이 작품은 NIH (5T32GM008275 - 22)와 미국 심장 협회 predoctoral 교제 (EAS)을에서 교부금에 의해 지원되었다; 화학 - 생물학 인터페이스 NIH (2T32GM071339 - 06A1) (MED로)에서 원정, 그리고으로부터 보조금 NIH (1DP2OD002177 - 01 및 NS067354 - 0110), 엘리슨 의료 재단, 그리고 빌과 멜린다 게이츠 재단 (JS로).

1. Hsp104 표현 <ol><li> 플라스미드가 E.에 정화를위한 고용 대장균, pPROEX - HTb - Hsp104은 TRC업자 26 inducible 제어 아래에있는 Hsp104 오픈 읽기 프레임이 포함되어 있습니다. 플라스미드는 TEV 테아제 절단하여 제거할 수 있습니다 N - 터미널 그의 6 태그 Hsp104을 생산하고 있습니다. 코돈 최적화 E.에 pPROEX - HTb - Hsp104 변환 전형적인 세균의 변환 절차를 사용하여 대장균은 BL21 - CodonPlus - RIL 전지 (Stratagene, 애질런트 테크놀로지) (예 : 제조 업체의 지시에 따라). 코돈 최적화 E.을 사용하는 것이 중요하다 Hsp104가 특이한 코돈 바이어스가 있기 때문에 대장균이 변형. </li><li> 100mL 2XYT 문화 (USB.의 레시피 : 16g / L 카세 펩톤, 10g / L 효모 추출물, 5g / L NaCl, 산도 7.0) 예방 100μg/mL 암피실린 신선한 transformants와 34μg/mL chloramphenicol과 보충과 37 야간 성장 ° 200rpm에서 잡고 C. </li><li> 6 2L flasks에 100μg/mL 암피실린 및 34μg/mL chloramphenicol과 X 1L 2XYT에 밤새 문화 10mL의 예방. 37 ° C까지 OD 600 = 0.4-0.6에서 250rpm으로 흔들어. 떨고 중지하고 15 온도를 감소 ° C. 그것이 15 ° C.에 도달할 때까지 세포 배양기에서 30 분 대한 unagitated 평형 수 있도록 허용 일단 15 ° C는 1mM의 최종 농도에 IPTG를 추가하여 단​​백질 발현을 유도에 도달입니다. (12-16시간) 숙박 250rpm에서 떨고 이력서. </li></ol> 2. 세포 수확 및 용해 <ol><li> 4 20 분을 위해 4,000 rpm으로 원심 분리하여 세포를 수확 (precooled 로터에서) ° C (우리가 Sorvall RC 3BP + 원심 분리기를 사용하여). Hsp104 활동이 저하되기 때문에 후속 절차를 즉시 실시해야 할 때 E. 대장균 세포가 동결됩니다. 또한, 이후의 모든 단계가 얼음 또는 4 ° C.에서 수행되어야 </li><li> prechilled에 Resuspend 세포 펠렛 (얼음) 10mL에 용해 완충액 (40mM HEPES - 코이 산도 7.4, 500mM KCl, 20mM MgCl 2, 2.5 % (W / V) 글리세롤, 20mM 이미다졸, 5μM pepstatin, 전체 테아제 억제제 칵테일 (1 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 무료 tablet/50mL) 및 2mM β - 메르 캅 토 에탄올). </li><li> 얼음 물 속에 잠겨 열 교환기를 사용하는 프랑스 언론 (Emulsiflex) 균 질기와 세포 Lyse. 사용하기 전에 모든 셀 대단히 짧은 시간이 solubilized되었는지 확인합니다. 용해 버퍼 균 질기를 equilibrating 후, 15,000-18,000 PSI의 압력으로 실린더를 통해이 통과 완전 용해 충분합니다. 프랑스 언론 사용할 수없는 경우, sonication 다음 라이 소 자임과 부화는 (토론 참조) 사용할 수 있습니다. SDS - PAGE 분석 (1μL) (그림 Lysate. 2) lysed 세포의 작은 샘플을 저장합니다. </li><li> 4 20 분을 위해 16,000 rpm으로 원심 분리하여 세포 파편을 제거 ° C (우리가 + centifuge Sorvall RC5C를 사용). 다음 단계에 뜨는 유지하고 SDS - PAGE 분석을위한 표면에 뜨는 작은 샘플 (1μL)를 저장 (그림 니켈로드합니다. 2). </li></ol> 3. Hsp104 정화 <ol><li> 용해 버퍼 equilibrated 니켈 - 세파 로스 비즈 (GE)의 50 % 슬러리의 12mL (세포의 1L 당 2mL 니켈 - 세파 로스 비즈)와 단계 2.4에서 뜨는 섞는다. </li><li> 4 3 시간 동안 천천히 샘플을 회전 ° C 니켈 - 세파 로스가 균일하게 정지하고 했겠이 최소화 남아있을 것이다. 짧은 배양 시간은 가능하지만, 수확량을 감소합니다. 4 ° 프로 테아제 억제제의 존재에 C, 약간의 저하가 발생하고, 3시간 니켈 - 세파 로스 보육 시간은 최종 제품의 활동을 감소하지 않습니다. 4 2 분 원심 분리에 의해 니켈 - 세파 로스를 수집 ° C 2,000 RPM (Eppendorf 원심 분리기 5810R). SDS - PAGE 분석 (1μL)에 뜨는 작은 샘플을 저장하고 (그림을 통해 니켈 흐름 (FT). 2) 나머지는 폐기. </li><li> 세척 버퍼 (40mM HEPES - 코이 산도 7.4, 150mM KCl, 20mM MgCl 2, 2.5 % (W / V) 글리세롤, 20mM 이미다졸, 2mM β - 메르 캅 토 에탄올), 5 열 볼륨의 25 열 볼륨으로 검색 니켈 - 세파 로스 씻으십시오 Hsp104에 electrostatically 바인딩 오염 및 세척 버퍼의 25 열 볼륨을 제거 1M KCl과 버퍼를 씻는다. 4 2 분 원심 분리하여 각 씻고 나서 니켈 - 세파 로스를 수집 ° C 2,000 RPM (Eppendorf 원심 분리기 5810R). 각각의 세척과 원심 분리 사이클 후 흡인하여 버퍼를 제거합니다. </li><li> 1mL 용출 1mL 니켈 - 세파 로스마다 버퍼 (40mM HEPES - 코이 산도 7.4, 150mM KCl, 20mM MgCl 2, 2.5 % (W / V) 글리세롤, 350mM 이미다졸, 2mM β - 메르 캅 토 에탄올)과 함께 Hsp104, 믹스 니켈 - 세파 로스를 elute하기 4 ° C 20 분 동안 회전합니다. 높은 이미다졸 농도는 니켈 비드 - 그의 여섯 상호 작용을 방해. 4 2 분 원심 분리하여 빈 1.2 ML 회전 열 (생체 RAD) · 2,000 RPM (Eppendorf 원심 분리기 5810R)에서 C와 니켈 - 세파 로스를 제거합니다. (그림 니켈의 eluate합니다. 2) SDS - PAGE 분석을위한 eluate의 1μL을 저장합니다. 세포의 모든 리터 들어, Hsp104의 ~ 15mg이 단계에서 얻어진다. </li><li> MWCO 30,000 Amicon 울트라 (밀을 사용하여 버퍼 Q (20mM 트리스 - HCL 산도 8, 0.5mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 5mM MgCl 2, 50mM NaCl)에 버퍼 교환 eluatelipore) 15mL 원심 농축기 단위. 첫째, 10 배 단백질을 희석하기 위해 버퍼의 Q 14.5mL를 추가 후 ~ 1.5mL에 단백질을 집중. 버퍼 교환 3 회 반복합니다. 증가 산도 낮은 소금 Hsp104가 높은 부정적인 요금을 보장합니다. </li><li> 버퍼 Q equilibrated 자원 Q 6mL 칼럼 (GE)를 사용하여 음이온 교환 크로마 토그래피를 통해 Hsp104 정화. 주입 전에 단백질이 낮은 단백질 바인딩 Millex GP PES 분리막 0.22μM 주사기 필터 (Millipore)를 통해 필터링됩니다. 우리는 1mL/min의 유량을 사용합니다. 20 %의 버퍼 1 열 볼륨 약하게 결합 단백질 거리에 씻으 Q + (20mM 트리스 - HCL 산도 8, 0.5mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 5mM MgCl 2, 1M NaCl). 5 열 권 이상의 선형 그라디언트로 Elute Hsp104 (20 % -50 % 버퍼 Q +) (그림 3). 1ml 분수를 수집합니다. Hsp104 대부분의 변종은 일반적으로 ~ 400mM NaCl (31mS/cm)에 elute. SDS - PAGE 분석 (그림 3, 삽입)에 대한 최대 분수 (1μL)의 샘플을 저장합니다. </li><li> Amicon 원심 농축기를 사용하여 그의 6 태그를 제거하려면, 교환 단백질은 절단 버퍼 (20mM HEPES - 코이 산도 7.4, 140mM KCl, 10mM MgCl 및 2)에 (단계 3.5 참조) 위의 설명합니다. 제조 업체의 지침에 따라 proTEV 단백 분해 효소 (Promega) 또는 AcTEV 프로 테아제 (Invitrogen)을 사용합니다. Hsp104 전체 절단에 필요한 다음과 같습니다 Hsp104 위해, 우리는 TEV 프로 테아제의 높은 비율을 것으로 나타났습니다. 우리는 12μg Hsp104 당 1 프로 테아제 단위의 비율을 사용합니다. 절단은 4, 16 시간 보육 ° C. 다음, 2-4 시간 동안 30 ° C에서 수행되어야 최종 Hsp104 농도는 20 - 75μM 모노머 사이 여야합니다. 초과 절단 반응에 Hsp104의 금액 (비즈 짐을 수지 ML 당 단백질 15mg 바인딩할 수 있습니다 가정)을 니켈 - 세파 로스를 추가하여 니켈 - 세파 로스 (GE)과 나머지 His6 - 태그 Hsp104 및 TEV 프로 테아제를 고갈. 4 2,0​​00 RPM에서 2min에 대한 centrifuging하여 빈 스핀 열 (생체 RAD)으로 구슬을 제거 ° C. 절단, 그리고 uncleaved 단백질의 제거 (그림 4) 보장하기 위해 SDS - PAGE 분석을위한 절단 (1μL) 전후의 샘플을 수집합니다. </li><li> 3.5 단계에서 설명한대로 MWCO 30,000 Amicon 울트라 (Millipore)를 사용하여 크기를 제외 버퍼 (20mM HEPES - 코이 산도 7.4, 140mM KCl, 10mM MgCl 2, 0.1mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1mM DTT)로 교환. </li><li> 더 크기 배제 크로마 토그래피를 통해 Hsp104 정화. 크기 제외 버퍼 equilibrated Superose 6 또는 Superdex 200 열 (GE에서 모두) (그림 5)를 사용합니다. 주입 전에 단백질이 낮은 단백질 바인딩 Millex GP PES 분리막 0.22μM 주사기 필터 (Millipore)를 통해 필터링됩니다. 단백질 미만 10mg 들어, 3백분의 10 사이즈 열 (24mL)을 사용할 수 있으며 0.5ml 분수가 수집됩니다. 10mg보다 큰 샘플의 경우 60분의 12 크기 열이 (120mL)을 사용해야하고 1 ML의 분수는 회수됩니다. 흐름 속도와로드 샘플 볼륨에 대한 제조 업체의 지침을 참조하십시오. 정화 후, Hsp104의 분수가 같은 그림에 표시된 풀링됩니다. 5 Amicon 원심 농축기 장치 (Millipore)에 집중. 아래에 설명된대로 Hsp104가 저장됩니다. 전체 길이 Hsp104을 정화의 최종 수율이 문화를 시작하는 ~ 1 - 3mg 당 리터입니다 Hsp104 저하 제품 및 오염 물질을 분리 물질의 손실로 인해. </li></ol> 4. Hsp104 Disaggregase 활동 <ol><li> 정화 후에, 그것은 disaggregation 분석에 Hsp104 활동을 평가하는 것이 좋습니다. 일반적으로, 우리는 루시페라제 재가입 분석 2 (그림 6) 사용합니다. 이 분석에서 Hsp70 보호자 시스템 (Hsp70와 Hsp40) disaggregates 요소 - 변성 반딧불 루시페라제 합산이와 함께 Hsp104. 가용성 루시페라제는 oxyluciferin, 빛을 출시 반응 luciferin의 산화를 catalyzes. 모니터링 발광, 상대 재활 성화, 따라서 disaggregation으로 루시페라제의 결정 수 있습니다. Hsp104는 synergistically Hsp70 공동 보호자 시스템과 협력 수 있어야합니다. 복구 발광의 양은 정확한 Hsp70에 따라 달라집니다 : Hsp40 쌍이 활용. 우리는 일상적으로 Hsp72와 Hsp40을 (분석 설계) 사용합니다. 혼자 Hsp40 (그림 6) : 최소한 활성 Hsp104은 Hsp72에 의해 재활 성화에 비해 루시페라제의 재활 성화에 5 배 증가를 생산한다. 활동의이 수준에 도달하지 Hsp104 준비가 삭제됩니다. </li></ol> 5. Hsp104 저장 <ol><li> 단기 저장을 위해, Hsp104는 ° C 크기 제외 버퍼 4 보관하실 수 있습니다. 그러나, 활동 ° C와 급격히 일주 후 4 4 2-3일 후 감소됩니다 ° C. disaggregation의 assays을 위해 우리는 Hsp104가 정화 후에 가능한 빨리 사용해야하는 것이 좋습니다. 이상적으로, Hsp104는 아밀로이드 disaggregation의 assays 즉시 사용해야합니다. </li><li> 단백질은 장기 저장해야하는 경우 Hsp104이 저장 버퍼 (20mM HEPES - 코이 산도 7.4, 140mM KCl, 10mM MgCl 2, 0.1mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1mM DTT, 10 % 글리세롤 (W / V))로 교환합니다. 100μl aliquots는 액화 질소에 냉동 및 -80 ° C.에 저장된 스냅 아르 동결 - 해동 사이클이 대폭 Hsp104 활동을 줄일 수그리고는 피해야한다. 우리는 천천히 얼음에 Hsp104을 해동하는 것이 좋습니다. 아밀로이드 - disaggregase 활동 -80 1 개월 후 급격히 감소됩니다 ° C. </li></ol> 6. 대표 결과 및 피규어 : <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. Hsp104은 Bifunctional disaggregase입니다. 무질서 집계 (왼쪽 그림 참조)의 Disaggregation은 Hsp70 보호자 시스템 (Hsp70와 Hsp40) 2의 협력이 필요합니다. Hsp104의 remodels은 체외에서 Hsp70와 Hsp40의 도움없이 아밀로이드 집계를 (오른쪽 그림 참조) 주문하지만, Hsp70과 Hsp40은 아밀로이드 26,28에 대한 Hsp104 활동을 향상시킬 수 있습니다. 총체적 구조, disaggregation을 촉진하기 위해 중앙 채널을 통해 기판 ​​translocation에 Hsp104 커플 ATP 가수 분해의 두 가지 유형에 대한. 티로신 베어링 구멍 루프는 중앙 채널을 49-52로 셔틀 기판 참여합니다. <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 니켈 - 세파 로스 선호도 정화 단계의 SDS - PAGE 분석. Lysate, 니켈로드, 니켈 FT와 니켈의 eluate 샘플 40~20% 트리스 - HCL 1.0mm 기준 젤 (생물 RAD) 및 Coomassie 자국을 사용하여 SDS - PAGE에 의해 fractionated되었습니다 . 모든 Hsp104가있는 NI - 세파 로스에 바인딩할 수입니다. 광범위한 분자량 마커 (생체 RAD)이 (차선 왼쪽) 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. 니켈 - 세파 로스의 eluate의 자원 Q 정화. 블루 추적은 280nm, 녹색 추적에서 흡광도를 나타냅니다는 % 버퍼 Q +를 (50 %에서 최대) 나타냅니다. 20 % elutes 첫 번째 피크, Q + 불순물, 열화 제품과 부적 절한 접힌 Hsp104가 포함되어 있습니다. 두 번째 주요 피크 제대로 접힌 적극 Hsp104가 포함되어 있습니다. 흐름 율은 1ml/min되었습니다. 20-50% Q +에서 기울기는 30 분 또는 5 열 볼륨입니다. 삽입 : 피크 분수가 4-20% 트리스 - HCL 1.0mm 기준 젤 (생물 RAD) 및 Coomassie 자국을 사용하여 SDS - PAGE 분석하여 해결하고 있습니다. 광범위한 분자량 마커 (생체 RAD)가 (왼쪽) 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig4.jpg" alt="그림 4"/> 그림 4. proTEV 프로 테아제 절단 단계의 SDS - PAGE 분석. 그의 6 Hsp104 자원 Q 정화의 30 4 다음 ° C와 16시간 ° C. 4 시간 동안 proTEV 프로 테아제로 처리했습니다 샘플 4~20% 트리스 - HCL 1.0mm 기준 젤 (생물 RAD) 및 Coomassie 자국을 사용하여 SDS - PAGE에 의해 fractionated되었습니다. proTEV 죽습 Hsp104 더 신속하게 마이 그 레이션합니다. 3.7 단계에서 설명한대로 TEV 프로 테아제와 uncleaved Hsp104는 니켈 - 세파 로스와 소진되었습니다. 광범위한 분자량 마커 (생체 RAD)가 (왼쪽) 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig5.jpg" alt="그림 5"/> 그림 5. Hsp104의 크기 - 배제 정화가. Hsp104가 더욱 Superose 6 겔 여과 칼럼 (3백분의 10, GE)를 통해 정화했다 죽습. 유속 = 0.4ml/min. 점선 라인 사이의 절정은 풀링된 분수를 나타냅니다. 삽입 : 피크 분수가 4-20% 트리스 - HCL 1.0mm 기준 젤 (생물 RAD) 및 Coomassie 자국을 사용하여 SDS - PAGE 분석하여 해결하고 있습니다. 광범위한 분자량 마커 (생체 RAD)가 (왼쪽) 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig6.jpg" alt="그림 6"/> 그림 6. 루시페라제 재활 성화 분석. 변성 반딧불 루시페라제 집계 (50nM)는 25 ° C.에서 Hsp72와 Hsp40 (1μM) (분석 설계에서 모두), Hsp104 (6μM 모노머) 또는 Hsp104, Hsp72와 Hsp40에 대한 90 분 중 하나와 함께 incubated되었습니다 변성 루시페라제은 완전히 Hsp104와 Hsp40/Hsp72 모두의 면전에서 활성화됩니다. 복구된 발광은 무한 M1000 플레이트 리더 (Tecan)에서 측정됩니다. 값 의미 ± SEM (N = 3)을 나타냅니다.

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

타임 라인 : 최대한 Hsp104 활동에 우리가 전체 정화 체계는 최대한 신속하게 완료하는 것이 좋습니다. 그러나, 정화 단계의 숫자는 항상 실용적되지 않을 수 있습니다 요구하는 일정을 만듭니다. 정화 단계가 가능한 빨리 실시하는 경우, 30에서 부화의 2-4시간까지 밤새 표현의 마지막에서 시간 ° TEV 프로 테아제와 C가 약 9~11시간입니다. 일시 정지 한 잠재적인 장소는 TEV 절단 단계를 수행합니다. 절대적으로 필요한 경우 Hsp104은 (단계 5.2) 위에서 설명한대로이 단계 이후 냉동 스냅 수 있습니다. 해동 및 정화 Hsp104가 다음 생화학 assays 즉시 사용해야합니다 후 크기 배제 크로마 토그래피 (단계 3.9)은 다음 즉시 수행됩니다. 또한 유도 단계는 37에서 2 시간 간소 수 있습니다 ·이가 감소하지만 C는 전반 얻을 수 있습니다. 잠재 합병증이 정화 방식과 똑바로 앞으로이다. 그러나, 몇 가지 중요한 단계 및 절차 대안은 아래에 설명되어 있습니다. 대체 세포 용해 : 프랑스의 보도를 사용할 수없는 경우 다음 sonication 다음 라이 소 자임 치료가 효과적인 세포 용해 방법입니다. 용해 버퍼 resuspended 전지 2mg/ml 라이 소 자임의 최종 농도 얼음에 30 분 1L 세포 펠렛 당 암탉 계란 라이 소 자임 (시그마)의 20mg과 함께 incubated 있습니다. 세포는 다음 microtip와 MisonixSonicator 3000을 사용하여 레벨 9에서 두 30초 파열에 대한 sonicated 수 있습니다. 세포 현탁액을 sonication 버스트 사이에 1min 위해 얼음 incubated입니다. 현탁액은 점도 및 색상을 변경하면 용해가 발생했습니다. (단계 2.4) 위에서 설명한 세포 파편을 뺍니다. 프랑스어 언론 용해가 sonication으로 선호하기 때문에이 최소화 Hsp104 저하 및 Hsp104 활동의 손실. TEV 프로 테아제 절단 : 호기심, pPROEX - Htb - Hsp104 그의 여섯 태그 TEV 단백 분해 효소에 의해 절단에 특히 강한되고 제조 업체에서 권장하는 TEV 프로 테아제의 약 두 배 용량을 필요로합니다. 그것이 완전히 제거되지 않은 경우이 태그의 제거 그의 6 태그 Hsp104 disaggregase 활동을 방해 pPROEX - Htb으로 필수적입니다. 완전히 기능 그의 6 태그 Hsp104가 필요한 경우 (고갈 실험 26 예) 우리가 사용하는 것이 좋습니다 그의 6 태그 Hsp104 그의 6 태그 disaggregase 활동 26에 영향을주지 않습니다 Schirmer과 Lindquist 47에서 설명한 개념입니다. 이 단백질은 프로토콜 TEV 절단 단계가 생략 제외하고 위에서 설명한을 사용하여 정화하실 수 있습니다. 우리가 위에서 설명한이 프로토콜은 이전의 접근 26,47,48보다 손쉬운입니다. 단계 급속 및 감소 번호는 단백질의 적은 섭동 가능하며 따라서 높은 구조 및 기계론의 연구 Hsp104 적합 정제 및 활성 산출.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> BL21 - CodonPlus - RIL 관할 전지 </td><td> Stratagene, 애질런트 테크놀로지 </td><td> 230255 </td></tr><tr><td> 2XYT 국물 </td><td> USB </td><td> 75,864 </td></tr><tr><td> 완료, 미니, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 무료 프로 테아제 억제제의 정제 </td><td> 호슈 </td><td> 1,836,170 </td></tr><tr><td> Pepstatin </td><td> 시그마 </td><td> P4265 </td></tr><tr><td> NI - 세파 로스 6 빠른 흐름 </td><td> GE 헬스케어 </td><td> 17-5318-02 </td></tr><tr><td> Amicon 울트라 - 15 원심 필터 유닛 (MWCO 30,000) </td><td> Millipore </td><td> UFC903008 </td></tr><tr><td> 자원 Q - 6ml 칼럼 </td><td> GE 헬스케어 </td><td> 17-1179-01 </td></tr><tr><td> proTEV 프로 테아제 </td><td> Promega </td><td> V6052 </td></tr><tr><td> AcTEV 프로 테아제 </td><td> Invitrogen </td><td> 12575015 </td></tr><tr><td> Superose 6 3백분의 10 GL </td><td> GE 헬스케어 </td><td> 17-5172-01 </td></tr><tr><td> Hsp40 </td><td> 분석 설계 </td><td> SPP - 400 </td></tr><tr><td> Hsp72 </td><td> 분석 설계 </td><td> ADI - NSP - 555 </td></tr></tbody></table>

purification of hsp104, a protein disaggregase

Hsp104는 효모에서 hexameric AAA + 단백질 1, 단백질 disaggregation 20-10로 커플 ATP의 가수 분해 (그림 1)입니다. 이 활동은 두 가지 핵심 선택적 장점을 부여. 첫째, Hsp104에 의해 무질서 집계의 renaturation는 열 충격 3,5,11,12를 포함하여 다양한 단백질 misfolding 스트레스 후 효모 생존을 최대한 활용하십시오. 둘째, Hsp104에 의해 교차 베타 아밀로이드 원섬유의 리모델링은 유익한의 저수지로 수많은 prions (전염성 amyloids)를 이용하여 13-22 phenotypic 변화를 물려 전할 수있는하는 효모 수 있습니다. 현저하게, Hsp104 직접 효모 prion 단백질 Sup35 및 Ure2 23-30로 구성 포함 preamyloid의 oligomers과 아밀로이드 원섬유을 remodels. 이 아밀로이드 - 리모델링 기능은 효모 Hsp104 전문 패싯입니다. E. 대장균의 orthologue, ClpB는 리모델링의 preamyloid의 oligomers 또는 아밀로이드 원섬유 26,31,32에 실패합니다. Hsp104의 orthologues는 동물, perplexingly,를 제외하고 삶의 모든 왕국에서 볼 수 있습니다. 사실, 동물 세포가 어떤 효소 시스템을 가지고 있는지 여부를 renaturation (오히려 저하 이상)에 커플 단백질 disaggregation 알 수없는 33-35 유지. 따라서, 우리와 다른 Hsp104가 독성 preamyloid의 oligomers과 아밀로이드 원섬유 4,7,23,36-38에 특정 단백질의 misfolding과 관련된 다양한 neurodegenerative 질병에 대한 치료 요원으로 개발을지도 모른다고 제안했습니다. 직접 질병와 관련된 집계 종을 대상도 트리 트먼트가 없습니다. 그러나 Hsp104는 파킨슨병 23뿐만 아니라 PrP 39 아밀로이드 형태로 연결되어있는 알파 synuclein의 구성 독성 oligomers과 아밀로이드 원섬유을 녹이고. 중요한 것은 Hsp104는 단백질 집합을 줄이고 파킨슨병 23 헌팅턴의 질병 38 설치류 모델에서 neurodegeneration을 ameliorates. 이상적으로, 치료를 최적화하고 부작용을 최소화하기 위해, Hsp104 공학 및 선택 질문 4,7의 질병에 중앙 구체적인 집계를 개조하는 potentiated 것입니다. 그러나, 어떻게 Hsp104 disaggregates의 제한된 구조 및 기계론의 이해 집계 구조와 관련이없는 단백질 같은 다양한 레퍼토리이 노력에게 30,40-42을 좌절. Hsp104의 구조와 메커니즘을 이해하기 위해서는 최소한의 구성 요소로 순수 단백질과 reconstitute의 disaggregase 활동을 연구하는 것이 필수적입니다. Hsp104는 ADP 또는 ATP의 존재 또는 염기 43-46의 부재 높은 단백질 농도에 hexamerizes ~ 5.3의 PI와 102kDa 단백질이다. 여기, 우리는 E.에서 매우 적극적인, 안정적인 Hsp104의 정화를 위해 최적화된 프로토콜을 설명 대장균. E.의 사용 대장균은 단순 대규모 생산을 허용하고 우리의 방법은 여러 Hsp104 변종에 대한 신속하고 안정적으로 수행할 수 있습니다. 우리 프로토콜 Hsp104 순도를 높이고 E.에서 이전 정화 방법에 비해 그의 6 태그 제거를 단순화 대장균 47. 또한, 우리의 프로토콜을 두 개 더 최근의 프로토콜 26,48보다 손쉬운하고 편리합니다.

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Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

여기서 우리는 매우 적극적인 Hsp104, hexameric AAA + 단백질 효모, 단백질 disaggregation에 커플 ATP의 가수 분해로부터의 정화를 위해 프로토콜을 설명합니다. 이 제도는의 친화력 정화를위한 His6 - 태그 구축을 악용<em&gt; E. 대장균</em&gt; 음이온 교환 크로마 토그래피, TEV 프로 테아제와 His6 태그 제거, 크기 - 배제 크로마 토그래피에 의해 따랐다.

Hsp104의 정화, 단백질 Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

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Nanyang Technological University

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Biology

17.3K 조회수.  University of Pennsylvania. 여기서 우리는 매우 적극적인 Hsp104, hexameric AAA + 단백질 효모, 단백질 disaggregation에 커플 ATP의 가수 분해로부터의 정화를 위해 프로토콜을 설명합니다. 이 제도는의 친화력 정화를위한 His6 - 태그 구축을 악용 E. 대장균 음이온 교환 크로마 토그래피, TEV 프로 테아제와 His6 태그 제거, 크기 - 배제 크로마 토그래피에 의해 따랐다.

비디오: Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be greatly facilitated by the production of milligram amounts of pure, folded ligand binding domains. Attempts to heterologously express periplasmic ligand binding domains of bacterial chemoreceptors in Escherichia coli (E. coli) often result in their targeting into inclusion bodies. Here, a method is presented for protein recovery from inclusion bodies, its refolding and purification, using the periplasmic dCACHE ligand binding domain of Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 as an example. The approach involves expression of the protein of interest with a cleavable His6-tag, isolation and urea-mediated solubilisation of inclusion bodies, protein refolding by urea depletion, and purification by means of affinity chromatography, followed by tag removal and size-exclusion chromatography. The circular dichroism spectroscopy is used to confirm the folded state of the pure protein. It has been demonstrated that this protocol is generally useful for production of milligram amounts of dCACHE periplasmic ligand binding domains of other bacterial chemoreceptors in a soluble and crystallisable form.

A procedure is presented for the refolding of the dCACHE periplasmic ligand binding domain of Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 from inclusion bodies and the purification to yield milligram quantities of protein.

효율적인 Refolding 및 Chemoreceptor Ligand 바인딩 도메인의 정화 방법

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

연구

생화학

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, resulting in the expression of the Huntingtin protein (Htt) or N-terminal fragments thereof with an expanded polyglutamine (polyQ) stretch.
The exon1 of the Huntingtin protein (Httex1) is the smallest Htt fragment that recapitulates many of the features of HD in cellular and animal models and is one of the most widely studied fragments of Htt. The small size of Httex1 makes it experimentally more amenable to biophysical characterization using standard and high-resolution techniques in comparison to longer fragments or full-length Htt. However, the high aggregation propensity of mutant Httex1 (mHttex1) with increased polyQ content (&#8805;42) has made it difficult to develop efficient expression and purification systems to produce these proteins in sufficient quantities and make them accessible to scientists from different disciplines without the use of fusion proteins or other strategies that alter the native sequence of the protein. We present here a robust and optimized method for the production of milligram quantities of native, tag-free Httex1 based on the transient fusion of small ubiquitin related modifier (SUMO). The simplicity and efficiency of the strategy will eliminate the need to use non-native sequences of Httex1, thus making this protein more accessible to researchers and improving the reproducibility of experiments across different laboratories. We believe that these advances will also facilitate future studies aimed at elucidating the structure-function relationship of Htt as well as developing novel diagnostic tools and therapies to treat or slow the progression of HD.

Here, we present a robust and optimized protocol for the production of milligram quantities of native, tag-free monomers and fibrils of the exon1 of the Huntingtin protein (Httex1) based on the transient fusion of small ubiquitin related modifier (SUMO).

네이티브, 태그 Huntingtin Exon1 모노 머와 스모 융합 전략을 사용 하 여 소의 생성

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of reactive oxygen species, and more. These fluctuations can lead to a widespread protein unfolding, aggregation, and cell death. Therefore, cells have evolved a dynamic and stress-specific network of molecular chaperones, which maintain a "healthy" proteome during stress conditions. ATP-independent chaperones constitute one major class of molecular chaperones, which serve as first-line defense molecules, protecting against protein aggregation in a stress-dependent manner. One feature these chaperones have in common is their ability to utilize structural plasticity for their stress-specific activation, recognition, and release of the misfolded client. 
In this paper, we focus on the functional and structural analysis of one such intrinsically disordered chaperone, the bacterial redox-regulated Hsp33, which protects proteins against aggregation during oxidative stress. Here, we present a toolbox of diverse techniques for studying redox-regulated chaperone activity, as well as for mapping conformational changes of the chaperone, underlying its activity. Specifically, we describe a workflow which includes the preparation of fully reduced and fully oxidized proteins, followed by an analysis of the chaperone anti-aggregation activity in vitro using light-scattering, focusing on the degree of the anti-aggregation activity and its kinetics. To overcome frequent outliers accumulated during aggregation assays, we describe the usage of Kfits, a novel graphical tool which allows easy processing of kinetic measurements. This tool can be easily applied to other types of kinetic measurements for removing outliers and fitting kinetic parameters. To correlate the function with the protein structure, we describe the setup and workflow of a structural mass spectrometry technique, hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry, that allows the mapping of conformational changes on the chaperone and substrate during different stages of Hsp33 activity. The same methodology can be applied to other protein-protein and protein-ligand interactions.

One of the most challenging stress conditions that organisms encounter during their lifetime involves the accumulation of oxidants. During oxidative stress, cells heavily rely on molecular chaperones. Here, we present methods used to investigate the redox-regulated anti-aggregation activity, as well as to monitor structural changes governing the chaperone function using HDX-MS.

Hsp33의 Redox 규제 보호자 활동을 정의 하 고 수소 중수소 교환 질량 분석을 사용 하 여 Hsp33에 구조적 변화를 매핑

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination of chromatin function and DNA-associated processes. This modification involves a sequential action of several enzymes including E1 ubiquitin-activating, E2 ubiquitin-conjugating and E3 ubiquitin-ligase and is reversed by deubiquitinases (DUBs). Ubiquitination induces degradation of proteins or alteration of protein function including modulation of enzymatic activity, protein-protein interaction and subcellular localization. A critical step in demonstrating protein ubiquitination or deubiquitination is to perform in vitro reactions with purified components. Effective ubiquitination and deubiquitination reactions could be greatly impacted by the different components used, enzyme co-factors, buffer conditions, and the nature of the substrate.&#160; Here, we provide step-by-step protocols for conducting ubiquitination and deubiquitination reactions. We illustrate these reactions using minimal components of the mouse Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1), BMI1, and RING1B, an E3 ubiquitin ligase that monoubiquitinates histone H2A on lysine 119. Deubiquitination of nucleosomal H2A is performed using a minimal Polycomb Repressive Deubiquitinase (PR-DUB) complex formed by the human deubiquitinase BAP1 and the DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD) domain of its co-factor ASXL2. These ubiquitination/deubiquitination assays can be conducted in the context of either recombinant nucleosomes reconstituted with bacteria-purified proteins or native nucleosomes purified from mammalian cells. We highlight the intricacies that can have a significant impact on these reactions and we propose that the general principles of these protocols can be swiftly adapted to other E3 ubiquitin ligases and deubiquitinases.

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in cellular processes and is tightly coordinated by deubiquitination. Defects in both reactions underlie human pathologies. We provide protocols for conducting ubiquitination and deubiquitination reaction in vitro using purified components.

체외 유비퀴틴화 및 뉴클레오소말 히스톤의 이중화 율법의 비퀴틴화 어설션

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Purification of Active Photosystem I-Light Harvesting Complex I from Plant Tissues

This method is used to isolate Photosystem I (PSI) together with the Light Harvesting Complex I (LHCI), its native antenna, from plants. PSI-LHCI is a large membrane protein complex coordinating hundreds of light harvesting and electron transport factors and is the most efficient light harvesting system found in nature. Photons absorbed by the four LHCA antenna proteins that make up LHCI are transferred through excitonic interaction to the PSI core reaction center and are used to facilitate light-driven charge separation across the thylakoid membrane, providing reducing power and energy for carbon fixation in photoautotrophic organisms. The high quantum efficiency of PSI makes this complex an excellent model to study light-driven energy transfer. In this protocol, plant tissue is mechanically homogenized, and the chloroplasts are separated from the bulk cellular debris by filtration and centrifugation. The isolated chloroplasts are then osmotically lysed, and the thylakoid membranes are recovered via centrifugation and solubilized using the detergent n-dodecyl-beta-maltoside. The solubilized material is loaded onto an anion exchange column to collect most of the chlorophyll-containing complexes. Larger complexes are precipitated from the solution, resuspended in a small volume, and loaded on sucrose gradients to separate the major chlorophyll-containing complexes. The resulting sucrose gradient fractions are characterized to identify the band of interest containing PSI-LHCI. This protocol is highly similar to the protocol used in the crystallization of plant PSI-LHCI with some simplifications and relies on methods developed over the years in the lab of Nathan Nelson.

This protocol describes the isolation of Photosystem I (PSI) - Light Harvesting Complex I (LHCI) from plant tissues. PSI along with PSII is responsible for the conversion of light to chemical energy in oxygenic photoautotrophs and has a quantum efficiency of ~1, making it a target for studying light-driven energy transfer.

This method is used to isolate Photosystem I (PSI) together with the Light Harvesting Complex I (LHCI), its native antenna, from plants. PSI-LHCI is a ...

A Purification and In Vitro Activity Assay for a (p)ppGpp Synthetase from Clostridium difficile

Kinase and pyrophosphokinase enzymes transfer the gamma phosphate or the beta-gamma pyrophosphate moiety from nucleotide triphosphate precursors to substrates to create phosphorylated products. The use of &#947;-32-P labeled NTP precursors allows simultaneous monitoring of substrate utilization and product formation by radiography. Thin layer chromatography (TLC) on cellulose plates allows rapid separation and sensitive quantification of substrate and product. We present a method for utilizing the thin-layer chromatography to assay the pyrophosphokinase activity of a purified (p)ppGpp synthetase. This method has previously been used to characterize the activity of cyclic nucleotide and dinucleotide synthetases and is broadly suitable for characterizing the activity of any enzyme that hydrolyzes a nucleotide triphosphate bond or transfers a terminal phosphate from a phosphate donor to another molecule.

A Purification and In Vitro Activity Assay for a pppGpp Synthetase from Clostridium difficile

Here, we describe a method for purifying histidine-tagged pyrophosphokinase enzymes and utilizing thin layer chromatography of radiolabelled substrates and products to assay for the enzymatic activity in vitro. The enzyme activity assay is broadly applicable to any kinase, nucleotide cyclase, or phosphor-transfer reaction whose mechanism includes nucleotide triphosphate hydrolysis.

정화 및 체 외에서 활동 분석 결과 (p) ppGpp Clostridium 남과 어울리지 않 는에서 합성에 대 한

Kinase and pyrophosphokinase enzymes transfer the gamma phosphate or the beta-gamma pyrophosphate moiety from nucleotide triphosphate precursors to ...

면역학 및 감염병학

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has been disrupted. Loss of function following gene disruption is subsequently restored by exogenous addition of the product of the disrupted gene. This helps to determine the function of the gene. A method previously described involves generating a gtfC gene-disrupted Streptococcus mutans strain. Here, an undemanding method is described for purifying the gtfC gene product from the newly generated S. mutans strain following the gene disruption. It involves the addition of a polyhistidine-coding sequence at the 3&#8242; end of the gene of interest, which allows simple purification of the gene product using immobilized metal affinity chromatography. No enzymatic reactions other than PCR are required for the genetic modification in this method. The restoration of the gene product by exogenous addition after gene disruption is an efficient method for determining gene function, which may also be adapted to different species.

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Described here is a simple method for the purification of a gene product in Streptococcus mutans. This technique may be advantageous in the purification of proteins, especially membrane proteins and high molecular mass proteins, and can be used with various other bacterial species.

연쇄상 구균 뮤탄에서 높은 분자 질량 단백질의 정화

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...

Purification of Human S100A12 and Its Ion-induced Oligomers for Immune Cell Stimulation

In this protocol, we describe a method to purify human calcium-binding protein S100A12 and its ion-induced oligomers from Escherichia coli culture for immune cell stimulations. This protocol is based on a two-step chromatography strategy, which comprises protein pre-purification on an anion-exchange chromatography column and a subsequent polishing step on a hydrophobic-interaction column. This strategy produces S100A12 protein of high purity and yield at manageable costs. For functional assays on immune cells eventual remnant endotoxin contamination requires careful monitoring and further cleaning steps to obtain endotoxin-free protein. The majority of endotoxin contaminations can be excluded by anion-exchange chromatography. To deplete residual contaminations, this protocol describes a removal step with centrifugal filters. Depending on the available ion-strength S100A12 can arrange into different homomultimers. To investigate the relationship between structure and function, this protocol further describes ion-treatment of S100A12 protein followed by chemical crosslinking to stabilize S100A12 oligomers and their subsequent separation by size-exclusion chromatography. Finally, we describe a cell-based assay that confirms the biological activity of the purified protein and confirms LPS-free preparation.

This protocol describes a purification method for recombinant tag-free calcium binding protein S100A12 and its ion-induced oligomers for human monocyte stimulation assays.

면역 세포 자극을 위한 인간 S100A12 및 그 이온 유도 올리고머의 정화

In this protocol, we describe a method to purify human calcium-binding protein S100A12 and its ion-induced oligomers from Escherichia coli culture for ...

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. Protein purification protocols should combine efficiency, simplicity and cost effectiveness1. Here, we describe the GST-His method as a new small-scale affinity purification system for recombinant proteins, based on a N-terminal Glutathione Sepharose Tag (GST)2,3 and a C-terminal 10xHis tag4, which are both fused to the protein of interest. The latter construct is used to generate baculoviruses, for infection of Sf9 infected cells for protein expression5. GST is a rather long tag (29 kDa) which serves to ensure purification efficiency. However, it might influence physiological properties of the protein. Hence, it is subsequently cleaved off the protein using the PreScission enzyme6. In order to ensure maximum purity and to remove the cleaved GST, we added a second affinity purification step based on the comparatively small His-Tag. Importantly, our technique is based on two different tags flanking the two ends of the protein, which is an efficient tool to remove degraded proteins and, therefore, enriches full-length proteins. The method presented here does not require an expensive instrumental setup, such as FPLC. Additionally, we incorporated MgCl2 and ATP washes to remove heat shock protein impurities and nuclease treatment to abolish contaminating nucleic acids. In summary, the combination of two different tags flanking the N- and the C-terminal and the capability to cleave off one of the tags, guaranties the recovery of a highly purified and full-length protein of interest.

In the present protocol, we demonstrate a highly efficient and cost-effective small-scale protein purification method, which allows purification of recombinant proteins by uniquely combining a cleavable GST-tag and a small His-tag.

GST - 그의 정화 : 전체 길이 정제 된 단백질을 항복 2 단계 친화력 정화 프로토콜

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

생물학

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

의 모니터링 단백질 접힘에 대한 결합 분석 실험<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...