질량 분석법 없이 EUCAST RAST 방법을 용이하게 하기 위해 자동 미생물 식별 시스템을 사용한 직접 미생물 식별

EUCAST는 자동 혈액 배양을 위한 직접 항균제 감수성 검사(AST) 프로토콜을 개발했습니다. 그러나 질량 분석 기반 미생물 식별에 대한 의존성은 자동화된 미생물 식별 시스템에서 직접 접종 준비 프로토콜을 사용하여 제거할 수 있습니다. 이 접근 방식은 검체 채취 후 24시간 이내에 AST 보고서를 제공할 수 있습니다.

그람 음성(GN) 패혈증은 자원이 제한된 환경에서 3-4일 내에 결과를 제공하는 기존의 미생물 배양 기술에 의존하는 의료 응급 상황입니다. 이러한 처리 시간(TAT)의 지연을 인식하여 EUCAST와 CLSI는 양성 플래그가 지정된 자동 혈액 배양 병(+aBC)에서 직접 AST 결과를 결정하기 위한 프로토콜을 개발했습니다. EUCAST rapid AST(RAST) 프로토콜은 2018년에 처음 도입되었으며, GN 패혈증의 4가지 일반적인 원인 병원체, 즉 대장균, 폐렴균, 녹농균, 아시네토박터 바우마니 복합체에 대한 구역 지름 중단점을 보고할 수 있습니다. 그러나 일상적인 워크플로우에서 이 방법을 구현한 임상 실험실은 쉽게 사용할 수 없는 질량 분석 기반 미생물 식별에 의존하므로 자원이 제한된 환경에서 구현할 수 없습니다. 이를 피하기 위해 상용 자동 미생물 식별 및 항균제 감수성 검사 시스템(aMIAST)을 사용하여 직접 접종 프로토콜(DIP)을 평가하여 aBC 양성 플래그 후 8시간 이내에 미생물을 조기에 식별할 수 있도록 했습니다. 2023년 1월부터 10월까지 이 프로토콜을 평가하여 긍정적으로 플래그가 지정된 aBC에서 4개의 RAST 보고 가능 GN(RR-GN)을 식별했습니다. DIP의 미생물 식별 결과를 aMIAST의 표준 접종 준비 프로토콜(SIP)과 비교했습니다. 단형성 GN(+naBC)을 가진 204개의 +aBC 중에서, 4개의 RR-GN 중 하나가 SIP에 의해 105개의 +naBCs에서 확인되었다(E. coli: 50, K. pneumoniae: 20, P. aeruginosa: 9 및 A. baumannii complex: 26). 이 중 94%(98/105)는 DIP에 의해 정확하게 식별된 반면 주요 오류율과 매우 중요한 오류율은 각각 6%(7/105) 및 1.7%(4/240)였습니다. EUCAST RAST 방법을 사용하여 미생물 식별을 위한 DIP를 수행하는 경우 검체 수령 후 24시간 이내에 임시 임상 보고서를 제공할 수 있습니다. 이 접근법은 TAT를 크게 줄여 적절한 항균 요법을 조기에 시행할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

전 세계적으로 중요한 건강 문제인 패혈증은 감염에 대한 숙주 반응 조절 장애로 인해 생명을 위협하는 장기 기능 장애로 정의됩니다. 글로벌 질병 부담 연구(Global Burden of Diseases Study)에 따르면 2017년 전 세계적으로 4,890만 건의 패혈증 사례와 1,100만 명의 패혈증 관련 사망자가 발생한 것으로 추정되었으며, 이는 전^{세계 사망자의} 거의 20%를 차지합니다1. 사망을 유발하는 혈류 감염(BSI^{)의 약} 2/3는 그람 음성 세균 병원체에 의한 것이다². 그람음성병원체(GN)의 주요 사망 원인은 대장균(Escherichia coli), 폐렴균( Klebsiella pneumoniae), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii)이며, 이들은 33종의 세균성 병원체 중 발병 사례의 약 40%를 차지한다².

혈액 배양은 BSI 진단을 위한 황금 표준으로 남아 있으며, 항균제 감수성 검사(AST) 결과와 함께 신속한 미생물 식별이 관리의 핵심입니다. 패혈증에서 적절한 항균제를 투여하는 데 시간이 걸릴 때마다 사망 확률이 9% 증가하는 것으로 추정된다³. AST 결과와 함께 미생물학적으로 양성 혈액 배양 보고서의 처리 시간(TAT)은 자동화된 시스템에서도 리소스가 제한된 환경에서 사용 가능한 미생물 도구를 사용할 경우 약 48-72시간입니다. 이러한 수준 이하의 TAT로 인해 광범위한 항생제가 경험적으로 사용되어 항생제 내성(AMR) 문제가 급증하고 있습니다. 패혈증에 대한 미생물 배양 기법에 대한 TAT를 줄여야 할 필요성을 인식한 EUCAST와 CLSI는 양성 플래그가 있는 혈액 배양 병(+aBC)에서 직접 AST를 수행하는 방향으로 나아가고 있습니다(+aBC)^4,5.

2018년 EUCAST는 +aBC ^6,7에서 직접 짧은 배양 시간, 즉 4시간, 6시간 및 8시간에서 Kirby-Bauer 디스크 확산 방법으로 AST를 측정하기 위한 RAST(Rapid Ast) 방법을 처음 도입했습니다. 이 방법은 BSI의 가장 흔한 8가지 원인 중 하나, 즉 그람 음성 및 황색포도상구균, 장내구균 패칼리스, E. 패시움 및 폐렴구균 중 가장 흔한 8가지 원인 중 하나를 포함하는 +aBC에 대한 AST를 측정하기 위해 검증되었습니다⁸ . 다양한 시간 간격에서 AST 결정을 위한 중단점은 위에 나열된 미생물 종에 따라 제공됩니다. 따라서 AST 결과를 범주형으로 해석하기 전에 미생물 식별이 필요합니다. 그러나 RAST 표준은 이 시간 프레임 내에 미생물 식별을 가능하게 하는 방법을 지정하지 않습니다.

그들의 환경에서 EUCAST RAST 방법을 평가하는 대부분의 연구는 미생물 9,10,11,12,13,14,16,17을 식별하기 위해 도금된 매체에서 짧은 배양 후 질량 분석 기반 미생물 식별을 사용했습니다 . 그러나 질량 분석 기기는 특히 저소득 및 중간 소득 국가(LMIC)에서 널리 사용할 수 없기 때문에 이 방법의 잠재적 유용성이 크게 제한됩니다. 질량 분석법 18,19,20을 사용하지 않고 센터에서 이 방법을 구현했다고 보고한 연구는 거의 없습니다. Tayşi et ^al.18은 AST 결과를 해석하기 전에 그람 염색 형태 및 산화효소 테스트를 기반으로 Enterobacterales, Pseudomonas 및 Acinetobacter spp.로 GN을 광범위하게 분류했다고 보고했습니다. Gupta et ^al.19 및 Siddiqui et ^al.20에 의한 이 센터의 다른 연구에서는 양성 플래그가 표시된 혈액-국물 혼합물에서 박테리아 펠릿을 준비하고 기존 생화학 검사에 접종하여 종 수준의 미생물 식별을 수행했습니다. Tayşi et ^al.18은 그들의 접근법에 대한 미생물 식별의 정확성에 대해 언급하지 않았지만, Gupta et ^al.19는 165/176(94%)의 사례에서 E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa, A. baumannii 중 하나의 RAST 보고 가능한 그람 음성(RR-GN)이 나타났다고 보고했습니다콤플렉스. 그러나 후자의 접근 방식에서는 기존 생화학적 결과의 전체 배양 후, 즉 접종 후 18-24시간 후에만 8시간 영역 직경 중단점을 사용하여 RAST 결과를 소급하여 판독했으며 평균 보고 시간은 약 2일이었습니다.

임상 보고서의 TAT를 더욱 줄이기 위해 aMIAST를 사용하여 +aBC에 존재하는 GN을 조기에 식별할 수 있는 대안 방법론을 제안합니다. 질량 분석 기반 미생물 식별 시스템이 도입되기 전에는 이러한 자동 식별 시스템이 미생물 식별을 위한 표준 관리로 간주되었으며, 카세트에 들어 있는 소형 생화학 테스트에서 접종할 때 테스트 박테리아에 의해 유도된 비색 및/또는 형광 측정법 변화에 의해 식별이 가능했으며 결과를 분리 데이터베이스와 일치시켰습니다. 이러한 시스템에서 식별까지의 평균 시간은 약 4시간에서 8시간이지만, 제조업체가 각각의 식별 카드를 접종하기 전에 밤새 미생물의 성장을 권장한다는 사실에 의해 제한됩니다. 이 요구 사항은 보고 시간을 줄이는 데 유용성을 크게 제한합니다.

이러한 자동화 시스템 21,22,23,24,25,26,27을 사용하여 +aBC에서 미생물을 직접 식별하는 방법을 평가한 연구는 거의 없습니다. 단형성 GN을 함유하는 +aBC의 경우, 대다수의 연구에서 양성 혈액-국물 혼합물로 만든 박테리아 펠릿의 직접 접종과 표준 콜로니 배양 간에 우수한 일치성을 보여주었습니다. 그러나 그람 양성의 경우 일치율이 최적이 아니었습니다. +aBCs의 양성까지의 평균 시간은 8시간에서 16시간 사이이고 자동화된 미생물 식별 시스템에서 GN의 식별은 ~4시간에서 8시간이 걸리기 때문에 자동화된 미생물 식별에 직접 접종 프로토콜을 사용함으로써 검체 수령 후 24시간 이내에 RR-GN을 가진 GN을 가진 +aBC의 임상 보고를 완료할 수 있다는 가설을 세웠습니다.

연구를 위한 환경
본 연구는 2023년 1월부터 10월까지 인도 중부에 있는 950개 병상 규모의 학술 국가 중요 3차 진료 기관(INI)의 임상 세균학 실험실에서 수행되었습니다. 실험실에는 연속 혈액 배양 모니터링 시스템(CBCMS)과 aMIAST가 장착되어 있습니다. 세균학 실험실은 양성으로 표시된 혈액 배양 병(+aBC)을 처리하고 보고하기 위해 기술자와 미생물학자를 연중무휴로 운영합니다.

여기에 사용된 미생물 방법
연구의 워크플로우는 그림 1에 나와 있습니다. 단형성 GN(+naBC)을 보여주는 +aBC는 EUCAST RAST 프로토콜을 사용하여 식별 및 AST를 가능하게 하기 위해 해당 ID 카드를 직접 접종하여 처리되었습니다. 이러한 결과는 +aBC에 대한 표준 관리(SoC) 방법, 즉 양혈 한천(SBA), 초콜릿 한천(CA) 및 MacConkey 한천(MA)을 통해 기존의 도금 배지에서 하위 배양하고 16시간에서 24시간 동안 호기성으로 배양한 후 고립된 콜로니가 나타날 때 aMIAST에서 제공하는 식별 및 AST 카드와 비교했습니다. 초기 그람 염색 또는 도금 배지에서 그람 양성 구균, 그람 양성 간균, 신진 효모 세포 및 ≥2 다른 미생물을 보여주는 혈액 배양은 연구에서 제외되었습니다.

AIIMS Bhopal이 Ayush Gupta 박사에게 제공한 교내 연구 보조금으로 자금을 지원받은 이 연구는 IHEC(Institutional Human Ethics Committee) 비디오 레터 번호: IHEC-LOP/2022/IL072의 승인을 받았습니다.

참고: 5ml의 샘플 부피는 Quesada et ^al.25 및 Munoz-Davila et ^al.27이 수행한 연구를 기반으로 사용되었습니다.

1. aMIAST를 사용한 세균 식별을 위한 표준 접종 프로토콜(SIP)

1. 깨끗한 장갑을 착용하고 Class-IIa 생물 안전 캐비닛(BSC) 내부에서 70% 이소프로필 알코올이 포함된 면봉으로 +naBC의 중격을 소독합니다.
2. 21G 바늘이 있는 멸균 주사기를 사용하여 약 1mL의 혈액-육수 혼합물을 그립니다.
3. 바늘에서 혈액 육수 혼합물 1 방울을 도금 매체, 즉 SBA, CA 및 MA의 표면에 분배합니다. 플레이트를 줄무늬로 만들고 배양 플레이트를 37°C ± 2°C의 호기성 조건에서 18-24시간 동안 배양합니다.
4. 배양 후 BSC에서 고립된 콜로니가 나타나는지 플레이트를 검사하고 aMIAST에 의한 식별 및 AST를 위해 추가로 진행합니다.
5. 각 분리물에 대해 aMIAST 폴리스티렌 튜브를 aMIAST 튜브 스탠드에 넣고 식염수 병에 부착된 디스펜서를 사용하여 3mL의 멸균 식염수를 추가합니다.
6. 멸균 직선 접종 와이어로 형태학적으로 유사한 3-5개의 콜로니를 접촉하고 박테리아 접종물을 첫 번째 튜브로 옮깁니다.
7. 농도계를 사용하여 0.47-0.63 McFarland 사이에서 접종된 튜브의 멸균 식염수를 사용하여 탁도를 조정합니다.
8. 그람 음성 aMIAST 식별 카드의 모세관 부착물을 첫 번째 튜브에 놓습니다.
9. 선택한 카드를 카세트의 적절한 위치에 놓습니다. 카세트의 접종물이 준비되고 충전 섹션의 aMIAST에 제공됩니다.
   주의: 카드를 접종하기 전 30분을 초과해서는 안 됩니다.
10. 샘플 바코드가 안쪽을 향하도록 하여 카세트를 필러 챔버의 해당 위치에 로드합니다.
11. 문을 닫고 사용자 인터페이스 화면에서 채우기를 누릅니다. 충전은 70초 주기입니다. 사이클이 완료되면 시스템의 파란색 표시등이 깜박입니다. 카드를 aMIAST 시스템에 넣으면 기계에 의해 카드의 작은 챔버 내에 접종물이 분배됩니다.
12. 충전 챔버에서 카세트를 제거하고 도어를 닫은 다음 로딩 챔버에 넣습니다. 바코드는 자동으로 스캔되어 유지 관리 가상 카세트 전자 작업 목록과 대조됩니다. 빨대는 자동으로 밀봉되고 카드는 자동으로 캐러셀에 로드됩니다. aMIAST에서 깜박이는 파란색 화살표는 로딩이 완료되었음을 나타냅니다.
13. 완료되면 카세트 폐기물을 제거하십시오. 제품 설명서에서 폐기물 처리 절차를 참조하거나 다른 표준 관행을 따르십시오. 분리물의 순도 검사를 위해 CLED 한천에서 하위 배양하기 위해 튜브의 나머지 현탁액을 사용하십시오.
14. 기기가 분석을 완료한 후 결과를 읽습니다.

2. aMIAST를 사용한 세균 식별을 위한 직접 접종 프로토콜(DIP)

1. 멸균 장갑을 착용하고 생물 안전 캐비닛 내부에서 70% 이소프로필 알코올이 포함된 면봉으로 +naBC의 중격을 청소합니다.
2. 21G 바늘이 있는 멸균 주사기를 사용하여 +naBC의 혈액-육수 혼합물에서 5mL의 부분 표본을 채취하고 고무 중격을 70% 이소프로필 알코올로 소독한 후 혈청 분리 튜브(SST)로 옮깁니다(그림 2A).
3. 이 부분 표본을 160 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 혈액-육수 혼합물에 혈액 세포를 가라앉힙니다. 첫 번째 원심분리 후 혈액 세포가 정착할 상층액을 관찰합니다.
4. 생물 안전 캐비닛 내부의 바이알 뚜껑을 열고 멸균 팁과 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거하고 상단을 제거하여 새로운 일반 혈액 수집 바이알(빨간색 상단)로 옮깁니다.
5. 바이알에 캡을 놓고 2000 x g에서 10분 동안 다시 원심분리합니다. 두 번째 원심분리 후 바닥에 박테리아 펠릿이 형성됩니다.
6. 상층액을 흡입하고 멸균 피펫과 팁을 사용하여 폐기합니다. 박테리아 펠릿은 튜브 바닥에 남아 있으며 aMIAST 식별 카드를 접종하는 데 사용됩니다.
   참고: 혈청 분리기 튜브는 160 x g에서 첫 번째 원심분리에 사용되었습니다. 이는 Quesada et ^al.25 및 Munoz-Davila et ^al.27이 수행한 연구를 기반으로 하며_, 여기서 첫 번째 원심분리 단계는 각각 대략 30 x g 및 60 x g에서 수행되었습니다. +aBC의 혈액-국물 혼합물을 먼저 SST에서 저속으로 원심분리하여 혈액 세포를 펠릿으로 배출했습니다.
7. aMIAST 폴리스티렌 튜브를 aMIAST 튜브 스탠드에 놓고 식염수 병에 부착된 디스펜서를 사용하여 3mL의 멸균 식염수를 추가합니다.
8. 멸균 접종 루프를 사용하여 바이알 바닥에서 박테리아 펠릿을 채취하여 aMIAST 튜브에 접종합니다.
9. 1.7-1.14단계를 반복합니다.

3. EUCAST RAST 프로토콜에 의한 AST⁴

1. 접종되지 않은 90mm 원형 Mueller-Hinton 한천(MHA) 플레이트를 생물안전 작업대에 준비하십시오.
2. 멸균 장갑을 착용하고 생물 안전 캐비닛 내부에서 70% 이소프로필 알코올이 포함된 면봉으로 +naBC의 중격을 청소합니다.
3. 멸균 주사기를 사용하여 +naBC에서 125 μL ± 25 μL의 희석되지 않은 혈액 육수 혼합물을 흡인하고 중앙의 각 MHA 플레이트에 추가합니다.
4. 멸균 면봉을 사용하여 육수를 접시 위에 세 방향으로 부드럽게 펴고 각 접시에 ≤ 6개의 항균 디스크를 바릅니다.
5. 35 °C± 1 °C에서 8 시간 동안 호기성 인큐베이터에서 플레이트를 배양합니다. 배양 완료 후 분리물의 순도를 관찰하십시오.
6. 8시간 ± 5분에서 금지 영역을 읽습니다. aMIAST에서 세균 식별 결과를 확인한 후 짧은 배양을 위해 RAST 중단점 테이블을 사용하여 결과를 해석합니다.
7. 분리물이 RR-GN 중 하나로 식별되고 MHA 및 CLED 플레이트가 단일 형태형을 성장시키는 경우에만 AST 결과를 보고합니다.

4. 품질 관리

1. 권장 기준 균주를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 aMIAST의 SIP 프로토콜에 대한 내부 품질 관리를 수행합니다.
2. 아래 설명된 대로 E. coli 의 권장 참조 균주를 사용하여 매주 RAST 분석법의 내부 품질 관리를 수행합니다.
   1. 튜브 스탠드에 4개의 멸균 유리관을 배치합니다. 첫 번째 튜브에 3mL의 멸균 식염수를 분주하고 두 번째, 세 번째 및 네 번째 튜브에 각각 990μL의 멸균 식염수를 분주합니다.
   2. 도금된 매체에서 하룻밤 배양의 고립된 식민지에서 QC 균주의 0.5 McFarland 현탁액을 만듭니다.
   3. 멸균 피펫과 팁을 사용하여 첫 번째 튜브에서 두 번째 튜브로 10μL의 현탁액을 이송합니다.
   4. 혼합 후 10μL의 현탁액을 두 번째 튜브에서 세 번째 튜브로 옮긴 다음 마지막 튜브로 옮깁니다.
   5. 마지막 튜브에서 바늘이 있는 멸균 주사기를 사용하여 접종물 1mL를 취하여 접종되지 않은 aBC에 추가합니다.
   6. 동시에 바늘이 있는 멸균 주사기를 사용하여 aBC에 멸균 양혈 5mL를 추가하고 aBC 기저부에 있는 액체 에멀젼 센서의 색상 변화로 인해 양성으로 표시될 때까지 CBCMS에서 배양합니다.
   7. SIP, DIP 및 RAST로 각각 식별하기 위해 1-3단계에서 설명한 대로 단계를 반복합니다. 예상되는 결과는 QC 변형률이 aMIAST의 식별 프로토콜 모두에 의해 올바르게 식별되어야 하고 RAST 플레이트의 영역 직경이 지정된 범위²⁸ 내에 있어야 한다는 것입니다.

5. 통계 분석

1. SIP를 황금 표준으로 사용하여 미생물 식별을 고려하고 DIP로 동일한 식별을 얻은 경우 일치하는 것으로 간주합니다.
2. SIP를 사용하여 식별된 RR-GN, 즉 E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa, A. baumannii 복합체 중 하나가 DIP에서 불일치하는 경우, 이를 주요 오류(ME)로 간주하는 반면, 그 반대의 경우는 잘못된 식별로 보고서를 발행할 가능성이 있으므로 매우 주요 오류(VME)로 간주합니다.
3. SIP로 식별된 총 RR-GN 수에 대한 총 일치 RR-GN 수의 비율에 100을 곱한 값으로 RR-GN에 대한 일치율을 계산합니다.
4. SIP로 식별된 RR-GN이 있는 총 +naBC 수에 대한 비 RR-GN이 있는 것으로 식별된 +naBC 수의 비율에 100을 곱하여 ME 속도를 계산합니다.
5. VME 비율을 DIP에서 RR-GN을 갖는 것으로 잘못 식별된 +naBC의 수의 비율로 계산합니다. DIP에 100을 곱하여 테스트한 +naBC의 수.
6. TTI(Time to Isolate Identification)를 CBCMS에 의한 혈액 배양 플래그 지정 시점부터 두 프로토콜에 의한 분리를 식별하는 데 걸린 시간으로 계산합니다.
7. DIP와 SIP의 차이를 TTI의 감소로 계산합니다. RR-GN을 갖는 일치 +naBC에 대해서만 이것을 계산하십시오. CBCMS 및 aMIAST의 클럭에서 해당 시점을 확인합니다.
8. 스프레드시트를 사용하여 데이터를 관리하고 분석합니다. 계량형 변수에 대해 Mann-Whitney U 검정을 사용하고 양측 p-값이 0.05≤ 통계적으로 유의하다고 가정합니다.

일반적인 결과
연구 기간 동안 240 +naBCs는 DIP와 SIP를 모두 사용하여 aMIAST에 의해 식별되었습니다. 이 중 15%(36/240)+naBCs는 도금된 배지에서 하룻밤 동안 배양한 후 다미생물인 것으로 밝혀졌습니다. 204개의 +naBC 중 SIP에 의해 식별된 RR-GN의 비율은 51.5%(105/204)였다. 그 중 47.6%(50/105)는 대장균, 19%(20/105)는 K. 폐렴균, 8.6%(9/105)는 P. 녹농 균, 24.8%(26/105)는 A. baumannii 복합체였습니다. SIP에 의한 모든 식별 결과에 대한 자세한 설명은 표 1에 나와 있습니다.

미생물 식별의 진단 정확도
105개의 RR-GN 중 98개(93.3%)와 99개(94.2%)가 각각 종 및 속 수준 식별까지 DIP와 일치했습니다. 표 1과 같이 유기체별 일치율은 E. coli의 경우 94%(47/50), K. pneumoniae의 경우 90%(18/20), P. aeruginosa의 경우 100%(9/9), A. baumannii 복합체의 경우 92.3%(24/26)였다. 7 +naBCs에서, 결과는 DIP를 사용한 종 수준 식별까지 불일치했으며, 그 중 aMIAST는 미확인(3)을 제공하거나 Non-RR-GN(4)을 식별했습니다(표 2와 같이). 이러한 결과는 임상 미생물학자가 보고하도록 강요하지 않기 때문에 주요 오류(ME)로 간주되었습니다. 우리 연구의 ME 비율은 종 수준 식별 전까지 6.7%(7/105)였습니다. SIP에 의한 aMIAST에서 non-RR-GN의 비율은 48.5%(99/204)였다. 이 중 60건(60.6%)은 종 수준 식별까지 DIP에 의해 일치했다. 99개의 non-RR-GNs 중에서, RR-GN은 표 2와 같이 4개의 +naBCs에서 DIP를 사용하여 확인되었다. 이러한 불일치는 보고 오류로 이어질 수 있으며 VME(Very Major Error)로 간주되었습니다. DIP를 사용한 전체 VME 비율은 1.7%(4/240)였습니다. 모든 그람 음성의 식별 결과 및 오류에 대한 전체 설명은 보충 표 1에 나와 있습니다.

격리 식별(TTI) 시간 단축
DIP에서 일치+naBC의 TTI는 SIP의 TTI보다 유의하게 낮았다(중앙값(IQR): 507.5분(685-404) 대 2171분(2532-1855), P2 대 P1, p<0.00001(Mann-Whitney 검정)). 두 프로토콜 간의 TTI 차이의 중앙값은 1635분이었다(IQR: 1964-1299).

그림 1: 연구의 워크플로우: 표준 및 직접 접종 프로토콜 모두에 의해 처리되는 단형성 그람 음성이 있는 긍정적으로 표시된 혈액 배양 병에 대한 연구의 워크플로우를 묘사합니다. 약어: +aBC = 긍정적으로 표시된 혈액 배양 병, +naBC = 단형성 그람 음성이 있는 긍정적으로 표시된 혈액 배양 병, DIP = 직접 접종 프로토콜, SIP = 표준 접종 프로토콜, SBA = 양 혈액 한천, CA = 초콜릿 한천, MA = MacConkey 한천, RR-GN = RAST 보고 가능한 그람 음성, TAT = 턴어라운드 시간 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 세균 식별을 위한 직접 접종 프로토콜: 직접 접종 프로토콜을 수행하는 동안 바이알의 이미지를 보여줍니다. 약어: +naBC = 그람 음성이 있는 긍정적으로 표시된 혈액 배양 병 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 직접 접종 프로토콜에서 세균 식별 결과. 결과는 RAST 보고 가능한 그람 음성에만 해당됩니다. 약어: n = 분자, % = 퍼센트.

표 2: 직접 접종 프로토콜에 의한 주요 및 매우 주요 오류에 대한 세부 정보. 약어: n = 분자, % = 퍼센트, ID = 식별, NA = 해당 없음, A = 아시네토박터, E = Escherichia, K = Klebsiella.

보충 표 1: 직접 접종 프로토콜의 오류 결과와 함께 두 프로토콜에서 유기체 식별의 자세한 결과. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

DIP를 사용하여 상당한 진단 정확도로 RR-GN을 성공적으로 식별했습니다. aBC의 양성 플래그 후 평균 TTI는 507분(~ 8.5시간)에 불과했습니다. 따라서 AST 측정을 위한 EUCAST RAST 방법과 함께 수행하면 8시간 AST 판독 시간에 격리 식별을 제공할 수 있습니다. 이 접근법은 질량 분석법 기반 식별의 필요성을 없애는 EUCAST RAST 방법을 구현할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 이는 임상 보고 시간을 줄이고 구현에 대한 주요 장애물을 피하기 위해 일상적인 워크플로우에서 EUCAST RAST 방법을 구현하고자 하는 리소스가 부족한 설정에게 유용합니다.

EUCAST RAST 방법이 도입되기 전에 여러 저자가 다양한 aMIAST 시스템 21,22,23,24,25,26,27,29,30,31에 대해 +aBC의 직접 테스트의 정확도를 평가했습니다. 이 연구에서 직접 테스트 프로토콜은 단일 원심분리기 단계 ^29,30,31,32 또는 이중 원심분리기 단계^{21,22,24,25,26,27}을 따르는 데 차이가 있었습니다 세균성 펠릿을 만들기 위해. 단일 단계 방법에서는 +aBC의 혈액-육수 혼합물을 혈청 분리 튜브(SST)에서 고속으로 원심분리하여 실리콘 겔 층 위의 박테리아를 펠렛화했습니다. 펠릿은 신분증 접종을 위한 접종물을 준비하는 데 사용되었습니다. 이중 원심분리 방법에서는 +aBC의 혈액-육수 혼합물을 먼저 SST에서 저속으로 원심분리하여 혈액 세포를 펠릿으로 배출했습니다. 이 튜브에서 박테리아를 포함하는 상층액을 제거하고 새로운 튜브로 옮겨 고속 원심분리를 실시했습니다. 이 튜브에서 상층액을 버리고 펠릿을 사용하여 적절한 신분증을 접종했습니다. 이 연구에서 일치율은 62%-100%로 다양했지만 일반적으로 이중 원심분리 방법에서 정확도가 더 높았습니다.

우리는 이 방법이 수행이 간단하며 >10명의 실험실 기술자가 교대로 근무하는 일상적인 진단 실험실에서 수행되어 방법의 견고성을 입증한다는 것을 발견했습니다. RR-GN 중 하나를 포함하는 ~94%(98/105) +naBCs에서 DIP는 미생물을 정확하게 식별했습니다. 다른 범주의 유기체에 대한 일치율도 E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa, A. baumannii 복합체에 대해 각각 94%, 90%, 100% 및 92.3%로 서로 비슷했습니다. 우리는 또한 모든 그람 음성에 대한 전체 일치율이 차선책으로 ~ 77 % (157/204)임을 발견했습니다. 그러나 이러한 오인의 대부분은 일반적으로 피부의 일반적인 오염 물질로 간주되는 Acinetobacter spp. 이외의 baumannii 복합체 이외의 Acinetobacter spp., 녹농균 이외의 Pseudomonas spp., Moraxella spp. 및 Sphingomonas paucimobilis와 같은 비발효성 그람 음성에서 발생했습니다. 비발효성 그람 음성에 대한 오인도 다른 저자들에 의해 지적^{되었는데, 이는} aMIAST 식별 카드에서 이러한 박테리아의 반응성이 낮기 때문일 수 있습니다.

DIP를 사용하여 +naBC 내에서 박테리아의 TTI가 크게 감소한 것을 발견했습니다. DIP의 TTI 중앙값은 일상적인 임상 진단 실험실에서 수행했을 때 SIP의 TTI 중앙값(507분 대 2171분)보다 약 4배 낮았습니다. 이 ~8.5시간의 TTI는 또한 aMIAST에 의한 분석을 분리하는 평균 시간이 5.45시간 ± 1.6시간에 불과했기 때문에 aBC의 양성 플래그와 aMIAST 카드 접종 성능 사이의 간격도 포함되었습니다. 본 연구에서 일치 +naBC에 대해 728분 ± 301분(~12시간)의 양성률에 도달하는 평균 시간을 더하면, 이 박테리아 식별 접근 방식은 일상적인 진단 실험실에서 aBC를 받은 후 당일 보고를 제공할 가능성이 있습니다.

DIP에도 특정 제한 사항이 있습니다. 첫째, 접종물 제제의 허가 외 사용이기 때문에 결과는 예비 결과로 간주되어야 하며 EUCAST RAST에 의한 AST 결과도 마찬가지여야 합니다. 그럼에도 불구하고 적시에 상당한 진단 정확도를 가진 RR-GN만 식별하는 주요 목적을 제공합니다. 둘째, 약 60 % + naBC에서와 같이 테스트 자원의 낭비가 실제로 발생할 가능성이 있습니다. 다발성 생물 감염 또는 비 RRGN의 확인으로 인해 보고할 수 없었을 것입니다. 이러한 자원의 낭비는 혈액 배양을 위한 새로운 자동화된 직접 AST 방법 중 모든 것에 적용됩니다. 셋째, 본 연구에서 다발성 미생물 감염 및 일반적인 피부 오염 물질의 식별 비율이 더 높았는데, 이는 잘못된 검체 채취 관행으로 인한 것이었다. 넷째, 현재 세균 식별을 위한 황금 표준인 질량 분석법으로 테스트된 분리체의 신원을 확인하지 않았습니다.

이 연구는 표현형 검사로도 특히 그람 음성 균혈증에서 양성 혈액 배양에 대한 당일 보고를 수행할 수 있음을 성공적으로 입증했습니다. 이는 세균 식별 및 AST를 위한 미생물 진단이 기존 표현형 검사에 크게 의존하는 LMIC에서 적절한 항균 요법을 시작하는 기간을 상당히 단축할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 이 접근법은 다중심 연구를 수행하여 검증되어야 하며, 환자 결과에 대한 잠재적 영향을 입증해야 하며, 항균 관리 도구로서 LMIC의 향후 임상 시험에서 초점이 되어야 합니다.

결론적으로, aMIAST용 DIP는 EUCAST RAST 방법을 보완하여 RR-GN을 조기에 식별할 수 있도록 합니다. 이렇게 하면 고급 미생물 식별 및 AST 기술에 의존할 필요가 없으며, 이러한 접근 방식으로 보고하는 시간이 이 접근 방식과 비슷하기 때문입니다. 그람 음성 박테리아의 경우, 최대한 최적화하면 기존의 표현형 방법을 통해 당일 보고를 달성할 수 있습니다. 이는 광범위한 항생제 처리 기간을 단축하고 자원이 제한된 환경에서 항생제 관리를 촉진할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

저자는 밝힐 것이 없습니다.

이 연구는 AIIMS Bhopal이 Ayush Gupta 박사에게 제공한 교내 연구 보조금으로 자금을 지원받았습니다. 우리는 일상 및 응급 시간 동안 부지런히 테스트를 수행하고 판독한 실험실 기술자와 상주 의사의 기여를 인정합니다.