넉넉한 MIN6 세포를 공급 콜로라도 대학 볼더의 크리스티 Anseth 연구소에 감사합니다. 이 프로젝트에 대한 자금은 NSF에 의해 제공되었습니다.

1. PEGDM 합성 및 광활성이있는 제품 PEGDM의 macromer 솔루션 준비 <ol><li> 하드 플라스틱 뚜껑이있는 40mL 유리관에 PEG의 2g을 (선형, 10000 다) 무게. </li><li> methacrylic 무수물 약 308μL 추가하고 느슨하게 병을 캡. </li><li> 표준 국내 전자 레인지에서 2 분 정도 높이 전자렌지는 유리병. 입고 더위 강한 장갑, 추가로 5 분 높이 후 철저하게 소용돌이 유리병, 전자 레인지. </li><li> 간단히 유리병 장갑으로 취급 할만큼 침착 수 있습니다. 그것을 모자를 벗다하고 병을 소용돌이 치는 동안 서서히 메틸렌 클로라이드를 추가합니다. 솔루션은 필요에 따라 샘플을 vortexing, 명확하고 균일한 나타나도록 충분히 추가합니다. 이 ML - 사용 메틸렌 클로라이드의 총 부피는 1.5 있어야합니다. </li><li> 추운 200 ML에 침전물의 PEGDM는 솔루션 dropwise을 추가하여 디에틸 에테르을 만들어 냈다. </li><li> 진공 여과에 의해 PEGDM를 수집하고 건조 수 있습니다. </li><li> 적절한 금액 PEGDM를 해산탈이온수 (일반적으로 100 -150 ML)의. </li><li> 1000 다의 분자량 차단과 투석 튜브에 5 일 동안 탈이온수에 대한 솔루션을 Dialyze. 하루에 한 번씩 물을 교체합니다. </li><li> -80 ° C 야간에 적절한 용기 동결에 솔루션 나누어지는. 정화 흰색 PEGDM 가루를 얻을 수 4 일 동안 솔루션을 Lyophilize. ° C 사용하지 않을 때 4 분말을 저장합니다. </li><li> 광활성이있는의 PEGDM 솔루션을 준비하려면 먼저 탈이온수에 Irgacure 2959을 용해하여 0.5 중량 %의 photoinitiator 주식 솔루션을 준비합니다. 소용돌이 솔루션과 어둠 속에 그것을 저장합니다. </li><li> 10 wt % 인 PEGDM와 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)에 0.025 wt % Irgacure 2959 솔루션을 준비합니다. 소용돌이는 철저하게 PEGDM의 해산을 보장합니다. 우리는 일반적으로 한 번에이 솔루션의 1mL를 준비합니다. </li><li> 1.8 ML의 microcentrifuge 튜브에 0.2 μm의 주사기 필터를 통해 필터링하여 솔루션을 소독. 알루미늄 호일에 튜브를 두르고4에서 저장 ° C </li></ol> 2. 문화, 감염, 그리고 MIN6 세포의 집합 <ol><li> MIN6 세포는 37 humidified 환경에서 10 % FBS, 7mM 포도당, 100 단위 / ML 페니실린 / 스트렙토 마이신, 및 0.5 μg / ML amphotercin B ° C와 5퍼센트 CO 2와 보충 RPMI 1640 배지에서 양식입니다. </li><li> 치료 문화 플라스크 표면에서 세포를 릴리스 37과 세포 린스, 매체를 대기음 ° C 칼슘 / 마그네슘 - 무료 HBSS, HBSS를 대기음 후 37 ° C 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션이 ML을 추가하고 세포를 허용 3 분 품어. </li><li> 단단히 무료 세포를 노크 술병의 측면을 항아리 다음, 37 8 ML을 추가 ° C 미디어와 적극적으로 세포 현탁액을 피펫 아래로 거품을 소개하지 돌보는. </li><li> 멸균 15 ML의 원심 튜브에 세포를 피펫과 hemocytometer 또는 절차를 집계 다른 세포를 사용하여 셀 카운트를 수행합니다. </li><li> 제조와 세포를 감염시킬 준비에바이러스는 먼저 감염되는 세포의 총 수를 확인하고 감염 원하는 다중성 (방어) (셀 당 50-100 전염성 입자)를 달성하는 데 필요한 바이러스 서스펜션의 볼륨을 계산합니다. </li><li> 신중 1.8 ML의 microcentrifuge 튜브 HBSS의 사전 aliquoted 볼륨으로 바이러스 서스펜션의 적절한 금액을 pipeting하여 HBSS에있는 바이러스를 희석. 통합 세포의 잘 HBSS 당 50 μL가 적합합니다. </li><li> pipet 6 잘 서스펜션 문화 판의 우물에 잘마다 400,000 세포를 달성하는 데 필요한 볼륨을 다음, 자신의 튜브에 그들을 pipeting 아래로 세포를 해산. </li><li> 원하는 입니다만을 달성하기 위해 각 잘하는 희석 바이러스의 적절한 볼륨을 추가합니다. </li><li> 최대 1.7 ML에 전체 볼륨을 얻을 수 있도록 각 잘하는 매체를 추가합니다. </li><li> 인큐베이터 안에서 궤도 흔드는에 접시를 놓습니다. 매체 부드럽게 우물 (~ 100 RPM) 주위 세척 있도록 낮은 설정에 뿌리를 설정합니다. aggrega에 전지를 허용24~36시간에 대한 테. 75-175 μm의의 대략 직경 집계가 형성되어야합니다. </li></ol> 3. PEGDM에서 세포의 캡슐 <ol><li> 전지는 분산 (2.4 단계) 또는 다음과 같은 집합 (단계 2.10)로 캡슐 수 있습니다. 히드로겔 전구체 PEGDM 솔루션은 액체이기 때문에 전지는 사전 c​​rosslinking와 히드로겔 형성에 정착하는 경향이 있습니다. 정착이 같은 큰 집계와 마찬가지로, 신속하게 발생할 것으로 예상되고있다면, 그것은 세포가 젤의 중심 비행기 정착되도록 두 단계에있는 히드로겔를 생산하기 위해 도움이 될 수 있습니다. 분산 세포에 적합 한 단계 히드로겔 합성 절차 표시됩니다 (그림 2)와 두 단계의 절차는 (3.2-3.9)뿐만 아니라 그림 (그림 3)과 아래에 자세한됩니다. </li><li> 히드로겔가 1 ML 플라스틱 주사기의 해제 테이퍼 팁을 절단하고 랙에 종료를 열 배치하여 형성됩니다있는 용기를 만듭니다. </li><li> 광활성이있는 제품 PEGDM의 Pipet 20 μL 있도록플런저에 주사기의 열린 끝을에 lution 볼륨이 전체 플런저 표면을 커버해야하고. 평평한 유체 표면을 달성하기 위해 작은 단위로 플런저를 조정합니다. </li><li> 랙 및 약 8 분 동안 자외선 램프 (365nm, ~ 7 MW / cm 2) 아래 랙은 히드로겔 crosslinking 수 있도록 위치에 pipet를 놓습니다. 이 시간 동안 세포의 준비가 시작됩니다 </li><li> 1.8 ML의 microcentrifuge 튜브에 세포 / 집계의 원하는 번호를 포함 Pipet 볼륨, 모자, 5 분 동안 130g의 튜브를 원심. </li><li> micropipettor를 사용하면, 신중하게 튜브의 끝에 세포 펠렛을 방해하지 않고 미디어를 제거합니다. 미디어 머리가 펠릿 접근로서, 세밀한를 사용하여 10 μL pipet 팁 도움이 될 수 있습니다. </li><li> 부드럽게 광활성이있는 제품 PEGDM 솔루션 (집계 작업을하면 넓은 mouthed pipet 팁 사용) 20 μL의 세포 펠렛을 resuspend 및 일 위에 주사기로 세포 현탁액을 추가할E는 이전에 히드로겔 부분을 가교. </li><li> 히드로겔 공사를 완료하는 데 자외선의 추가 팔분에 주사기를 쉽게받을 수 있습니다. 완료되면, 세포가 완전히 원통형 히드로겔 (그림 3) 내에 캡슐해야합니다. </li><li> 주사기로부터 간단히 젤 씻어 24 잘 접시의 우물에 HBSS 1 ML에 히드로겔를 꺼냅니다. 원하는 조건 24 - 잘 판 문화의 잘 미디어 1 ML로 젤을 전송합니다. </li></ol> 4. Hypoxia 추적 <ol><li> 어떤 시점에서 문화, 이미지 중에 전지 hypoxic 신호의 개시를 추적하기 위해 형광 현미경을 사용하여. 당신이 다중 잘 플레이트의 이미지거나 현미경 스테이지에 배치하기 전에 현미경 슬라이드로 젤을 전송 군데되는 무엇에 따라. DS 레드 피크 여기는 556nm에서 달성하고 피크 방출 586nm에서 발생합니다. 배출은 매우 강렬하므로 photobleaching가 observ을하지 않았습니다에드는 문제가 될 수 있습니다. 단백질 생산 및 첫번째 신호 검출의 개시 사이의 지연 시간은 약 12​​ 시간입니다. 신호는 각 신호 세포를 식별할 수있을만큼 구체적이지만, 해상도가 세포내 신호 지방화를 결정하는 불충 분한 수 있습니다. 신호 세포에서 신호는 일반적으로 세포질 전반에 걸쳐 균일하게 관찰합니다. 이 증가 단백질 표현, 전체 단백질 축적, 또는 지연 단백질 성숙에 의한 경우에는 우리가 아직 완전히 결정하지 않은 생각 신호 강도는 또한 hypoxia로 확장 노출 증가시킬 수 있습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 PEG의 히드로겔에 캡슐 MIN6 집계의 대표적인 예는 그림 4에 표시됩니다. 가교 겔은 반응이 수행된하는 선박의 모양을내어 걸쳐 고체 것입니다. 이식은 외국 바디 재의 예방에 도움 위해 부드러운 외부 표면 겔이 바람직합니다sponse. 겔 내에서 세포 집계는 완전히 모체로 묶여 있으며 homogenously 더 나은 영양 운송 수 있도록 배포되어야합니다. MIN6 집계에 hypoxic 신호의 대표 이미지는 그림 5에서 그림입니다. 마커 바이러스에 감염된 동일한 MIN6 집계는 이미지 캡처 전에 20% O 2 (5A) 또는 1% O 44시간 2 (5B) 중 하나에 교양되었습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig1.jpg" /> 그림 1. 우리 hypoxia 마커 시스템의 활동의 도식. DS 레드 DR 유전자와 업스트림 HRE업자의 Adenoviral 삽입은 HIF - 1의 제어하에 형광 단백질의 hypoxia 유발 생산 수 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig2.jpg" /> 그림 2.의 단일 단계 캡슐에 대한 절차 플로우 차트는 CR에 MIN6 세포를 분산PEGDM의 히드로겔을 osslinked. 각 젤 들어, 분산형 전지 광활성이있는 제품 PEGDM의 macromer 솔루션 40μL에서 중단되었습니다. 이 참수를 1mL 주사기에 배치되고 히드로겔는 10~12분 후 365nm 자외선 아래에서 형성됩니다. 완료되면, 히드로겔 디스크는 주사기에서 제거 세탁과 부화를위한 중간 채워진 잘 플레이트에 배치됩니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig3.jpg" /> 그림 3. 가교 PEGDM의 히드로겔에서 집계 MIN6 세포의 이중 캡슐 단계에 대한 절차 플로우 차트. 각 젤 들어, 반 젤은 처음 8 분 동안의 광활성이있는 PEGDM의 macromer 솔루션 20μL의 UV crosslinking에 의해 형성됩니다. MIN6 집합체는 신중하게 사전 구성된 반 젤 위에 추가됩니다 광활성이있는 제품 macromer 솔루션의 추가 20μL에서 중단되었습니다. 전체 젤 완전히 중간에 캡슐 집계와 자외선 노출의 추가 팔분에 의해 형성젤의 비행기. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig4.jpg" /> 그림 4. 20X 배율 아래 40μL 히드로겔 이미지. MIN6 집합체 (~ 400,000 총 세포)가 명확하게 젤 내에서 볼 수 있습니다. 히드로겔 직경 (바 = 1mm) 약 6mm입니다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig5.jpg" /> 그림 5. 형광 hypoxia는 PEGDM의 히드로겔에서 집계 MIN6 세포 신호. 44시간 20 % O 2 캡슐 후 부화에 배치되었다 세포가 2% 44시간에 대한 O 2 incubated 후 캡슐되었습니다 세포가 분명 유비 쿼터스 신호를 표시하는 동안 hypoxia 신호를 (A) 표시되지 않습니다. (바 = 100μm) (B).

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기서 제시하는 방법이 아닌 생리적 조건의 최소한의 사용 PEG의 히드로겔의 세포 캡슐을위한 빠르고 간단한 방법을 제공합니다. PEG는 biocompatibility 및 수정의 용이성을 위해 매우 유용한 캡슐 소재를 나타냅니다. 광활성이있는 솔루션에 PEG 비율의 간단한 변화는, 예를 들어, 기공 크기를 통해 기계와 같은 압축 계수와 같은 속성, 그리고 교통 속성을 조정하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 PEG 쉽게 사이드 체인의 추가에 의해 수정됩니다. PEG의 hydrogels 따라서 유망한 임상 장치와 체외 연구를위한 유연한 플랫폼을 모두 나타내는 PEG - 캡슐 세포에서 hypoxia를 추적하는 방법도 소개되었습니다. 이 방법은 hypoxia 감지의 단순과 관심의 세포를 희생 필요가 피하에 유용합니다. 이 기술은 그 회사를 만드는 조건을 다양한 세포 유형의 다양한 적용될 수 있습니다넓은 efulness. 예를 들어, 줄기 세포 차별 화를위한 신호로서 hypoxia는 줄기 세포 micromass 문화에서 추적할 수 있습니다. 그러나,이 방법은 세포가 나중에 집계됩니다 분산되는 전지 시스템 또는 시스템을 해산하기 위해 적용할 수 있습니다. 또한, 형광 신호의 감지가 크거나 밀도 조직에서 어려울 수 있습니다.

<table border="1"><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항 </td></tr><tr><td> PEG </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 309028 - 500G </td><td></td></tr><tr><td> Methacrylic 무수물 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 276685 - 100ML </td><td></td></tr><tr><td> 마이크 로파 </td><td> 에머슨 </td><td> MW8784SB </td><td></td></tr><tr><td> Vortexer </td><td> 과학 산업 </td><td> SI - A236 </td><td></td></tr><tr><td> 염화 메틸렌 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> D65100 - 1L </td><td></td></tr><tr><td> 디에틸 에테르 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 346136 - 1L </td><td></td></tr><tr><td> 투석 튜브 </td><td> 스펙트럼 </td><td> 132,640 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 실험실 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 냉동 장치 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td&gt; Lyophilizer </td><td> Labconco </td><td> 7,670,521 </td><td></td></tr><tr><td> 배기기 </td><td> 웨일스 사람 </td><td> 8917Z - 01 </td><td></td></tr><tr><td> Irgacure 2959 </td><td> Ciba - Geigy </td><td> 029891301PS04 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Mediatech </td><td> 21-022 - 이력서 </td><td></td></tr><tr><td> 주사기 필터 </td><td> VWR </td><td> 28145-477 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Mediatech </td><td> * </td><td> * 사용자 정의 제제 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> PAA Laboratories의 </td><td> A15 - 351 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 - 스트렙토 마이신 </td><td> Mediatech </td><td> 30-002 - CI </td><td></td></tr><tr><td> Amphotericin B </td><td> Mediatech </td><td> 30-003 - CF </td><td></td></tr><tr><td> 보육기 </td><td> 써모 과학 </td><td> 3597 </td><td> Napco 시리즈 8000 WJ W / O2 억제 </td></tr><tr><td> 트립신 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Mediatech </td><td> 25-052 - CI </td><td></td></tr><tr><td> 궤도 흔드는</td><td> VWR </td><td> 12620-926 </td><td></td></tr><tr><td> UV 램프 </td><td> 산요 Denri </td><td> FLR40SBLB / M </td><td> 이 40W, 365nm blacklight 파란색 자외선 전구를 보유하고 </td></tr><tr><td> 원심 분리기 </td><td> Eppendorf </td><td> 5811 000.010 * </td><td> * 주문 번호입니다. 모델 5810 R </td></tr><tr><td> 현미경 </td><td> 니콘 </td><td> TI - ND6 - PFS </td><td> 556nm 여기 / 586nm 방출을위한 filterset로 </td></tr></table>

tracking hypoxic signaling within encapsulated cell aggregates

당뇨병 제 1 형, 인슐린 생산의 손실과 잠재적으로 치명적인 고혈당증의 췌장 β - 세포 결과의 면역 파괴. 외인성 인슐린 주사에 대한 대안 치료 옵션으로, 기능성 췌장 조직의 이식은 1,2을 탐험했습니다. 이러한 접근 방식은 normoglycemia보다 자연, 장기 복원의 약속을 제공합니다. 숙주의 면역 시스템에서 기증자의 조직을 보호 거절과 캡슐이 목표를 달성하는 데 사용하는 방법입니다 방지하기 위해 필요합니다. 이러한 알지네이트요 3 아가로 오스 4와 같은 생물 학적 파생 자료, 캡슐 건설을위한 전통적인 선택을하고 있지만 염증이나 양분과 산소 운반을 방해 할 수 fibrotic 전면에 자라난 5 유발 수 있습니다. 또는, 합성 폴리 (에틸렌 글리콜) (PEG) 기반 hydrogels는 고순도에서 쉽게 작용 가능한 아닌 굴욕 아르제어 기공 크기를 가지고 있고, 매우 6,7,8, biocompatible 수 있습니다. 추가 혜택으로, PEG의 hydrogels가 아닌 생리적 온도 6,7의 신청서를 요구하지 않는 간단한 사진 crosslinking 반응에 빠르게 형성 수 있습니다. 이러한 절차는 여기에 설명되어 있습니다. crosslinking 반응, photoinitiator의 자외선 열화, 1 - [4 - (2 - Hydroxyethoxy) - 페닐]은 2 - 히드록시 -2 - 메틸 -1 - 프로판 -1 - 한 (Irgacure 2959)가, 자유 래디 칼의 생성 공격하는 사슬에서 dimethacrylated PEG (PEGDM) 유도 crosslinking의 비닐 탄소 - 탄소 이중 채권이 끝납니다. Crosslinking 10 분 이내에 얻을 수 있습니다. 이러한 방식으로 구축 PEG의 hydrogels은 호의 셀 7,9을 지원하는 그림, 그리고 낮은 photoinitiator 농도와 UV 조사에 짧은 노출은 캡슐 조직 10 가능성과 기능에 해로운 없습니다되었습니다. 방법과 우리의 PEG는 아래에 설명된 우리가 메타 크릴 레이트 동안 PEGDM는 방향 수 있습니다ectly 같은 시그마와 같은 업체에서 구입했습니다. 캡슐의 내재된 결과는 혈관 네트워크에서 세포의 격리입니다. 영양분의 공급, 특히 산소 따라서 감소 및 확산에 의해 제한됩니다. 이 감소 산소 가용성은 특히 인슐린 분비 그의 기능은 산소가 11-13에 크게 의존 β - 세포에 영향을 수 있습니다. 캡슐 구성과 기하학은 또한 산소 확산 속도와 길이에 영향을 것입니다. 따라서, 우리는 또한 PEG의 캡슐 안에 hypoxic 세포를 식별하는 기술을 설명합니다. 재조합 아데노 바이러스와 세포의 감염 세포 hypoxia - inducible 인자 (HIF) 경로 14을 활성화하는 경우 생산이 될 수있는 형광 신호 수 있습니다. HIFs은 hypoxia에 대한 transcriptional 응답의 주요 규제이므로, 그들은 hypoxic 신호 15 검출을위한 이상적인 대상 마커를 나타냅니다. 이러한 접근 방식은 hypoxi 쉽고 빠르게 감지를 허용C 세포. 간단히, 아데노 바이러스는 hypoxia - 반응 요소 (HRE) trimer의 통제하에 빨간 형광 단백질 (Clontech에서 DS 레드 DR)의 순서가 있습니다. 낮은 산소 조건에 의해 HIF - 1의 안정화는 형광 단백질 (그림 1)의 전사를 운전합니다. 이 바이러스의 건설에 대한 자세한 내용은 이전에 15 공개되었습니다. 바이러스는 -80에서 10 % 글리세롤에 저장됩니다 ° C 3.4 X 10 10 pfu / ML의 농도 1.5 ML의 원심 분리기 튜브의 많은 150 μL aliquots로. 우리가 실험실에서 이전 연구는 집계가 20 % 산소 문화의 사주를 통해 자신의 생존을 유지 등 MIN6 세포가 캡슐 것으로 나타났습니다. MIN6 2 교양 합산 또는 1 %의 산소가 ethidium의 브로마이드와 얼룩뿐만 아니라 20 %의 산소의 세포에 상대적인 형태학의 변화에​​ 의한 괴사성 세포의 두 신호를 (여전히 85-90 % 정도 가능한)했다. 20 % 표시 집계의 부드러운 구형 모양이 로스되었습니다T와 합산보다 세포의 분열증 집단처럼 나타났다. 낮은 산소 스트레스 생존의 발음 드롭을 일으키지 않습니다 있지만, 그것은 분명 MIN6 집합과 포도당 자극 인슐린 분비 15 일까지 측정과 같은 기능을 영향을 미치는 것입니다. 20 % 캡슐 세포와 1 %의 산소 서양 얼룩 분석도 DsRed DR 단백질의 표현과 상호 낮은 산소 조건에서 배양해 세포에 대한 HIF - 1α의 상당한 증가를 보였다.

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Tracking Hypoxic Signaling within Encapsulated Cell Aggregates

가교 PEG의 히드로겔에서 세포의 사진 캡슐에 대한 방법을 설명합니다. 캡슐 murine insulinoma 이내 Hypoxic 신호 (MIN6) 집계는 형광 마커 시스템을 사용하여 추적할 수 있습니다. 이 시스템은 세포 표현형 변화 hypoxic 신호의 히드로겔 발판과 상관 내에서 세포의 직렬 시험을 수 있습니다.

캡슐화된 세포 집계 내에서 추적 Hypoxic 신호

In Diabetes mellitus type 1, autoimmune destruction of the pancreatic &beta;-cells results in loss of insulin production and potentially lethal ...

tracking-hypoxic-signaling-within-encapsulated-cell-aggregates

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.6K 조회수.  University of South Carolina. 가교 PEG의 히드로겔에서 세포의 사진 캡슐에 대한 방법을 설명합니다. 캡슐 murine insulinoma 이내 Hypoxic 신호 (MIN6) 집계는 형광 마커 시스템을 사용하여 추적할 수 있습니다. 이 시스템은 세포 표현형 변화 hypoxic 신호의 히드로겔 발판과 상관 내에서 세포의 직렬 시험을 수 있습니다.

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3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

수정 된 두 개의 광자 현미경에서 3D 궤도 추적 : 세포 내 소포의 추적에 응용

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

연구

생체공학

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

세 가지 차원 콜라겐 매트릭스 내에서 세포의 이동 분석

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

위한 도구로 리포좀 캡슐화 된 근적외선 형광의 형광 담금질<em&gt; 생체</em&gt; 광학 이미징

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions are likely affected by the mechanical environment in which binding and signaling take place. A recent study demonstrated that mechanical force can regulate antigen recognition by and triggering of the T-cell receptor (TCR). This was made possible by a new technology we developed and termed fluorescence biomembrane force probe (fBFP), which combines single-molecule force spectroscopy with fluorescence microscopy. Using an ultra-soft human red blood cell as the sensitive force sensor, a high-speed camera and real-time imaging tracking techniques, the fBFP is of ~1 pN (10-12 N), ~3 nm and ~0.5 msec in force, spatial and temporal resolution. With the fBFP, one can precisely measure single receptor-ligand binding kinetics under force regulation and simultaneously image binding-triggered intracellular calcium signaling on a single live cell. This new technology can be used to study other membrane receptor-ligand interaction and signaling in other cells under mechanical regulation.

We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.

형광 생체막 포스 프로브 : 하나의 세포에서 수용체 - 리간드 속도론의 동시 정량 및 바인딩에 의한 세포 내 신호

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Transport Properties of Ibuprofen Encapsulated in Cyclodextrin Nanosponge Hydrogels: A Proton HR-MAS NMR Spectroscopy Study

The chemical cross-linking of &#946;-cyclodextrin (&#946;-CD) with ethylenediaminetetraacetic dianhydride (EDTA) led to branched polymers referred to as cyclodextrin nanosponges (CDNSEDTA). Two different preparations are described with 1:4 and 1:8 CD-EDTA molar ratios. The corresponding cross-linked polymers were contacted with 0.27 M aqueous solution of ibuprofen sodium salt (IP) leading to homogeneous, colorless, drug loaded hydrogels.
The systems were characterized by high resolution magic angle spinning (HR-MAS) NMR spectroscopy. Pulsed field gradient spin echo (PGSE) NMR spectroscopy was used to determine the mean square displacement (MSD) of IP inside the polymeric gel at different observation times td. The data were further processed in order to study the time dependence of MSD: MSD = f(td). The proposed methodology is useful to characterize the different diffusion regimes that, in principle, the solute may experience inside the hydrogel, namely normal or anomalous diffusion. The full protocols including the polymer preparation and purification, the obtainment of drug-loaded hydrogels, the NMR sample preparation, the measurement of MSD by HR-MAS NMR spectroscopy and the final data processing to achieve the time dependence of MSD are here reported and discussed. The presented experiments represent a paradigmatic case and the data are discussed in terms of innovative approach to the characterization of the transport properties of an encapsulated guest within a polymeric host of potential application for drug delivery.

The motion regimes of ibuprofen encapsulated in &#946;-cyclodextrin nanosponges polymer network are investigated using pulsed-field-gradient spin-echo (PGSE) NMR technique. Synthesis, purification, drug loading, implementation of the NMR pulse sequence and data analysis to work out the mean square displacement of the drug at several observation times are described in detail.

사이클로 덱스트린 Nanosponge 히드로 겔에서 이부 프로 펜 캡슐화의 전송 특성 : 양성자 HR-MAS NMR 분광학 연구

The chemical cross-linking of &#946;-cyclodextrin (&#946;-CD) with ethylenediaminetetraacetic dianhydride (EDTA) led to branched polymers referred to as ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

세포 외 매트릭스 내에서 임베디드 공학 3 차원 상피 조직

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. Recently, nanoparticles (NPs) have shown significant promise in the development of such delivery systems. Here, a liquid crystal NP (LCNP)-based delivery system has been employed for the controlled delivery of a water-insoluble dye, 3,3&#8242;-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO), from within the NP core to the hydrophobic region of a plasma membrane bilayer. During the synthesis of the NPs, the dye was efficiently incorporated into the hydrophobic LCNP core, as confirmed by multiple spectroscopic analyses. Conjugation of a PEGylated cholesterol derivative to the NP surface (DiO-LCNP-PEG-Chol) enabled the binding of the dye-loaded NPs to the plasma membrane in HEK 293T/17 cells. Time-resolved laser scanning confocal microscopy and F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging confirmed the passive efflux of DiO from the LCNP core and its insertion into the plasma membrane bilayer. Finally, the delivery of DiO as a LCNP-PEG-Chol attenuated the cytotoxicity of DiO; the NP form of DiO exhibited ~30-40% less toxicity compared to DiOfree delivered from bulk solution. This approach demonstrates the utility of the LCNP platform as an efficient modality for the membrane-specific delivery and modulation of hydrophobic molecular cargos.

A liquid crystal nanoparticle (LCNP) nanocarrier is exploited as a vehicle for the controlled delivery of a hydrophobic cargo to the plasma membrane of living cells.

액정 나노 입자 캐리어의 소수성화물 캡슐화의 대상 플라즈마 멤브레인 배달

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial distribution and activities of community members. We have developed a microwell array platform that can be used to rapidly assemble and track thousands of bacterial communities in parallel. This protocol highlights the utility of the platform and describes its use for optically monitoring the development of simple, two-member communities within an ensemble of arrays within the platform. This demonstration uses two mutants of Pseudomonas aeruginosa, part of a series of mutants developed to study Type VI secretion pathogenicity. Chromosomal inserts of either mCherry or GFP genes facilitate the constitutive expression of fluorescent proteins with distinct emission wavelengths that can be used to monitor community member abundance and location within each microwell. This protocol describes a detailed method for assembling mixtures of bacteria into the wells of the array and using time-lapse fluorescence imaging and quantitative image analysis to measure the relative growth of each member population over time. The seeding and assembly of the microwell platform, the imaging procedures necessary for the quantitative analysis of microbial communities within the array, and the methods that can be used to reveal interactions between microbial species area all discussed.

The development of microbial communities depends on a combination of factors, including environmental architecture, member abundance, traits, and interactions. This protocol describes a synthetic, microfabricated environment for the simultaneous tracking of thousands of communities contained in femtoliter wells, where key factors such as niche size and confinement can be approximated.

마이크로 웰 어레이 플랫폼 내 미생물 공동체 개발의 구성 및 추적

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

환경 상처 3 차원 생체 외에서 내 셀 마이그레이션 특성화

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although various RT-3D-SPT methods have been put forward in recent years, tracking high speed 3D diffusing particles at low photon count rates remains a challenge. Moreover, RT-3D-SPT setups are generally complex and difficult to implement, limiting their widespread application to biological problems. This protocol presents a RT-3D-SPT system named 3D Dynamic Photon Localization Tracking (3D-DyPLoT), which can track particles with high diffusive speed (up to 20 &#181;m2/s) at low photon count rates (down to 10 kHz). 3D-DyPLoT employs a 2D electro-optic deflector (2D-EOD) and a tunable acoustic gradient (TAG) lens to drive a single focused laser spot dynamically in 3D. Combined with an optimized position estimation algorithm, 3D-DyPLoT can lock onto single particles with high tracking speed and high localization precision. Owing to the single excitation and single detection path layout, 3D-DyPLoT is robust and easy to set up. This protocol discusses how to build 3D-DyPLoT step by step. First, the optical layout is described. Next, the system is calibrated and optimized by raster scanning a 190 nm fluorescent bead with the piezoelectric nanopositioner. Finally, to demonstrate real-time 3D tracking ability, 110 nm fluorescent beads are tracked in water.

This protocol details the construction and operation of a real-time 3D single particle tracking microscope capable of tracking nanoscale fluorescent probes at high diffusive speeds and low photon count rates.

실시간 3D 단일 입자 추적에 대 한 프로토콜

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...