우리는 애쉬튼 Belew, 카렌, 잭 Sharmishtha Musalga, 세르게이 Sulima, Shivani Reddy, 그들의 도움이 프로젝트에 대한 입력을위한 마이클 Rhodin 포함 Dinman 연구소의 구성원 모두 감사하고 싶습니다. 이 작품은 미국 심장 협회 (AHA 0630163N)에서 오전과 국립 보건원 (5R01 GM058859 - 12)에서 JDD에 보조금에 의해 지원되었다. JAL은 부모 부여 2,009 보완의 미국의 재투자 및 복구 법 (3R01GM058859 - 11S1)에 의해 지원되었다.

1. 시스테인의 준비 Sulfolink 수지 부과 <ol><li> 상온에서 Sulfolink 수지 (피어스)를 준비합니다. </li><li> 각 유리병에 배포 5 ML과 같은 2 인용 10 ML 플라스틱 튜브의 제조 업체에서 제공하는 Sulfolink 커플링 젤의 50 % 슬러리 10 ML 총 놓으십시오. </li><li> 간단히 850 XG에 튜브를 원심 조심스럽게 supernatants를 제거합니다. </li><li> 5 ML에 비즈를 resuspending XG 850에서 간략하게 centrifuging 및 피펫으로 뜨는을 제거하여 (50 MM 트리스, 산도 8.5, 5 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) 커플링 버퍼에 젤 세 번 씻으십시오. </li><li> 각각의 튜브에 연결 버퍼에 L - 시스테인의 50 MM 솔루션 다섯 ML 추가 및 25에서 1 시간 동안 슬러리를 혼합 ° C. </li><li> 위의 단계 1.4에서 설명한대로 세탁에 의해 L - 시스테인 잔류를 제거합니다. </li><li> 바인딩 버퍼 10 ML에서 젤 Resuspend [20 MM의 HEPES, pH를 7.6, 5 MM MG (OAc) 2, 60 MM NH 4 망할 CIA 2 MM DTT], 그리고 바인딩 버퍼 10 ML에서 세탁하여 수지를 평형3 번 단계는 1.4에서 설명했다. 10 ML의 원심 분리기 열, 모자 및 4에 저장된 ° C.에 가만히 따르다 수지 RNA 바인딩에 대한 수지 용량 ~ 20 ML 당 260 단위이다. </li></ol> 2. 시스테인을 사용하여 리보솜의 색층 정화는 Sulfolink 수지 부과 참고 : 단백 분해 효소의 활동이 문제가 될 증명 변형율과 함께 일하고있다면, 프로 테아제 억제 칵테일은 이후의 모든 버퍼에서 사용할 수 있습니다. <ol><li> 얼음에 모든 구성 요소를 유지하고 RNase없는 물을 살균 여과를 사용하는 모든 솔루션을 준비합니다. </li><li> 적절한 미디어 - 중반 로그 단계 (1.2 OD 595 = 0.6)에 숙박 효모 세포를 성장. 펠렛의 원심 분리에 의해 세포, 그리고 4 5 분 3,700 XG에 구속력이 버퍼와 원심 분리기에 1g의 세포를 씻어 ° C. </li><li> 바인딩 버퍼 1 ML 2 ML의 대략적인 총 볼륨에, 그리고 4 차게 0.5 mm 유리 구슬 같은 볼륨을 사용하여 방해 Resuspend 전지 ° C UBiospec 미니 구슬 때리는 (Bartlesville, OK)을 노래. 필요에 따라 샘플은 여러 튜브로 분할 수 있습니다. </li><li> 베크 만 - 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 Optima 최대 전자 초원 심 분리기 (풀러턴, CA)에서 30 분 동안 30,000 XG에서 원심 분리에 의해 손상되지 않은 세포 organelles와 세포 파편을 제거합니다. </li><li> 즉시 사용하기 전에, 펠렛 1,000 1 분에 대한 수지의 스토리지 솔루션을 제거하는 XG. 수지의 두 ML은 세포의 모든 일g에 사용됩니다. </li><li> 직접 청구 Sulfolink 슬러리에 맨이나 세포 파편 튜브의 아래쪽에있는 지질 분획 중의 오염, 그리고 장소를 최소화하기 위해 간병, 30,000 XG 회전 (S30)에서 세포 lysate의 supernatants를 제거합니다. 지질 층은 중 제거 또는 팁이 뜨는 넘어들어왔잖소 후 pipet에서 밖으로 밀어내는 의해 피할 수 있습니다. </li><li> 15 분 동안 혼합하지 않고 얼음 S30/Sulfolink 혼합물을 품어. </li><li> 15 ML 원뿔 튜브에 열을 놓고 1,000 XG에 원심 분리기R 만요. </li><li> 열, 손으로 믹스, 얼음에 추가 15 분 동안 품어로 다시 flowthrough의 분수를 놓습니다. </li><li> 15 ML 원뿔 튜브에 열을 놓고 일분 1,000 XG에 원심 분리기. flowthrough 폐기하십시오. </li><li> 캡 열에하고 구속력이 버퍼의 5 ML를 추가합니다. resuspended, 뚜껑을 제거하고, 일분 1,000 XG에서 열 원심을 원심 분리기 때까지 손으로 컬럼을 섞는다. 이 세척 프로토콜을 두 번 더 반복합니다. </li><li> 각 컬럼에 대한 용출 버퍼의 1.5 ML (20 MM HEPES - 코이, 산도 7.6, 10 MM MG (OAc) 2, 500 MM KCl, 2mM DTT, 0.5 MG / ML 헤파린)를 추가합니다. 손으로 slurries를 섞어, 2 분 동안 얼음에 품어 </li><li> 일분 1,000 XG에 새로 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기로 장소 열. eluate를 수집합니다. 한 번 더 그래서 최종 결합된 샘플 볼륨 ~ 3 ML되는 용출 단계를 반복합니다. 사용 수지는 헤파린없이 용출 버퍼로 세탁하고 구속력이 buffe와 평균 이어 수R, 다시 사용하기 위해 4 구속력이 버퍼의 10 ML 권 ° C에 저장됩니다. </li></ol> 3. Puromycin 처리 참고 : tRNA의 종 오염 제거하는 다른 방법은 ribosome 결선을 촉진하기 위해 포도당 고갈 미디어에 풍부한 포도당에서 전환하는 것입니다. 그러나 이것은 ribosome 기능과 농도에 영향을 미칠 수있는 효모 세포의 대사 상태를 변경 않습니다. 내생 peptidyl - tRNA, puromycin이 수행되는있는 치료에서 변이를 스트립하기 위해서. <ol><li> 상온에서 1M 코이 dropwise을 추가하여 pH를 7.5 100 MM의 puromycin 솔루션으로 중화. </li><li> eluate에 ~ 1mM 최종 농도 무력화 puromycin 솔루션을 추가합니다. </li><li> 1 ㎜의 최종 농도 100 MM GTP를 추가합니다. </li><li> 30 30 분 품어 ° C. </li></ol> 4. 글리세롤의 쿠션을 통해 침강에 의해 리보솜의 정화 <ol><li> 놓으 ML4 ML 볼륨 폴리 카보 네이트 초원 심 분리기 튜브에 쿠션 버퍼 (20 MM의 HEPES, pH를 7.6, 10 MM MG (OAc) 2, 500 MM KCl, 2 MM DTT, 25 % 글리세롤)의. </li><li> 부드럽게 계층 puromycin은 4 하룻밤 XG 쿠션 위에 용출 분수, 그리고 원심 분리기 샘플 100,000 ° C. 치료 </li><li> 원심 회전 날개에서 튜브를 제거하고, supernatants을 기음. </li><li> 쿠션 버퍼 1 ML로 두 번 정화 변이를 포함하는 알약을 씻으십시오. </li><li> 유리 막대를 사용하여 부드러운 마비로 쿠션 버퍼의 100 μl의 변이를 Resuspend. </li><li> 중단 후 parafilm와 튜브를 커버 한 시간 동안 감기에 방 와동에서 중간 속도로 흔들. </li><li> microcentrifuge 튜브, 4 최대 속도로 5 분간 원심 ° C로 내용을 전송 신선한 튜브에 supernatants를 제거합니다. </li><li> 단계를 반복 4.1-4.7 스토리지 버퍼의 100 μl (50 MM HEPES - 코이 산도 7.6, 50 MM NH 4 망할 CIA, 5 밀리미터 MG를 제외하고이 쿠션 버퍼의 ML하고,를 사용하여(OAc) 2, 1 ㎜ DTT, 25 % 글리세롤)이 대신 쿠션 버퍼의 단계 4.4 및 4.5에서 사용됩니다. </li><li> 계량 정화 리보솜 spectrophotometrically (1 260 = 20 효모 변이의 pmoles) 및 -80 ° C.에 저장 효모의 1g의 전형적인 결과는 리보솜의 300-400 pmoles 있습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 : 프로토콜의 3 대 각 단계에서 추출한 RNA 종의 예제는 그림 2에 표시됩니다. rRNAs가 있지만 주요 종 총 세포 lysates에있는 (T)이 다른 RNA 종의 다수도 포함되어 있습니다. Sulfolink 칼럼 (SL)에서 정화 리보솜은 또한뿐만 아니라이 종족에 대한 열 침대의 높은 친화력으로 인해 tRNAs 많은 양의가 포함되어 있습니다. peptidyl - tRNAs에서 펩티드의 가수 분해에 puromycin 결과와 함께이 분수 치료하고 리보솜에서 이러한 수종의 분리를 추진하고 있습니다. puromycin이 대접 샘플 (PM) 부족으로 공동 purifyin따라서 g tRNA의 종, 그리고 완전히 순수한 변이를 나타냅니다. 이전 8보고로서, 이러한 변이들을 상세 기능 및 구조 분석에 이상적인 기판을 만드는 고도의 손상과 화학적으로 활성화됩니다. <img src="/files/ftp_upload/3214/3214fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. 방법 흐름도가. sulfolink 수지 링크된 시스테인을 사용하여 리보솜의 색층 정화가 그려져 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/3214/3214fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. ribosome 준비 대표 분석. 총 RNA의 종류는 이후에 puromycin 대우 총 세포 lysates (T), Sulfolink 정화의 리보솜 (SL)와 Sulfolink 정화가 리보솜에서 추출한과 글리세롤 쿠션 (PM)를 통해 sedimented되었습니다. 레인 M은 RNA 크기 마커를 나타냅니다. 초와 18S rRNAs뿐만 아니라 tRNAs와 다른 RNA 수종을 나타내는 밴드가 표시됩니다. 모든차선은 RNA 2 μg 탑재했다.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Ribosome 정화 프로토콜은 기본적으로 저속 회전에서 cytosolic 분수를 수확, lysing 세포를 포함하고 고속 원심 분리 1 변이를 pelleting. 몇 가지 새로운 방법이 박테리아 리보솜을 정화에 사용되고있는 반면, 동일 eukaryotes 2-4 사실이 아니했다. 추가 단계 년, 예를 들어 소금 세척 및 글리세롤 방석 (예 : 5 참조) 함께 추가되었습니다 있지만, 효모 변이의 생화 학적 및 구조 연구는 대부분의 정화 과정에서 내생 굴욕 효소에 의해 저하되기 위해 자신의 성향에 의해 방해되었습니다 리보솜은 효소 6 이러한 클래스에 노출되는 동안 ultracentrifugation 단계 동안 시간의 긴 기간으로 인해. 전통적인 프로토콜과 관련된 주요 문제는 변이와 프로 테아제와 nucleases의 공동 정제이다. 그들의 열화이 결과 중에화학적으로 활성 변이의 낮은 수율로 인해 정화 과정. 프로 테아제 및 병원성 세균의 임상 분리에 존재 nucleases의 높은 수준 Sulfolink 수지 7 부과 시스테인을 사용하여 ribosome 정화를위한 색층 방법 개발되었다. 이 방법을 사용하여 격리 박테리아 리보솜에서 파생된 rRNAs과 단백질이 저하의 정도 낮은 수준을 보여, 따라서 정화 리보솜은 에리스로 마이신에 바인딩하고 단백질을 합성하기 위해 훨씬 더 많은 수 있었다. Sulfolink 수지에 ribosome 바인딩의 특정 화학 그러나 그것은 7 소수성 상호 작용을 포함 것으로 추측되었습니다 알 수 있습니다. 이러한 관측 Sulfolink 수지 크로마 토그래피 방법을 청구 시스테인은 또한 효모 변이에 적용됩니다 것을 제안하고, 그렇다면, 그것이 해결 수있는 문제의 대부분은 위에서 설명한. 따라서 우리는 그대로, 높은 활성 효모 ribo의 고립에 대해이 프로토콜을 적응somes. 신속하게 그리고 효율적으로 순수한 그 결과 변이, 비늘 잘 리보솜 8 높은 수량 향상 생화학 및 구조 특성, 더 많은 화학적으로 활성 ribosome 준비에서 nucleases와 프로 테아제 오염의 중요한 일부분의 분리 결과 열 색층 방법. 더 큰 차이점은 이러한 변이는 전통적으로 정화 리보솜으로 모두 같은 ribosomal 요소를 포함한다는 의미 전통적으로 정화 리보솜과 칼럼 크로마 토그래피를 통해 정화 그 사이 denaturing 단백질 겔에서 본 적이 있었다. 특별한주의를 필요로 프로토콜의 일부 단계가 있습니다. 효모 세포의 장애와 관련하여, 유리 비즈로 세포 현탁액의 정확한 1시 1분 비율 (권 / 권)가 중요합니다. 일반적으로 세포의 ~ 80 %는 2 분 안에 끝낼 수 있습니다. 중요한 것은, 오버 중단은 셀 organelles에서 굴욕적인 효소의 석방을 방지하기 위해 피해야한다.Sulfolink 칼럼에서 직접 얻은 변이가 프로 테아제와 nuclease 오염의 거의 완전히 자유로워 져야 표시 되었으나,이 분수에 tRNA의 높은 수준의 관찰 수지 잘 7,8로 tRNA를 바인딩 지적했다. 우리는 하류 생화학 assays는 ribosome / 리간드 바인딩, peptidyltransferase 활동 assays와 rRNA 구조 분석을 예로 tRNA 종의 존재가 방해 것으로 나타났습니다. Puromycin deacylated tRNAs 10-14과 함께 리보솜에서 릴리스 peptidyl - puromycin, 생산에 chromatographically 절연 변이 결과의 처리 9. 글리세롤 쿠션을 통해 샘플의 마지막 야간 고속 원심 분리는 ribosome 샘플에서 남은 무료 tRNAs을 제거하는 것이 중요합니다. 별도의 subunits가 필요한 경우, 그들은 높은 소금 자당 기울기 15 침강에 의해 얻을 수 있습니다

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> Sulfolink 커플링 수지 </td><td> 찌르다 </td><td> 20,402 </td></tr><tr><td> 미니 비드 - 때리는 16 </td><td> Biospec </td><td> 607 </td></tr><tr><td> Optima 최대 전자 초원 심 분리기 </td><td> 베크 만 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td><td></td></tr><tr><td> 전설 RT </td><td> Sorvall </td><td></td></tr><tr><td> 0.5 mm 유리 비즈 </td><td> Biospec </td><td> 11079105 </td></tr><tr><td> 트리스 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 252,859 </td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> E9884 </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 43,815 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 54,459 </td></tr><tr><td> NH 4 망할 CIA </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> A9434 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 60,128 </td></tr><tr><td> MG (OAc) 2 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> M5661 </td></tr><tr><td> 코이 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 221,473 </td></tr><tr><td> 글리세린 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> G5516 </td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P7255 </td></tr><tr><td> GTP </td><td> Fermentas </td><td> R0461 </td></tr></tbody></table>

chromatographic purification of highly active yeast ribosomes

진핵세포 리보솜 따라서 연구자에게 상당한 도전을 초래할 훨씬 더 불안 정한 자신의 eubacterial 및 archael 대응에 비해 같습니다. 특히 성가신 세포의 용해는 프로 테아제와 리보솜을 저하시킬 수 nucleases 다수 출시는 사실입니다. 따라서, 가능한 빨리 이러한 효소의 변이를 분리하는 것이 중요합니다. 불행하게도, 기존의 차동 ultracentrifugation 방법은 그들의 구조적 무결성과 기능에 영향을 미치는 시간의 unacceptably 오랜 기간 동안 이러한 효소에 노출 변이를 떠납니다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 Sulfolink 수지 부과 시스테인을 사용하여 색층 방법을 활용합니다. 이 간단하고 빠른 응용 프로그램이 크게 손상, 높은 화학적 활성 효모 변이의 높은 수율을 생산 공동 정화 proteolytic와 nucleolytic 활동을 줄여줍니다. 우리는이 방법은 또한 포유류의 변이에 적용되어야하는 것이 좋습니다. 의 단순화방법, 그리고 chromatographically 정화 ribosome의 향상된 순도와 활동은 진핵세포 리보솜의 연구를위한 중요한 기술적 진보를 나타냅니다.

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Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

공동 정화 nucleases와 프로 테아제에 의해 전통적인 방법으로 정화 진핵세포 리보솜의 준비 오염 부정 스트림 생화학 및 구조 분석에 영향을 미칩니다. 신속하고 간단한 색층 정화 방법은 모델 시스템으로 효모 변이를 사용하여이 문제를 해결하는 데 사용됩니다.

높은 활성 효모 변이의 색층 정화

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

chromatographic-purification-of-highly-active-yeast-ribosomes

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

16.8K 조회수.  University of Maryland. 공동 정화 nucleases와 프로 테아제에 의해 전통적인 방법으로 정화 진핵세포 리보솜의 준비 오염 부정 스트림 생화학 및 구조 분석에 영향을 미칩니다. 신속하고 간단한 색층 정화 방법은 모델 시스템으로 효모 변이를 사용하여이 문제를 해결하는 데 사용됩니다.

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

유기 용매 및 초산없이 쿠매시 G - 250로 젤의 단백질 염색법

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

연구

생물학

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

효모 세포 Mitochondria의 정화

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there have been significant advances in our understanding of the functions of mitochondria other than the generation of energy. These include their role in apoptosis, acting as signalling organelles, mammalian development and ageing as well as their contribution to the coordination between cell metabolism and cell proliferation. Our understanding of biological processes modulated by mitochondria is based on robust methods for isolation and handling of intact mitochondria from tissues of the laboratory animals. Mitochondria from rat heart is one of the most common preparations for past and current studies of cellular metabolism including studies on knock-out animals.
Here we describe a detailed rapid method for isolation of intact mitochondria with a high degree of coupling. Such preparation of rat heart mitochondria is an excellent object for functional and structural research on cellular bioenergetics, transport of biomolecules, proteomic studies and analysis of mitochondrial DNA, proteins and lipids.

We describe &#1072; protocol for isolation of pure, highly coupled rat heart mitochondria for functional or structural studies of cellular bioenergetics, biophysical measurements, proteomics or mitochondrial DNA and lipids analysis.

Mitochondria 높은 결합 랫 마음의 준비

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

Recently, structural and biochemical studies have detailed many of the molecular events that occur in the ribosome during inhibition of protein synthesis by antibiotics and during nascent polypeptide synthesis. Some of these antibiotics, and regulatory nascent polypeptides mostly in the form of peptidyl-tRNAs, inhibit either peptide bond formation or translation termination1-7. These inhibitory events can stop the movement of the ribosome, a phenomenon termed "translational arrest". Translation arrest induced by either an antibiotic or a nascent polypeptide has been shown to regulate the expression of genes involved in diverse cellular functions such as cell growth, antibiotic resistance, protein translocation and cell metabolism8-13. Knowledge of how antibiotics and regulatory nascent polypeptides alter ribosome function is essential if we are to understand the complete role of the ribosome in translation, in every organism.
Here, we describe a simple methodology that can be used to purify, exclusively, for analysis, those ribosomes translating a specific mRNA and containing a specific peptidyl-tRNA14. This procedure is based on selective isolation of translating ribosomes bound to a biotin-labeled mRNA. These translational complexes are separated from other ribosomes in the same mixture, using streptavidin paramagnetic beads (SMB) and a magnetic field (MF). Biotin-labeled mRNAs are synthesized by run-off transcription assays using as templates PCR-generated DNA fragments that contain T7 transcriptional promoters. T7 RNA polymerase incorporates biotin-16-UMP from biotin-UTP; under our conditions approximately ten biotin-16-UMP molecules are incorporated in a 600 nt mRNA with a 25% UMP content. These biotin-labeled mRNAs are then isolated, and used in in vitro translation assays performed with release factor 2 (RF2)-depleted cell-free extracts obtained from Escherichia coli strains containing wild type or mutant ribosomes. Ribosomes translating the biotin-labeled mRNA sequences are stalled at the stop codon region, due to the absence of the RF2 protein, which normally accomplishes translation termination. Stalled ribosomes containing the newly synthesized peptidyl-tRNA are isolated and removed from the translation reactions using SMB and an MF. These beads only bind biotin-containing messages.
The isolated, translational complexes, can be used to analyze the structural and functional features of wild type or mutant ribosomal components, or peptidyl-tRNA sequences, as well as determining ribosome interaction with antibiotics or other molecular factors 1,14-16. To examine the function of these isolated ribosome complexes, peptidyl-transferase assays can be performed in the presence of the antibiotic puromycin1. To study structural changes in translational complexes, well established procedures can be used, such as i) crosslinking to specific amino acids14 and/or ii) alkylation protection assays1,14,17.

A major impediment to biochemical analyses of ribosomes containing nascent peptidyl-tRNAs has been the presence of other ribosomes in the same samples, ribosomes not involved in the translation of the specific mRNA sequence being analyzed. We developed a simple methodology to purify, exclusively, the ribosomes containing the nascent peptidyl-tRNA of interest.

기능 및 구조 분석을위한 Peptidyl - tRNAs를 포함 번역 리보솜의 분리

Recently, structural and biochemical studies have detailed many of the molecular events that occur in the ribosome during inhibition of protein synthesis ...

Yeast Colony Embedding Method

Patterning of different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms also display patterns of cell types. For example, in the yeast S. cerevisiae, sporulated cells and pseudohyphal cells are not uniformly distributed in colonies. The functional importance of patterning and the molecular mechanisms that underlie these patterns are still poorly understood.
One challenge with respect to investigating patterns of cell types in fungal colonies is that unlike metazoan tissue, cells in colonies are relatively weakly attached to one another. In particular, fungal colonies do not contain the same extensive level of extracellular matrix found in most tissues . Here we report on a method for embedding and sectioning yeast colonies that reveals the interior patterns of cell types in these colonies. The method can be used to prepare thick sections (0.5 &mu;) useful for light microscopy and thin sections (0.1 &mu;) suitable for transmission electron microscopy. Asci and pseudohyphal cells can easily be distinguished from ovoid yeast cells by light microscopy , while the interior structure of these cells can be visualized by EM.
The method is based on surrounding colonies with agar, infiltrating them with Spurr's medium, and then sectioning. Colonies with a diameter in the range of 1-2 mm are suitable for this protocol. In addition to visualizing the interior of colonies, the method allows visualization of the region of the colony that invades the underlying agar.

A method for embedding yeast colonies allowing sectioning for light and electron microscopy. This protocol allows determination of the distribution of sporulated cells and pseudohyphal cells within colonies providing a new tool toward understanding the organization of cell types within a fungal community.

효모 콜로니 임베딩 방법

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

활성 T.의 체외의 Reconstitution에서 castaneum의 Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

높은 처리량 효모 플라스미드 Overexpression 화면

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Barcoded 효모 게놈 라이브러리의 경쟁력 화면

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

함수의 연구, 상호 작용, 그리고 번역 후 수정을위한 신진 효모 단백질 추출 및 정제

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

에서 펩타이드 및 단백질과 재조합 엘라스틴 같은 폴리 펩타이드 및 그 융해의 비 크로마토 그래피 정제<em&gt; 대장균</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...