIC 환자 플라즈마의 FV 활동을 측정하는 데 사용 된 트롬빈 (FV 2 단계 활동)을 추가하고 그 결과는 표 1에 표시됩니다. 모든 9 DIC 환자 플라즈마은 1 단계 활동과 NHP에서 각각 54 %와 18 %, 평균 감소 된 응고 형성의 초기 속도 FV을 전시. DIC 환자의 FV 1 단계 분석에서 응고 형성의 범위는 NHP에서 크게 차이가 있었고, NHP에서 13 %로, 평균 증가했다. <html> 트롬빈과 NHP의 활성화 FV에 대략 8 배 증가를 생성 FV 1 단계 활동 (표 1) 위의 2 단계 활동. 이 NHP의 FV는 unactivated 형태로 주로 존재 및 수동 경사 관 FV의 assays 3, 4 및 자동 FV의 assays 5-7를 사용하여 이전에보고 된 결과에 동의 함을 나타냅니다. FV 2 단계 및 전체 활동도 NHP에서 각각 44 %와 4​​2%하여 평균 DIC 환자에서 감소했다. FV DIC 환자의 2 단계 분석에서 응고 형성의 초기 속도와 extents는 NHP에서 크게 차이가 있었고, NHP와 관찰이에서 각각 약 9%, 4 %로, 평균 다양. 이러한 결과는 장기간 시간에 결과와 섬유소 응고 형성의 속도를 감소 DIC 환자 플라즈마의 NHP, FV에있는 FV과 비교하여 환자 FV는 평균 만 56%뿐만 아니라 트롬빈과 activatable로라고 지적했다. 다닐 &quot;강한 : 유지 - together.within 페이지 =&quot;항상 &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3822/3822fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 운동 microplate FV 1 단계 응고 분석과 측정 정상적인 풀링 된 인간의 참조 플라즈마에서 응고 형성. NHP의 섬유소 응고 형성은 지속적으로 운동 microplate 리더를 사용하여 405nm에서 모니터링되었다. 줄거리는 32 배 희석 NHP, FV-결함 플라즈마, thromboplastin, 잘 microplate에 염화칼슘의 6 분 반응의 microplate 리더 출력됩니다. 수직 축은 플라즈마의 섬유소 형성의 결과로 발생 405nm에서 흡광도의 변화를 나타냅니다. 섬유소 형성의 시간은 흡광도의 반 최대 증가 또는 곡선 (36.40 초)의 중간 지점에 도달하는 시간으로 정의되었다. 응고 형성의 초기 속도는 커브 (611.88 mUnits / 분)의 흡광도 부분의 선형 증가의 첫 번째 5 번 지점으로 405nm에서 흡광도의 변화의 속도로 정의되었다. 예응고 형성의 텐트는 405 nm의 (0.35 단위)에서 최대 및 최소 흡광도의 차이로 정의되었다. <img src="/files/ftp_upload/3822/3822fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 시간과 FV 1 단계 microplate 분석을 사용하여 일반 풀링 된 인간의 참조 플라즈마의 응고 형성 대 팩터 V 활동의 초기 속도의 표준 곡선. NHP는 순차적으로 희석 (0 - 512 배에 HBS)을했고 프로토콜에 설명 된대로 FV 1 단계 microplate 분석과 assayed. 시간과 FV의 응고 형성 대 FV 활동 1 단계 microplate 분석의 초기 속도의 로그인 로그 줄거리는 패널의 데이터와 B, 각각의 선형 회귀 모델링 한 후 표시됩니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 견본 </td><td> 1 단계 분석 활동 (단위 / ML) </td><td> 1 단계 검정 범위 (단위) </td><tD&gt; 1 단계 분석 초기 속도 (mUnits / 분) </td><td> 2 단계 분석 활동 (단위 / ML) </td><td> 2 단계 검정 범위 (단위) </td><td> 2 단계 분석 초기 속도 (mUnits / 분) </td><td> 총 활동 (단위 / ML) </td></tr><tr><td> NHP </td><td> 1.02 </td><td> 0.363 </td><td> 744.96 </td><td> 7.93 </td><td> 0.433 </td><td> 375.84 </td><td> 6.91 </td></tr><tr><td> 환자 1 </td><td> 0.36 </td><td> 0.404 </td><td> 583.80 </td><td> 3.84 </td><td> 0.432 </td><td> 249.96 </td><td> 3.48 </td></tr><tr><td> 환자 2 </td><td> 0.67 </td><td> 0.416 </td><td> 704.04 </td><td> 5.28 </td><td> 0.469 </td><td> 323.16 </td><td> 4.61 </td></tr><tr><td><strong&gt; 환자 3 </td><td> 0.31 </td><td> 0.435 </td><td> 562.08 </td><td> 3.92 </td><td> 0.453 </td><td> 294.96 </td><td> 3.61 </td></tr><tr><td> 환자 네 </td><td> 0.39 </td><td> 0.435 </td><td> 617.04 </td><td> 4.14 </td><td> 0.462 </td><td> 372.60 </td><td> 3.75 </td></tr><tr><td> 환자 5 </td><td> 0.73 </td><td> 0.401 </td><td> 641.40 </td><td> 5.91 </td><td> 0.433 </td><td> 354.24 </td><td> 5.18 </td></tr><tr><td> 환자 6 </td><td> 0.45 </td><td> 0.403 </td><td> 600.72 </td><td> 4.16 </td><td> 0.445 </td><td> 393.96 </td><td> 3.71 </td></tr><tr><td> 환자 7 </td><td> 0.49 </td><td> 0.395 </td><td> 575.40 </td><td> 4.89 </td><td> 0.449 </td><td> 357.48 </td><td> 4.40 </td></tr><tr><td> 환자 8 </td><td> 0.19 </td><td> 0.448 </td><td> 489.00 </td><td> 2.89 </td><td> 0.450 </td><td> 330.48 </td><td> 2.70 </td></tr><tr><td> 환자 9 </td><td> 0.64 </td><td> 0.423 </td><td> 699.48 </td><td> 5.11 </td><td> 0.455 </td><td> 417.24 </td><td> 4.47 </td></tr></tbody></table> NHP와 혈관 응고 (DIC)를 분해 해 버렸 개발 아홉 환자의 표 1 FV 활동. FV 1 단계, 2 단계, 그리고 NHP 9 DIC 환자 플라즈마의 총 활동은 microplate 분석 표준 FV-1 단계에서 결정 FV 활동 (그림 2A) 대 응고 형성 시간 곡선과는 단위 / ML에 부여됩니다. 초기 속도 (mUnits / 분의 처음 다섯 시간 포인트 이상 A405nm 증가의 초기 속도)와 extents (최대 A405nm - 최소 A40FV 1 응고 형성 5nm) - 및 2 단계 microplate 분석도 표시됩니다.

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Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

이 연구는 이전에보고되지 않은 인간의 플라즈마에 섬유소 응고 형성하는 동안 FV 응고 활동을 측정하는 새로운 microplate 분석에 대해 설명합니다. 방법은 지속적으로 인간의 플라즈마에 섬유소 응고 형성하는 동안 405nm에서 흡광도의 변화를 측정 할 수있는 운동 microplate 리더를 사용합니다.

Microplate 응고 분석을 사용하여 인간의 플라즈마에 반영 V 활동의 측정

 In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.9K 조회수.  University of Ontario Institute of Technology. 이 연구는 이전에보고되지 않은 인간의 플라즈마에 섬유소 응고 형성하는 동안 FV 응고 활동을 측정하는 새로운 microplate 분석에 대해 설명합니다. 방법은 지속적으로 인간의 플라즈마에 섬유소 응고 형성하는 동안 405nm에서 흡광도의 변화를 측정 할 수있는 운동 microplate 리더를 사용합니다.

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Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

공동 문화 모델 녹농균 Biofilms는 라이브 인간 에어웨이 세포에 들어라

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

연구

면역학 및 감염병학

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

V3의 HIV - 1 Tropism의 Genotypic 추론 사용 인구를 기반 시퀀싱

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of NK cells and ability to expand in vitro has restricted development of NK cell immunotherapy. Here we describe a method to efficiently expand vast quantities of functional NK cells ex vivo using K562 cells expressing membrane-bound IL21, as an artificial antigen-presenting cell (aAPC).
NK cell adoptive therapies to date have utilized a cell product obtained by steady-state leukapheresis of the donor followed by depletion of T cells or positive selection of NK cells. The product is usually activated in IL-2 overnight and then administered the following day 1. Because of the low frequency of NK cells in peripheral blood, relatively small numbers of NK cells have been delivered in clinical trials.
The inability to propagate NK cells in vitro has been the limiting factor for generating sufficient cell numbers for optimal clinical outcome. Some expansion of NK cells (5-10 fold over 1-2 weeks) has be achieved through high-dose IL-2 alone 2. Activation of autologous T cells can mediate NK cell expansion, presumably also through release of local cytokine 3. Support with mesenchymal stroma or artificial antigen presenting cells (aAPCs) can support the expansion of NK cells from both peripheral blood and cord blood 4. Combined NKp46 and CD2 activation by antibody-coated beads is currently marketed for NK cell expansion (Miltenyi Biotec, Auburn CA), resulting in approximately 100-fold expansion in 21 days.
Clinical trials using aAPC-expanded or -activated NK cells are underway, one using leukemic cell line CTV-1 to prime and activate NK cells5 without significant expansion. A second trial utilizes EBV-LCL for NK cell expansion, achieving a mean 490-fold expansion in 21 days6. The third utilizes a K562-based aAPC transduced with 4-1BBL (CD137L) and membrane-bound IL-15 (mIL-15)7, which achieved a mean NK expansion 277-fold in 21 days. Although, the NK cells expanded using K562-41BBL-mIL15 aAPC are highly cytotoxic in vitro and in vivo compared to unexpanded NK cells, and participate in ADCC, their proliferation is limited by senescence attributed to telomere shortening8. More recently a 350-fold expansion of NK cells was reported using K562 expressing MICA, 4-1BBL and IL159.
Our method of NK cell expansion described herein produces rapid proliferation of NK cells without senescence achieving a median 21,000-fold expansion in 21 days.

Here we describe a method to efficiently expand and purify large numbers of human NK cells and assess their function.

확장, 정화, 그리고 사람 말초혈 NK 세포 기능 평가

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes. The majority of them belong to the superfamily of G protein-coupled receptors (GPCRs). We have focused on characterizing arthropod kinin receptors from the tick and mosquito. Arthropod kinins are multifunctional neuropeptides with myotropic, diuretic, and neurotransmitter function. Here, a method for systematic analyses of structure-activity relationships of insect kinins on two heterologous kinin receptor-expressing systems is described. We provide important information relevant to the development of biostable kinin analogs with the potential to disrupt the diuretic, myotropic, and/or digestive processes in ticks and mosquitoes.
The kinin receptors from the southern cattle tick, Boophilus microplus (Canestrini), and the mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), were stably expressed in the mammalian cell line CHO-K1. Functional analyses of these receptors were completed using a calcium bioluminescence plate assay that measures intracellular bioluminescence to determine cytoplasmic calcium levels upon peptide application to these recombinant cells. This method takes advantage of the aequorin protein, a photoprotein isolated from luminescent jellyfish. We transiently transfected the aequorin plasmid (mtAEQ/pcDNA1) in cell lines that stably expressed the kinin receptors. These cells were then treated with the cofactor coelenterazine, which complexes with intracellular aequorin. This bond breaks in the presence of calcium, emitting luminescence levels indicative of the calcium concentration. As the kinin receptor signals through the release of intracellular calcium, the intensity of the signal is related to the potency of the peptide.
This protocol is a synthesis of several previously described protocols with modifications; it presents step-by-step instructions for the stable expression of GPCRs in a mammalian cell line through functional plate assays (Staubly et al., 2002 and Stables et al., 1997). Using this methodology, we were able to establish stable cell lines expressing the mosquito and the tick kinin receptors, compare the potency of three mosquito kinins, identify critical amino acid positions for the ligand-receptor interaction, and perform semi-throughput screening of a peptide library. Because insect kinins are susceptible to fast enzymatic degradation by endogenous peptidases, they are severely limited in use as tools for pest control or endocrinological studies. Therefore, we also tested kinin analogs containing amino isobutyric acid (Aib) to enhance their potency and biostability. This peptidase-resistant analog represents an important lead in the development of biostable insect kinin analogs and may aid in the development of neuropeptide-based arthropod control strategies.

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

This protocol provides instructions for clonal-cell line selection and a calcium bioluminescence assay to analyze the structure-activity relationships of synthesized arthropod neuropeptides on their cognate GPCRs. This assay can be used for receptor deorphanization and structure-activity relationship studies for synthetic analog design and peptide/drug-lead discovery.

모기의 기능 분석을 위해 칼슘 Bioluminescence 분석 ( Aedes aegypti)와 틱 ( Rhipicephalus microplus) G 단백질 결합 수용체

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

형광성의<em&gt; 현장에서</em모기의 Mitotic의 염색체에&gt; 하이브리드

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a process that results in the exocytosis of allergic mediators. Modulation of mast cell degranulation by drugs and toxicants may have positive or adverse effects on human health. Mast cell function has been dissected in detail with the use of rat basophilic leukemia mast cells (RBL-2H3), a widely accepted model of human mucosal mast cells3-5. Mast cell granule component and the allergic mediator &#946;-hexosaminidase, which is released linearly in tandem with histamine from mast cells6, can easily and reliably be measured through reaction with a fluorogenic substrate, yielding measurable fluorescence intensity in a microplate assay that is amenable to high-throughput studies1. Originally published by Naal et al.1, we have adapted this degranulation assay for the screening of drugs and toxicants and demonstrate its use here.
Triclosan is a broad-spectrum antibacterial agent that is present in many consumer products and has been found to be a therapeutic aid in human allergic skin disease7-11, although the mechanism for this effect is unknown. Here we demonstrate an assay for the effect of triclosan on mast cell degranulation. We recently showed that triclosan strongly affects mast cell function2. In an effort to avoid use of an organic solvent, triclosan is dissolved directly into aqueous buffer with heat and stirring, and resultant concentration is confirmed using UV-Vis spectrophotometry (using &#949;280 = 4,200 L/M/cm)12. This protocol has the potential to be used with a variety of chemicals to determine their effects on mast cell degranulation, and more broadly, their allergic potential.

Mast cell degranulation, the release of allergic mediators, is important in allergy, asthma, and parasite defense. Here we demonstrate techniques1 for assessing effects of drugs and toxicants on degranulation, methodology recently utilized to exhibit the powerful inhibitory effect of antibacterial agent triclosan2.

유기 용매를 사용하지 않고 트리클로산의 효과 : RBL-2H3 비만 세포 탈과립에 화학 효과를 평가하는 마이크로 분석 실험

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue remodeling and repair, and virologic control1,2 . Interleukin-1&#946; is an essential element of the innate immune response and contributes to eliminate invading pathogens while preventing the establishment of persistent infection1-5.
Inflammasomes are the key signaling platform for the activation of interleukin 1 converting enzyme (ICE or Caspase-1). The NLRP3 inflammasome requires at least two signals in DCs to cause IL-1&#946; secretion6. Pro-IL-1&#946; protein expression is limited in resting cells; therefore a priming signal is required for IL-1&#946; transcription and protein expression. A second signal sensed by NLRP3 results in the formation of the multi-protein NLRP3 inflammasome. The ability of dendritic cells to respond to the signals required for IL-1&#946; secretion can be tested using a synthetic purine, R848, which is sensed by TLR8 in human monocyte derived dendritic cells&#160;(moDCs) to prime cells, followed by activation of the NLRP3 inflammasome with the bacterial toxin and potassium ionophore, nigericin.
Monocyte derived DCs&#160;are easily produced in culture and provide significantly more cells than purified human myeloid DCs. The method presented here differs from other inflammasome assays in that it uses in vitro human, instead of mouse derived, DCs thus allowing for the study of the inflammasome in human disease and infection.

Dendritic cells (DCs)&#160;secrete IL-1&#946; in response to TLR8 recognition of synthetic purine, R848, followed by NLRP3 inflammasome activation with nigericin, therefore, IL-1&#946; can be used to measure NLRP3 inflammasome activity. Intracellular cytokine staining, immunoblotting, and ELISA are used to accurately measure NLRP3 inflammasome priming and activation via IL-1&#946; expression.

활성화 및 인간 단핵구 유래 수지상 세포에서 IL-1β를 사용하여 NLRP3 inflammasome을 활동의 측정

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

대 식세포 콜로니 자극 인자 차별화 된 인간 단핵구 유래 대 식세포의 문화

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides the necessary methodology to add this assay to an exercise immunology arsenal. The first step in this assay is to prepare two aliquots ("H" and "F") of whole blood (heparin). Then, dihydroethidium is added to the H aliquot, and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Next, Staphylococcus aureus (S. aureus) is added to the H aliquot and fluorescein isothiocyanate-labeled S. aureus is added to the F aliquot (bacteria:phagocyte = 8:1), and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Then, trypan blue is added to each aliquot to quench extracellular fluorescence, and the cells are washed with phosphate-buffered saline. Next, the red blood cells are lysed, and the white blood cells are fixed. Finally, a flow cytometer and appropriate analysis software are used to measure granulocyte and monocyte phagocytosis and OB activity. This assay has been used for over 20 years. After heavy and prolonged exertion, athletes experience a significant but transient increase in phagocytosis and an extended decrease in OB activity. The post-exercise increase in phagocytosis is correlated with inflammation. In contrast to normal weight individuals, granulocyte and monocyte phagocytosis is chronically elevated in overweight and obese participants, and is modestly correlated with C-reactive protein. In summary, this flow cytometry-based assay measures the phagocytosis and OB activity of phagocytes and can be used as an additional measure of exercise- and obesity-induced inflammation.

The purpose of this manuscript is to present a method for measuring monocyte and granulocyte phagocytosis and oxidative burst activity in human blood samples.

인간의 혈액에서 측정 과립구와 단핵구 식균 작용 및 산화 버스트 활동

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

측정<em&gt; 체외</em&gt; HIV-1 사전 통합 단지의 통합 활동

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...