이 작품은 난청과 기타 통신 장애의 국립 연구소의 교내 연구 부문에 의해 지원되었다. 추가 지원이 NIDCD 5R01 DC007613에 의해 제공되었다.

1. Utricle의 해부와 문화 <ol><li> 승인된 프로토콜과 목을 벨을 사용하는 성인 (4 세 주 이상) 마우스를 안락사. </li><li> 머리 양쪽에 외부 유스 타키 오관을 자르지하고 코를 향해 전진 피부를 당기십시오. 뒤에서 앞으로 머리를 이등분하고 골질 미로를 표시하는 방법으로 양측의 두뇌를 제거합니다. </li><li> 멀리 뼈다귀 달팽이관에서 두개골을 손질하고 해부 현미경을 갖춘 조직 문화 후드에 골질 미로를 (bulla 포함) 전송 (참고 : 아데노 바이러스 작업 클래스 II 생물 학적 안전 캐비닛에서 수행되어야한다). </li><li> 후드에서 멸균 해부 미디어를 포함하는 35mm 조직 배양 접시 (M199, Gibco / Invitrogen # 12350) (그림 1A) 각 달팽이관을 전송. </li><li> 청각 bulla가 여전히 그대로있다면 (그것은 bulla과 정점 사이에 작은 이미지를 삽입하여 총 해부 동안 bulla를 제거하는 것이 가능달팽이관)는 bulla를 (그림 1B) 부수 (하나 # 3와 하나 # 5) 2 포셉을 사용합니다. </li><li> 꼭대기,베이스, ossicles, 타원형 및 원형 창문 VIIIth의 신경 뿌리, 반원의 운하 (그림 1 C, D) : 골질 달팽이관 준비의 랜드마크를 식별합니다. </li><li> 타원형 및 원형 창문 꼭대기는 접시와 VIIIth 신경 뿌리의 하단에있는 그러한가 직면하고, 위로 향하게 중간 측면과 함께 접시에 내이 (内耳)를 놓습니다. 반원의 운하 (그림 1D)의 지역에서 # 3 집게를 사용하여 준비를 잡아. </li><li> # 11 칼날이 장착된 메스를 사용하여 신경 루트 (그림 1D)에 바로 혀끝의 달팽이관의 꼭대기를 잘라. </li><li> 절단 부분이 위로 향하게되어 있도록 준비를 켭니다. 준비 (그림 1E)를 안정화하기 위해 핸들로서 앞부분은 반원의 운하를 사용하십시오. </li><li> # 5 포셉 사용하여 아래 modiolus에서 달팽이관을 제거기지. 달팽이관의 후크 영역이 아래로 밝혀졌 시점에서, saccule을 드러낸 뼈의 나선 얇은 판 (그림 1 층)의 마지막 골질 선반을 드는데 (깨진 # 55 포셉의 절반) 미세 탐침을 사용합니다. 그냥 saccule 아래에 중요 상징입니다 등골의 footplate입니다. utricle는 등골에 footplate (그림 1G)에 바로 인접해 있으며, 그것은 뼈로 둘러싸여 있습니다. 멀리 utricle의 1 / 3에 대해 밝히지만큼 뼈 칩에 탐침을 사용하십시오. 조심스럽게 # 55 포셉 (그림 1H)를 사용 utricle를 제거합니다. utricle가 골질 준비에서 가져온되기 때문에이 절차는 일반적으로 색소 지붕 상피의 제거집니다. utricle가 그대로 지붕 상피로 제거하는 경우 다만, 지붕은 # 55 포셉를 사용하여 제거할 수 있습니다. </li><li> 아데노 바이러스 감염 Utricles (또는 라이브 이미징 실험)를 해부 (사전 감염까지) 동안 제거 otoconia 있어야합니다.이 경우에는 해부 미디어 가득한과 편협한 바늘 (보통 26-28 게이지)가 장착되어 있습니다 luer 잠금 주사기를 사용합니다. # 55 포셉 (그림 1I)을 사용하여 가장자리 utricle 잡아. 아래로 가리키는 바늘의 베벨과 utricle 가까운 바늘 팁을 가져와. 미디어 otoconia를 (그림 1J) 날린 해부의 스트림을 사용합니다. 또는 otoconia는 속눈썹 도구 (테드 펠라 주식 # 113)을 사용하여 그들을 솔질하여 제거할 수 있습니다. adenoviral 감염을 받아야 할 수 없습니다 Utricles 그대로 otoconia (쉽게 사후 수정 otoconia 제거를 위해 아래 참조)과 함께 24 잘 조직 배양 플레이트에 정상적으로 자유 부동 교양입니다. </li><li> 모든 utricles가를 해부하고 나면 멸균 문화 미디어로 해부 미디어를 변경 DMEM F12은 (Gibco # 11320) 5% FBS 및 50 U / ML 페니실린 G (시그마)로 보충. </li><li> Utricles는 37 ° C 5 % CO 2에서 배양해 있습니다. 문화 mainta 될 경우이상 48 시간 ined, 문화 미디어의 절반은 매일 변경해야합니다. 문화가 일주일 이상 지속됩니다. </li></ol> 2. 지원 셀의 아데노 바이러스 감염 중요 : 아데노 바이러스로 작업하는 것은 Biosafety 레벨 2 (BSL2) 절차 및 인증이 필요합니다. 지도와 BSL2 절차에 대한 교육에 대한 기관 Biosafety 담당관에게 문의하십시오. <ol><li> (아무 혈청) 위의 해부 미디어의 utricles 해부. 위와 같이 otoconia를 제거합니다. </li><li> 감염 준비가되면 각각의 잘으로 한 utricle (세포까지)를 전송 Nunc 15 μL 혈청이없는 DMEM F12을 (혈청 바이러스를 inactivate 수 있기 때문에 이것은 중요하다)이 포함된 미니 트레이 (피셔 # 12-565-68) . 이 전송은 1.5 mm microcurette (# 10082-1​​5 파인 과학 도구에서)와 쉽습니다. </li><li> 우리 AD-GFP 삭제 바이러스 E1 및 E3 유전자와 transg 운전 인간 CMV 프로 모터와 혈청형 5에너지 (GFP). 이 바이러스 벡터 BioLabs (필라델피아, PA로부터 얻은 것입니다 <a href="http://www.vectorbiolabs.com/">vectorbiolabs.com</a> ). 주식 바이러스는 1.0-4.0 × 10 10 PFU / ML의 titers에서 제공합니다. 잘 utricle (그림 1L)를 포함하는 각 주식 바이러스 0.5-2 μl를 추가합니다. 사용되는 실제 금액은 바이러스와 주식 titer에 따라 다릅니다. 우리는 보통 1.0-4.0 × 10 7 PFU 각 utricle를 감염. </li><li> 문화 utricles 바이러스가 들어있는 37에서 미디어를 ° C / 5 % 2 시간 동안 CO 2. 2 시간 후에, 혈청과 문화 미디어를 포함하는 24 잘 조직 배양 플레이트로 다시 utricles을 전송. 37 ° C / 5% CO 2에서 하룻밤 문화 utricles. </li><li> Utricles는 라이브 이미징 실험 다음날 사용될 수도 있고, 그들은 (아래) 헤어 세포 immunochemistry에 대해 해결할 수 있습니다. transgene 발현 24 시간 이후 감염에 낮으면 시간이 지남에 따라 바이러스성 transgene 발현 증가는, 그래서 수 있습니다혈청 함유 미디어 추가 24시간 문화 세포의 유익. 네가 머리 세포 독성을 보게되면, 사용된 바이러스의 양을 줄일 수 있습니다. </li></ol> 3. Utricle 고정, Otoconia 제거 및 Immunochemistry <ol><li> 문화 시대 말기에, 적당한 온도에서 3시간 하나를 4 % paraformaldehyde에 utricles를 수정 (락 플랫폼에서) 또는 4에서 하룻밤 ° C. 0.1 M (1X) 소렌슨의 인산 버퍼 산도 7.4의 워시 제품 utricles (3 회, 15 분 각각). 이러한 단계는 24 잘 조직 배양 플레이트에 수행됩니다. </li><li> Otoconia 제거 : 참고 : Otoconia은 (단계 위의 1.11 참조) 아데노 바이러스 감염하기 전에 제거해야합니다. 그러나, 감염 수 없습니다 utricles는 여전히 그대로 otoconia 함께 배양해하고 해결할 수 있습니다. 이 경우 고정 후 otoconia를 제거하려면 여기에 설명된 단계를 사용하십시오. 모든 남아있는 색소 지붕의 상피에 대한 utricles을 검사합니다. 조심스럽게 두 명이 # 55 f를 사용하여 남아있는 지붕의 상피를 제거orceps. otoconia를 제거하려면 750-1000 μl 칼 - 예 decalcifier (피셔 # CS510-1D)와 소렌슨의 인산 버퍼를 교체하십시오. 일분 40 초 (2 분 초과하지 않는)에 utricles에 칼 - 예 둡니다. 0.1 M 소렌슨의 인산염 완충액 및 세척 (5 회, 5 분마다)와 칼 - 예를 교체하십시오. </li><li> 10 분 동안 나트륨 borohydride에 utricles을 (시그마 # 452882, 탈이온수 1 %) 품다. 0.1 M 소렌슨의 인산염 완충액 (5 회, 5 분마다)에 utricles 씻으십시오. </li><li> 솔루션을 차단 관련 플레이스 utricles (PBS + 2% 소 혈청 알부민 + 0.8 % 정상 염소 혈청 + 0.4 % 트리톤 X-100) 락 플랫폼에서 실온에서 3 시간 동안. </li><li> 일차 항체를 추가하고 4에서 하룻밤 품어 ° C. 솔루션 라벨 모두에게 세포를 차단에서 1:100에서 안티 - 마이 오신 7A (프로 테우스 중 Biosciences 발달 연구 하이 브리 도마 은행의 # 25-6790 또는 # MYO7A 138-1). 별도 striolar 및 비 striolar 세포 레이블을 지정하기 위해 이중 라벨 protoco을 사용한그리고 polyclonal 안티 calbindin (Chemicon # AB1778, Temecula, CA, 미국, 1:200), 단클론 항 calmodulin (1:150 시그마 C # 3545)와구나. 이차 항체는 (Invitrogen, Carlsbad, CA, 미국에서 보통 알렉사 형석 복합 이차 항체) 솔루션을 차단에서 1:500 희석하고 요동 플랫폼에서 상온에서 어둠 속에서 4 시간 동안 incubated됩니다. </li><li> Fluoromount-G을 (남부 생명 공학, 버밍엄, AL, 미국)를 사용하여 유리 슬라이드에 마운트 utricles. </li></ol> 4. 대표 결과 이 방법은 전체 유지 사용 배양해 Utricles하면 세포와지지 세포 (그림 2) 모두에 대해 보완합니다. 건강한 문화 헤어드라 전지 7A - 긍정 마이 오신되는 얇은 세포질 지역으로 둘러싸인 둥근 핵 프로파일을 표시합니다 (그림 2, 상단 패널). 지원 전지 (안티 Sox2으로 표시) 작은 더 밀도가 높은 세포 (그림 2, 하단 패널)보다 포장. ADEnovirus는 utricle에서 지원하는 세포의 25-50%를 감염하고, 어떤 세포는 (그림 2, AD-GFP 패널)에 감염되지 않습니다. 그것은 바이러스 titer가 너무 높은 경우 머리카락 세포 사망이 가능하므로 각 아데노 바이러스의 최적의 작업 titer가, 경험적으로 결정되어야함을 지적한다. 또한, 기계적 손상 (절개 중에 발생한)의 지역은 바이러스의 대량 소요됩니다. 기계적 손상이 지역은 GFP 발현 및 누락 세포 중 매우 높은 수준으로 세포의 지속적인 라인을 통해 쉽게 구별할 수 있습니다. 이것은 손상되지 않은 문화의 세포 (그림 2) 지원에 흩어진 GFP 발현와는 대조적이다. <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig1.jpg" alt="그림 1"/> 1 그림. 절개를 Utricle. :. 청각 bulla (AB) B :. bulla 두 튼튼한 집게를 사용하여 깨지는 경우 C : 나폴레옹 달팽이관 (RW = 둥근 창, S =. stapedial 동맥, C = 달팽이관, ST = 등골) D :.. 메스 블레이드 (SB)를 VIIIth 뇌신경 (8 일 N) ASC = 앞부분은 반원의 운하를 이메일로 혀끝의 달팽이관의 꼭대기을 차단하는 데 사용됩니다 : 준비는 가장 바깥쪽 뼈 (화살표)의 앞부분은 반원의 운하 (ASC)와 다른에 삽입 하나 포크로 # 3 집게를 사용하여 단단히 개최됩니다. 막의 미로는 집게를 사용하여 제거됩니다 F는 :. 막의 미로는 제거를 통해 뼈의 나선 얇은 판의 기저 차례 후크 지역 근처에서 볼 수 있습니다. 미세 프로브 선반을 세운 자세하고 (화살표)를 제거하려면이 골질 선반 아래에 삽입되는 G는 :. saccule을 제거 후, utricle (U)은 등골에 footplate (SF)에 바로 인접 볼 H :. Utricle는 (U ) # 55 포셉 (화살표)를 사용하여 제거됩니다 SF = 등골의 footplate는 I :.. otoconia과 Utricle (O) 부분 삭제D 감각 상피 (SE) 표시 아래는 J :. Otoconia (O)는 26 게이지 바늘로 장착되어 주사기에 의해 전달되는 미디어 스트림을 사용하여 utricle에서 제거됩니다. 바늘 (S)의 그림자 이미지의 하단에 표시됩니다 K :.. Adenoviral 감염 : Utricle은 otoconia 제거하고 감각 상피 (SE) 볼 L 각 utricle (U)가 미니를 잘 개인에 배치됩니다 - 트레이. 지원 세포가 잘 (P는 = Pipet 팁)에 바이러스를 pipetting하여 아데노 바이러스에 감염됩니다. <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 세포를 지원하는 아데노 바이러스 - 매개 감염. Utricles는 녹색 형광 단백질의 아데노 운전 표현 (AD-GFP)에 감염되었다. 헤어 셀 층 한 utricle 같은 지역에서 지원하는 세포 계층의 공촛점 이미지가 표시됩니다. 모발 세포는 마이 오신의 7A에 대해 항체로 분류하고 있습니다(마젠타). 지원 전지 Sox2 (적색)에 대한 항체로 분류하고 있습니다. 개략도 utricle 감각 상피와 세포의 위치 (HC) 및 지원 세포 (SC)의 구조를 보여줍니다. (U) 위턱과 아래턱에 표시된 공촛점 (광) 섹션의 위치는 (L) 패널은 배선의 점선 라인으로 표시됩니다. 어퍼 패널 : 머리카락 세포 핵의 수준에서 찍은 공촛점 이미지에서, AD-GFP 신호가 세포 사이의 공간에 나타나고 머리카락 세포 마커 마이 오신의 7A와 중복되지 않습니다. 로어 패널 : 지원하는 세포 핵의 수준에서 공촛점 섹션에서 광고-GFP 신호가 지원하는 세포 마커 삭스-2와 colocalizes. 셀만을 지원 GFP 발현 및 머리카락 세포의 AD-GFP 감염 결과는 감염됩니다. <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. Adenoviral 감염 세포 또는 지원하는 세포의 죽음을 초래하지 않습니다. UT는ricles은 4 × 10 8 PFU / ML에서 AD-GFP에 감염되었다. Utricles는 마이 오신의 7A (헤어 세포 마커)와 Sox2 (세포 마커를 지원하는)에 대한 항체로 분류되었다. 헤어 셀 및 지원 셀 카운트는 제어 utricles 및 광고-GFP 감염 utricles위한 있었 읍니다.

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관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

감각 세포는 노화, 소음 외상, 그리고 aminoglycoside의 항생제와 antineoplastic 에이전트 cisplatin을 포함 ototoxic 약물에 대한 노출을 포함하여 스트레스의 다양한 의한 죽음에 감염될 수 있습니다. 영구적인 청력 손실 및 / 또는 균형 장애의 포유 동물 털 세포 사망 결과입니다. 체외 모델 시스템에서 세포와 분자 메커니즘 밑에있는 머리 세포 죽음뿐만 아니라, 머리카락 세포 사망을 방지하거나 반?...

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Erratum: Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; 시약</strong</td&gt;<td<strong&gt; 회사 소개</strong</td&gt;<td<strong&gt; 카탈로그 번호</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 중형 199</td&gt;<td&gt; Gibco / Invitrogen</td&gt;<td&gt; 12,350</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM/F12</td&gt;<td&gt; Gibco / Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11,320</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 파인 포셉 (# 55)</td&gt;<td&gt; 파인 과학 도구</td&gt;<td&gt; 11255-20</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 파인 포셉 (# 5)</td&gt;<td&gt; 파인 과학 도구</td&gt;<td&gt; 11252-30</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 포셉 (# 3)</td&gt;<td&gt; 파인 과학 도구</td&gt;<td&gt; 11231-30</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 페니실린 G</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; P3032</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 태아 소 혈청</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 10082-1​​39</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Nunc 미니 트레이</td&gt;<td&gt; 피셔</td&gt;<td&gt; 12-565-68</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 아데노 바이러스-GFP</td&gt;<td&gt; 벡터 Biolabs</td&gt;<td&gt; 1060 *</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 칼 - 전 decalcifier</td&gt;<td&gt; 피셔</td&gt;<td&gt; CS510-1D</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 나트륨 borohydride</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; 452,882</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 안티 - 마이 오신 7A (polyclonal)</td&gt;<td&gt; 프로 테우스 Biosciences</td&gt;<td&gt; 25-6790</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 안티 - 마이 오신 7A (단클론)</td&gt;<td&gt; 발달 연구 하이 브리 도마 은행</td&gt;<td&gt; MYO7A 138-1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 안티 Calmodulin</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; C 3545</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 안티 Calbindin</td&gt;<td&gt; Chemicon</td&gt;<td&gt; AB1778</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fluoromount G</td&gt;<td&gt; 남부 바이오 어소 시에이츠</td&gt;<td&gt; 0100-01</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"<strong&gt; 표 1</strong&gt;. utricle 문화와 아데노 바이러스 감염에 사용되는 시약 및 도구.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; *주의 : AD-GFP는 일반적으로 1x10의 주식 titer에서 벡터 Biolabs에 의해 제공됩니다<sup&gt; 10</sup&gt; PFU / ML. 우리는 1.2 × 10의 titer에서 재고 바이러스를 제공하기 위해 사용자 정의 증폭을 요청<sup&gt; 11</sup&gt; PFU / ML.</p&gt;

dissection of adult mouse utricle and adenovirus-mediated supporting-cell infection

청력 손실 및 밸런스 교란은 주로 내이 (内耳)의 수용체 세포가 mechanosensory 세포의 죽음으로 인해 발생합니다. 만족스럽게 포유 동물 세포를 대표하는 어떤 세포 라인이 없기 때문에, 세포에 대한 연구는 주요 장기 배양에 의존합니다. 성인 쥐 (그림 1) 1-6에서 utricles의 장기 문화를 활용하여 성숙한 포유 동물 세포의 체외 모델 시스템에서 최고의 특성화. utricle은 vestibular 기관이며, utricle의 세포는 청각 기관, Corti의 기관에있는 세포의 구조와 기능 모두에서 비슷합니다. 성인 마우스 utricle 준비는 생존, 항상성, 이들 세포의 죽음을 조절 분자 신호의 연구에 대한 성숙한 감각 상피를 나타냅니다. 포유 동물 달팽이 세포는 불치병에 차별하고 그들이 길 잃었을 때 다시 생성되지 않습니다. 비 이맘에서malian 척추 동물, 청각 혹은 vestibular 머리카락 세포 사망은 청력과 균형 기능을 7, 8을 복원 강력한 재생이옵니다. 모발 세포 재생은 감각 상피 9, 10 세포의 basolateral 표면에 문의 glia 같은 지원 세포에 의해 매개된다. 지원 세포는 머리카락 세포의 생존과 사망 11 중요한 중재자입니다. 우리는 최근 아데노 바이러스를 사용하여 교양 utricles에 세포를 지원하는 감염 기법을 개발했습니다. CMV 프로 모터의 제어하에 GFP를 포함하는 transgene을 전달하기 위해 아데노 바이러스 타입 5 (dE1/E3)를 사용, 우리는 구체적으로 그 아데노 바이러스를 찾아 효율적으로 지원하는 세포를 감염. 세포 감염 효율을 지원하는 것은 약 25-50%이며, 세포는 (그림 2) 감염되지 않습니다. 중요한 것은 우리가 세포를 지원하는 adenoviral 감염 세포 또는 지원하는 세포에 독성을 초래하지 않는 것을 발견, 같은 광고-GFP INF에있는 셀 카운트ected utricles가 아닌 감염된 utricles (그림 3)에있는 것과 같습니다. 따라서 교양 utricles 셀을 지원 아데노 바이러스 - 매개 유전자 표현이 머리 세포 생존, 죽음, 그리고 중생의 중재자로서 세포를 지원하는 역할을 연구하는 강력한 도구를 제공합니다.

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Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

Mechanosensory 세포는 내이 (内耳)의 수용체 세포입니다. 최고의 특성화<em&gt; 체외에서</em성숙한 포유 동물 세포 중&gt; 모델 시스템은 어른 생쥐에서 utricles의 장기 문화를 활용합니다. 우리는 성인 마우스 utricle의 절개를 제시하고, 우리는 교양 utricles에 세포를 지원하는 아데노 바이러스 - 매개 감염을 보여줍니다.

성인 마우스 Utricle 및 아데노 바이러스 - 매개 지원하는 세포 감염의 해부

Hearing loss and balance disturbances are often caused by death of mechanosensory hair cells, which are the receptor cells of the inner ear.  Since there ...

dissection-adult-mouse-utricle-adenovirus-mediated-supporting-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

23.6K 조회수.  Medical University of South Carolina. Mechanosensory 세포는 내이 (内耳)의 수용체 세포입니다. 최고의 특성화 체외에서 모델 시스템은 어른 생쥐에서 utricles의 장기 문화를 활용합니다. 우리는 성인 마우스 utricle의 절개를 제시하고, 우리는 교양 utricles에 세포를 지원하는 아데노 바이러스 - 매개 감염을 보여줍니다.

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Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

여러 마우스 Neuroanatomical 자기 공명 영상

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

연구

신경과학

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

망막 안료 상피의 전체 마운트를위한 마우스 아이의 해부

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). Animal models are necessary for studying the etiopathology and potential therapies of cerebrovascular diseases. Imaging the vasculature in large animals is relatively easy. However, developing vessel imaging methods of murine brain disease models is desirable due to the cost and availability of genetically-modified mouse lines. Imaging the murine cerebral vascular tree is a challenge. In humans and larger animals, the gold standard for assessing the angioarchitecture at the macrovascular (conductance) level is x-ray catheter contrast-based angiography, a method not suited for small rodents.
In this article, we present a method of cerebrovascular casting that produces a durable skeleton of the entire vascular bed, including arteries, veins, and capillaries that may be analyzed using many different modalities. Complete casting of the microvessels of the mouse cerebrovasculature can be difficult; however, these challenges are addressed in this step-by-step protocol. Through intracardial perfusion of the vascular casting material, all vessels of the body are casted. The brain can then be removed and clarified using the organic solvent methyl salicylate. Three dimensional imaging of the brain blood vessels can be visualized simply and inexpensively with any conventional brightfield microscope or dissecting microscope. The casted cerebrovasculature can also be imaged and quantified using micro-computed tomography (micro-CT)1. In addition, after being imaged, the casted brain can be embedded in paraffin for histological analysis.
The benefit of this vascular casting method as compared to other techniques is its broad adaptation to various analytic tools, including brightfield microscopic analysis, CT scanning due to the radiopaque characteristic of the material, as well as histological and immunohistochemical analysis. This efficient use of tissue can save animal usage and reduce costs. We have recently demonstrated application of this method to visualize the irregular blood vessels in a mouse model of adult BAVM at a microscopic level2, and provide additional images of the malformed vessels imaged by micro-CT scan. Although this method has drawbacks and may not be ideal for all types of analyses, it is a simple, practical technique that can be easily learned and widely applied to vascular casting of blood vessels throughout the body.

In this article, we present a simple, practical technique for cerebrovascular casting that is easy to perform and can be utilized to image the vascular tree of the adult mouse brain.

3D 이미징 및 형태학의 분석을위한 성인 마우스 뇌혈관 캐스팅

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. Reciprocally, medium spiny neurons in the striatum that give rise to the striatonigral (direct) pathway innervate the substantia nigra2. The development of these axon tracts is dependent upon the combinatorial actions of a plethora of axon growth and guidance cues including molecules that are released by neurites or by (intermediate) target regions3,4. These soluble factors can be studied in vitro by culturing mdDA and/or striatal explants in a collagen matrix which provides a three-dimensional substrate for the axons mimicking the extracellular environment. In addition, the collagen matrix allows for the formation of relatively stable gradients of proteins released by other explants or cells placed in the vicinity (e.g. see references 5 and 6). Here we describe methods for the purification of rat tail collagen, microdissection of dopaminergic and striatal explants, their culture in collagen gels and subsequent immunohistochemical and quantitative analysis. First, the brains of E14.5 mouse embryos are isolated and dopaminergic and striatal explants are microdissected. These explants are then (co)cultured in collagen gels on coverslips for 48 to 72 hours in vitro. Subsequently, axonal projections are visualized using neuronal markers (e.g. tyrosine hydroxylase, DARPP32, or &beta;III tubulin) and axon growth and attractive or repulsive axon responses are quantified. This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of mesostriatal and striatonigral axon growth and guidance during development. Using this assay, it is also possible to assess other (intermediate) targets for dopaminergic and striatal axons or to test specific molecular cues.

Explants from the midbrain dopamine system and striatum are used in a collagen matrix assay for the in vitro analysis of mesostriatal and striatonigral pathway development. In this assay axonal outgrowth and guidance can be manipulated and quantified. It can also be modified for assessing other regions or molecular cues.

마우스 Dopaminergic 및 3 차원 콜라겐 매트릭스 Assays의 Striatal Explants의 해부와 문화

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

애벌레의, Pupal 및 성인의 해부 및 Immunohistochemistry<em&gt; Drosophila</em&gt; 망막

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

전체 마운트 해부 및 성인 마우스 달팽이관의 면역 형광

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

마우스 뇌량 밑 영역에서의 분리 및 성인 신경 줄기 세포의 문화

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

간단한 한 단계 성인의 전체 마운트 준비에 대한 해부 프로토콜<em&gt; 초파리</em&gt; 두뇌

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Adult Mouse DRG Explant and Dissociated Cell Models to Investigate Neuroplasticity and Responses to Environmental Insults Including Viral Infection

This protocol describes an ex vivo model of mouse-derived dorsal root ganglia (DRG) explant and in vitro DRG-derived co-culture of dissociated sensory neurons and glial satellite cells. These are useful and versatile models to investigate a variety of biological responses associated with physiological and pathological conditions of the peripheral nervous system (PNS) ranging from neuron-glial interaction, neuroplasticity, neuroinflammation, and viral infection. The usage of DRG explant is scientifically advantageous compared to simplistic single cells models for multiple reasons. For instance, as an organotypic culture, the DRG explant allows ex vivo transfer of an entire neuronal network including the extracellular microenvironment that play a significant role in all the neuronal and glial functions. Further, DRG explants can also be maintained ex vivo for several days and the culture conditions can be perturbed as desired. In addition, the harvested DRG can be further dissociated into an in vitro co-culture of primary sensory neurons and satellite glial cells to investigate neuronal-glial interaction, neuritogenesis, axonal cone interaction with the extracellular microenvironment, and more general, any aspect associated with the neuronal metabolism. Therefore, the DRG-explant system offers a great deal of flexibility to study a wide array of events related to biological, physiological, and pathological conditions in a cost-effective manner.

In this report, the advantages of organotypic cultures and dissociated primary cultures of mouse-derived dorsal root ganglia are highlighted to investigate a wide range of mechanisms associated with neuron-glial interaction, neuroplasticity, neuroinflammation, and response to viral infection.

성인 마우스 DRG Explant와 해리 셀 모델 Neuroplasticity 바이러스 성 감염을 포함 한 환경 모욕에 대 한 응답을 조사 하

This protocol describes an ex vivo model of mouse-derived dorsal root ganglia (DRG) explant and in vitro DRG-derived co-culture of dissociated sensory ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

성인 마우스의 달팽이관 표면 준비

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...