입양 세포 전송: 기증자 쥐 비장 세포를 숙주 쥐에 도입 후 FACS를 통한 성공 평가

Overview

출처: 뮤니에 실베인^1,2,3,퍼셰 티보^1,2,3,소피 노볼트^4,레이첼 골럽^1,2,3
1 림프포포에이시스, 면역학학과, 파스퇴르 연구소, 파리, 프랑스
² INSERM U1223, 파리, 프랑스
³ 유니버시테 파리 디드로, 소르본 파리 시테, 셀룰레 파스퇴르, 파리, 프랑스
⁴ 흐름 세포측정플리트에서, 세포측정및 바이오마커 UtechS, 번역 과학 센터, 파스퇴르 연구소, 파리, 프랑스

입양 세포 전달은 질병을 치료하거나 혈액 마비증과 같은 생물학적 과정을 연구하기 위해 환자 또는 연구 유기체로 세포를 도입하는 방법입니다. 입양 전송의 목적은 다양합니다. 그것은 기본 생물학뿐만 아니라 의학에서 사용할 수 있습니다 (1, 2). 마우스 모델에서, 전송된 세포의 이동 및 분포는 추적 시스템(세포 표면 마커, CFSE에 의한 염색 등)에 의해 연구되고 그 다음에 선행될 수 있다. 마우스 모형에 암 연구 결과에서는, 특정 세포 인구의 전송은 종양에 대하여 실험적인 처리로 이용될 수 있습니다. 이 기술에 대한 또 다른 예는 심한 면역 결핍 표현형을 가진 조사 마우스 또는 마우스에 골수 세포의 전송에 의해 키메라 마우스의 생성이다. 이 마우스 모형은 예를 들면 특정 세포 인구에 유전자 삭제의 충격을 평가하기 위하여 이용될 수 있습니다. 뼈 차용 세포의 전송은 또한 인간의 치료에 사용됩니다. 환자가 암 치료의 경우에 조사될 때, 골수의 입양 전송은 면역 계통 재구성을 허용합니다.

이 기술의 첫 번째 단계는 관심의 세포 인구를 얻는 것입니다. 이 인구를 격리하기 위해 선택한 기술은 대상 인구의 특이성 수준에 따라 달라집니다. 선택의 가장 큰 수준은 장기에 존재하는 모든 세포 집단이 취해지는 전체 기관입니다. 보다 정밀한 방법은 표적 세포 집단의 선택이며, 종종 하나의 세포 표면 마커에 의해 선택된다. 이 경우 셀을 정렬하는 이상적인 방법은 자기 정렬입니다. 마지막으로, 가장 엄격한 수준은 매우 특정 세포 집단을 정렬하는 여러 세포 표면 마커에 의해 세포의 선택입니다. 흐름 세포 분석 정렬은 이 선택 수준에 가장 인기 있는 방법입니다. 관심 의 인구가 얻어지면 호스트로 전송 할 수 있습니다. 입양 전송 전에 호스트와 기증자 사이의 호환성을 보장하는 것이 필수적입니다. 실제로, 전송 목표에 관계없이 호환성은 세포 거부없이 호스트에 의해 세포 채택을 보장하기 위해 중요합니다.

본 실습에서, CD45.2 마우스에서 비장세포를 CD45.1 Ragγc 마우스(림프구 부족)로 이송하여 채택세포 전달 기술을 입증하고 4일 후 유동 세포측정법을 사용하여 비장세포 전달을 확인한다(그림 1참조).

그림 1: 입양 전송의 회로도 표현. (1) 비장세포는 CD45.2 마우스로부터 분리되고 (2) CD45.1 Ragγc 마우스로 전송되며, 제어 마우스는 PBS만으로 주입된다. (3) 입양 전달 후 4일, 비장세포는 마우스로부터 회수되고 (4) 혈류 세포측정에 의해 분석된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Procedure

1. 준비

시작하기 전에 실험실 장갑과 적절한 보호 복을 착용하십시오.
먼저 세제로 모든 해부 도구를 살균한 다음 70%의 에탄올로 완전히 건조시하십시오.
2% 태아 종아리 혈청(FCS)을 함유한 행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)을 50mL준비한다.

2. 해부

이산화탄소 전달 시스템을 사용하여 저산소증으로 마우스를 안락사시합니다. supine 위치에 있는 해부 판에 안락사 마우스를 고정하고 가위와 집게를 사용하여 세로 복강경을 수행합니다.
집게를 사용하여 복부의 오른쪽에 있는 창자와 위를 이동하여 위장과 비장을 노출시합니다. 비장은 위장에 부착됩니다.
집게를 사용하여 조심스럽게 위에서 비장을 분리하고 HBSS 2 % FCS의 5 mL가 들어있는 페트리 접시에 놓습니다.

3. 면역 세포 격리

페트리 접시 위에 40 μm 세포 여과기에 비장을 놓습니다. 비장을 플런저로 분쇄하여 해리합니다.
HBSS 2% FCS의 1mL로 플런서와 스트레이너를 헹구어 부착된 세포를 복구합니다.
해리된 비장과 유체를 15mL 원심분리기 튜브로 옮기.
페트리 접시를 HBSS 2% FCS 5밀리리터로 세척하고 액체를 15mL 튜브로 옮겨냅니다.
10°C에서 7분 동안 370 x g의 튜브를 원심 분리하고 펠릿을 피하는 상퍼를 폐기하십시오.
펠릿을 다시 중단하고 적혈구를 분해하기 위해 2mL의 칼륨 암모늄 염화물 파이펫을 위아래로 재놓습니다.
2 분 동안 기다렸다가 HBSS 2 % FCS를 재부유 된 펠릿에 추가하여 최대 14 mL의 부피를 얻습니다.
10°C에서 7분 동안 370 x g로 튜브를 다시 원심 분리합니다. 상체를 버리고 위아래로 파이펫을 하여 HBSS 2 % FCS의 5 mL에서 펠릿을 다시 놓습니다.
트라이판 블루 염색 분석기를 사용하여 세포를 계산하고 HBSS 2 % FCS의 적절한 부피를 사용하여 최종 세포 농도를 10⁷ 세포 / mL로 조정합니다.

4. 입양 이전

5mL 수집 튜브에서 얻어진 세포 현탁액 2mL를 전송합니다.
10°C에서 7분 동안 370 x g의 튜브를 원심 분리한 다음 상체를 폐기합니다.
PBS의 2mL에서 펠릿을 다시 중단하고 10°C에서 7분 동안 370 x g의 튜브원심분리기.
PBS의 200 μL에서 상수 및 재중단 펠릿을 폐기하십시오.
29G 바늘로 0.5 mL 주사기를 사용하여 200 μL의 세포 현탁액을 실험 마우스에 정맥내로 주입하여 레트로 궤도 혈액 부비동에 주입한다.
대조군으로서, 인산염 완충식염의 200 μL와 같은 혈액 부비동에 두 번째 마우스를 주입한다.

5. 세포 수확 및 염색

입양 전세 후 4일 후, 마우스를 안락사시키고 비장을 제거한다.
섹션 3에 설명된 대로 비장구를 수확하십시오.
각 마우스에서 세포 현탁액 100μL을 "제어"와 "전송"이라고 표시된 두 개의 FACS 튜브로 옮기습니다.
10°C에서 7분 동안 370 x g의 튜브를 원심 분리한 다음 초월제를 폐기합니다.
표 1에나열된 희석제에서 4개의 항체를 포함하는 혼합물을 준비한다.

항 체	플루오로크롬	희석
CD45.1	BV711	1/200
CD45.2	APCCy7	1/400
CD4	BV786	1/1600
CD3	BV421	1/200

표 1: 항체 혼합 조성. 농축 항체 형광 접합체 및 HBSS를 사용하여 4개의 항체 칵테일 준비.

각 튜브에 믹스 의 100 μL을 추가 한 다음 어둠 속에서 얼음에 20 분 동안 배양합니다.
HBSS 2% FCS의 1mL을 추가한 다음 10°C에서 3분 동안 370 x g의 튜브를 원심 분리합니다.
슈퍼네티츠를 버리고 200μL의 HBSS 2% FCS에서 펠릿을 다시 중단한다.
다시 중단된 셀을 새 레이블이 지정된 FACS 튜브로 전송합니다.
FACS 프로토콜에 도시된 바와 같이 유동 세포측정을 사용하여 CD45.2 양성 림프구의 존재를 평가합니다.

6. 데이터 분석

"FlowJo"소프트웨어를 열고 각 튜브의 파일을"모든 샘플"창에서 드래그합니다.
"전송된"파일을 두 번 클릭하여 Y 축및 측면 분산"FSC-A"를X 축에 미리 분산시키는 점 플롯에 해당 샘플에서 기록된 셀을 표시합니다.
"다각형"을클릭하고 림프구를 선택하는 게이팅 전략을 만든 다음 세포 표면 마커 (CD45.1, CD45.2)를 사용하여 기증자 및 호스트 세포를 구별한 다음 CD45.2⁺ 셀 모집단 (CD3, CD4)을 특성화합니다.
"컨트롤마우스"파일로 분석 단계를 반복합니다.
셀 채우기를 시각화하려면"레이아웃 편집기"를 클릭합니다.
"전송된 셀"과"전송된 CD4 셀""전송된 "채우기"에서"전송"및"컨트롤"파일을"레이아웃 편집기 탭"으로드래그합니다.
CD45.2⁺ 셀 및 CD4 림프구를 나타내는 도트 플롯이 나타납니다.
CD45.2 전송된 셀은"전송된 마우스"도트 플롯에만 나타납니다.

Results

Ragγc 마우스는 주로 림프구가 부족한 변경된 면역 계통 조성물을 가지고 있습니다. 비장 세포의 입양 전달은 T 및 B 세포와 같은 부족한 인구의 도입을 허용합니다. 우리의 염색에는 숙주 및 기증자 세포를 각각 구별하기 위해 CD45.1 및 CD45.2세포 표면 마커를 포함하였다(그림2A). 또한 CD4 T세포(도 2B)와같은 Ragγc 마우스에 결석한 세포 집단을 강조하기 위한 다른 세포 표면 마커도 포함되었다. 예상대로, 제어 마우스는 CD45.2 양성셀(도2B,상단 패널)을 갖지 않았고 마우스를 이송하였다(그림2B,하단 패널, 전체 세포의 71.2%). 우리는 또한 전송된 세포 내의 CD4 T 세포를 구체적으로 검출할 수 있었습니다 (CD45.2 세포의 22.1%).

그림 2: 입양 이전의 대표적인 결과. (A) PBS(대조군)를 주입한 마우스로부터 CD45.2 세포의 히스토그램(dashed) 및 CD45.2 비장세포(test group)를 주입한 마우스(solid line). (b) PBS(상단 패널)로 주입된 대조군 마우스에서 CD45.2 양성 세포의 게이팅 전략 및 CD45.2 비장세포(하단 패널)로 주입된 마우스. 기증자 및 숙주 세포는 세포 표면 마커(CD45.1, CD45.2)를 사용하여 구별되며, CD45.2 양성 세포 집단이 특징입니다(CD3, CD4). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Application and Summary

입양 전이는 의학 분야에서 응용 프로그램과 함께 과학의 다른 분야에서 번역 기술입니다. 이 기술은 특정 세포 인구에 있는 단백질 결핍의 세포 이동 그리고 tropism 또는 부각을 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다. 마지막 경우에, 특정 세포 집단이 본질적으로 결핍되는 특히 GMO 마우스를 다른 기술을 사용할 수 있습니다. 그러나, GMO 마우스를 얻기 위한 유전적 구조는 매우 복잡하고 긴 과정이 될 수 있다. 이 경우, 결핍 세포 집단의 입양 전달은 쉽고 빠릅니다.

입양 전송은 의학에서 직접 응용 프로그램이 있습니다. 예를 들면, 암 치료 도중 조사된 환자에 있는 골수 이식은 면역 계통을 재구성하기 위하여 이용됩니다. 최근에는 의료 분야에서 입양 전이의 다른 응용 프로그램이 사용되고 있습니다. 인공 T 세포 (CAR T 세포라고 함)는 일부 암을 인식하고 제거하도록 설계되었습니다. 또한 이러한 엔지니어링 된 세포는 호스트에 의한 거부 위험을 완화하기 위해 제작되었습니다. CAR T 세포의 전송은 현재 임상 시험에서 시험됩니다.

References

Restifo, N. P., Dudley, M. E. and Rosenberg., S. A. Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response. Nature reviews. Immunology, 12 (4): 269-281, (2012).
Bonini, C., and Mondino, A. Adoptive T-cell therapy for cancer: The era of engineered T cells. European journal of immunology, 45 (9): 2457-69, (2015).

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1. 준비

시작하기 전에 실험실 장갑과 적절한 보호 복을 착용하십시오.
먼저 세제로 모든 해부 도구를 살균한 다음 70%의 에탄올로 완전히 건조시하십시오.
2% 태아 종아리 혈청(FCS)을 함유한 행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)을 50mL준비한다.

2. 해부

이산화탄소 전달 시스템을 사용하여 저산소증으로 마우스를 안락사시합니다. supine 위치에 있는 해부 판에 안락사 마우스를 고정하고 가위와 집게를 사용하여 세로 복강경을 수행합니다.
집게를 사용하여 복부의 오른쪽에 있는 창자와 위를 이동하여 위장과 비장을 노출시합니다. 비장은 위장에 부착됩니다.
집게를 사용하여 조심스럽게 위에서 비장을 분리하고 HBSS 2 % FCS의 5 mL가 들어있는 페트리 접시에 놓습니다.

3. 면역 세포 격리

페트리 접시 위에 40 μm 세포 여과기에 비장을 놓습니다. 비장을 플런저로 분쇄하여 해리합니다.
HBSS 2% FCS의 1mL로 플런서와 스트레이너를 헹구어 부착된 세포를 복구합니다.
해리된 비장과 유체를 15mL 원심분리기 튜브로 옮기.
페트리 접시를 HBSS 2% FCS 5밀리리터로 세척하고 액체를 15mL 튜브로 옮겨냅니다.
10°C에서 7분 동안 370 x g의 튜브를 원심 분리하고 펠릿을 피하는 상퍼를 폐기하십시오.
펠릿을 다시 중단하고 적혈구를 분해하기 위해 2mL의 칼륨 암모늄 염화물 파이펫을 위아래로 재놓습니다.
2 분 동안 기다렸다가 HBSS 2 % FCS를 재부유 된 펠릿에 추가하여 최대 14 mL의 부피를 얻습니다.
10°C에서 7분 동안 370 x g로 튜브를 다시 원심 분리합니다. 상체를 버리고 위아래로 파이펫을 하여 HBSS 2 % FCS의 5 mL에서 펠릿을 다시 놓습니다.
트라이판 블루 염색 분석기를 사용하여 세포를 계산하고 HBSS 2 % FCS의 적절한 부피를 사용하여 최종 세포 농도를 10⁷ 세포 / mL로 조정합니다.

4. 입양 이전

5mL 수집 튜브에서 얻어진 세포 현탁액 2mL를 전송합니다.
10°C에서 7분 동안 370 x g의 튜브를 원심 분리한 다음 상체를 폐기합니다.
PBS의 2mL에서 펠릿을 다시 중단하고 10°C에서 7분 동안 370 x g의 튜브원심분리기.
PBS의 200 μL에서 상수 및 재중단 펠릿을 폐기하십시오.
29G 바늘로 0.5 mL 주사기를 사용하여 200 μL의 세포 현탁액을 실험 마우스에 정맥내로 주입하여 레트로 궤도 혈액 부비동에 주입한다.
대조군으로서, 인산염 완충식염의 200 μL와 같은 혈액 부비동에 두 번째 마우스를 주입한다.

5. 세포 수확 및 염색

입양 전세 후 4일 후, 마우스를 안락사시키고 비장을 제거한다.
섹션 3에 설명된 대로 비장구를 수확하십시오.
각 마우스에서 세포 현탁액 100μL을 "제어"와 "전송"이라고 표시된 두 개의 FACS 튜브로 옮기습니다.
10°C에서 7분 동안 370 x g의 튜브를 원심 분리한 다음 초월제를 폐기합니다.
표 1에나열된 희석제에서 4개의 항체를 포함하는 혼합물을 준비한다.

항 체	플루오로크롬	희석
CD45.1	BV711	1/200
CD45.2	APCCy7	1/400
CD4	BV786	1/1600
CD3	BV421	1/200

표 1: 항체 혼합 조성. 농축 항체 형광 접합체 및 HBSS를 사용하여 4개의 항체 칵테일 준비.

각 튜브에 믹스 의 100 μL을 추가 한 다음 어둠 속에서 얼음에 20 분 동안 배양합니다.
HBSS 2% FCS의 1mL을 추가한 다음 10°C에서 3분 동안 370 x g의 튜브를 원심 분리합니다.
슈퍼네티츠를 버리고 200μL의 HBSS 2% FCS에서 펠릿을 다시 중단한다.
다시 중단된 셀을 새 레이블이 지정된 FACS 튜브로 전송합니다.
FACS 프로토콜에 도시된 바와 같이 유동 세포측정을 사용하여 CD45.2 양성 림프구의 존재를 평가합니다.

6. 데이터 분석

"FlowJo"소프트웨어를 열고 각 튜브의 파일을"모든 샘플"창에서 드래그합니다.
"전송된"파일을 두 번 클릭하여 Y 축및 측면 분산"FSC-A"를X 축에 미리 분산시키는 점 플롯에 해당 샘플에서 기록된 셀을 표시합니다.
"다각형"을클릭하고 림프구를 선택하는 게이팅 전략을 만든 다음 세포 표면 마커 (CD45.1, CD45.2)를 사용하여 기증자 및 호스트 세포를 구별한 다음 CD45.2⁺ 셀 모집단 (CD3, CD4)을 특성화합니다.
"컨트롤마우스"파일로 분석 단계를 반복합니다.
셀 채우기를 시각화하려면"레이아웃 편집기"를 클릭합니다.
"전송된 셀"과"전송된 CD4 셀""전송된 "채우기"에서"전송"및"컨트롤"파일을"레이아웃 편집기 탭"으로드래그합니다.
CD45.2⁺ 셀 및 CD4 림프구를 나타내는 도트 플롯이 나타납니다.
CD45.2 전송된 셀은"전송된 마우스"도트 플롯에만 나타납니다.

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