S. cerevisiae에서 감수 분열을 연구하기 위해 타임 랩스 현미경 및 단백질의 단계 별 핵 고갈 사용

타임 랩스 현미경은 신진 효모에서 감수 분열을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 이 프로토콜은 세포 주기 동기화, 타임랩스 현미경 검사 및 표적 단백질의 조건부 고갈을 결합하여 감수 분열 염색체 분리 동안 특정 단백질의 기능을 연구하는 방법을 설명하는 방법을 설명합니다.

타임랩스 형광 현미경은 고정된 세포를 이미징하는 방법으로는 종종 볼 수 없는 시간적 및 공간적 데이터를 제공함으로써 감수 분열 세포 주기 이벤트에 대한 이해에 혁명을 일으켰습니다. 신진 효모는 많은 감수 분열 유전자가 고도로 보존되어 있기 때문에 감수 분열 염색체 분리를 연구하는 중요한 모델 유기체임이 입증되었습니다. 신진 효모에서 감수 분열의 타임 랩스 현미경 검사를 통해 다양한 감수 분열 돌연변이를 모니터링하여 돌연변이가 감수 분열 과정을 어떻게 방해하는지 보여줄 수 있습니다. 그러나 많은 단백질이 감수 분열의 여러 지점에서 기능합니다. 따라서 기능 상실 또는 감수 분열 null 돌연변이의 사용은 초기 과정을 방해하여 이후 과정을 차단하거나 방해하고 각 개별 역할과 관련된 표현형을 결정하기 어렵게 만들 수 있습니다. 이 문제를 피하기 위해 이 프로토콜은 감수 분열의 특정 단계에서 단백질이 핵에서 조건부로 고갈되는 동시에 타임랩스 현미경을 사용하여 감수 분열 사건을 모니터링하는 방법을 설명합니다. 특히, 이 프로토콜은 세포가 I 단계에서 동기화되는 방법, 앵커 어웨이 기술을 사용하여 특정 감수 분열 단계에서 핵에서 단백질을 고갈시키는 방법, 감수 분열 염색체 분리를 모니터링하기 위해 타임 랩스 이미징을 사용하는 방법을 설명합니다. 이 기술의 유용성의 예로서, 키네토코어 단백질 Ctf19는 감수 분열 동안 다른 시점에서 핵으로부터 고갈되었고, 감수 분열 II의 말기에 염색질 질량의 수를 분석하였다. 전반적으로, 이 프로토콜은 감수 분열을 모니터링하면서 핵에서 다른 핵 단백질을 고갈시키도록 조정할 수 있습니다.

타임랩스 형광 현미경은 신진 효모 ^1,2에서 감수 분열 염색체 분리의 역학을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 신진 효모 세포는 주요 영양소의 기아를 통해 감수 분열을 겪도록 유도 될 수 있습니다³. 감수 분열 동안 세포는 한 번의 염색체 분리 후 두 번의 분열을 거쳐 포자로 포장되는 4 개의 감수 분열 생성물을 만듭니다 (그림 1). 감수 분열의 각 단계에서 개별 세포를 시각화 할 수 있으며, 이는 고정 세포 이미징으로 쉽게 놓칠 수있는 공간 및 시간 데이터를 생성합니다. 이 프로토콜은 타임 랩스 형광 현미경을 이전에 확립된 두 가지 방법인 유도성 NDT80 시스템(NDT80-in) 및 앵커 어웨이 기법과 결합하여 별개의 감수 분열 단계에서 특정 단백질의 기능을 연구하는 방법을 보여줍니다.

NDT80-in 시스템은 중간 감수 분열 전사 인자 NDT80 ^4,5의 유도 가능한 발현에 의존하는 감수 분열 세포주기 동기화를위한 강력한 도구입니다. NDT80 발현은 prophase I 출구 ^6,7에 필요합니다. NDT80-in 시스템에서 NDT80은 에스트로겐 수용체(Gal1-ER)4에 융합된 Gal4 전사 인자를 발현하는 세포에서 GAL1-10 프로모터의 제어 하에 있습니다.^4,5. Gal4-ER은 β- 에스트라 디올에 결합 할 때만 핵으로 들어가기 때문에 NDT80-in 세포는 β- 에스트라 디올이없는 상태에서 전상 I에서 정지하여 전상 I에서 세포의 동기화를 허용합니다 (그림 1). β- 에스트라 디올 첨가는 Gal4-ER 전사 인자의 핵으로의 전좌를 촉진하여 GAL1-10에 결합하여 NDT80의 발현을 유도하여 감수 분열로의 동시 진입을 유도합니다. 타임 랩스 현미경 검사는 동기화없이 수행 할 수 있지만 동기화를 사용하면 세포가 감수 분열의 특정 단계에있는 동안 억제제 또는 약물을 추가 할 수 있다는 장점이 있습니다.

앵커 어웨이 기술은 라파마이신⁸의 첨가로 단백질이 핵으로부터 고갈될 수 있는 유도성 시스템이다. 이 기술은 효모 세포가 핵 외피가 분해되지 않는 폐쇄 유사 분열 및 감수 분열을 겪기 때문에 신진 효모의 세포 분열 동안 핵 단백질을 연구하는 데 이상적입니다. 또한,이 기술은 감수 분열 전반에 걸쳐 여러 기능을 가진 단백질에 매우 유용합니다. 결실, 돌연변이 대립 유전자 또는 감수 분열 널 대립 유전자와 달리 특정 단계에서 핵에서 표적 단백질을 제거해도 초기 단계에서 표적 단백질 활성이 손상되지 않아 결과를보다 정확하게 해석 할 수 있습니다. 앵커 어웨이 시스템은 리보솜 성숙⁸시 발생하는 핵과 세포질 사이의 리보솜 서브 유닛의 왕복을 이용합니다. 핵으로부터 표적 단백질을 고갈시키기 위해, 표적 단백질은 리보솜 서브유닛 Rpl13A가 FKBP12로 태그된 균주에서 FKBP12-라파마이신-결합 도메인 (FRB)으로 태그된다. 라파마이신이 없으면 FRB와 FKBP12는 상호 작용하지 않으며 FRB 태그가 부착 된 단백질은 핵에 남아 있습니다. 라파마이신 첨가시, 라파마이신은 FKBP12 및 FRB와 안정한 복합체를 형성하고, 복합체는 Rpl13A와의 상호작용으로 인해 핵 밖으로 셔틀된다(도 1). 라파마이신 첨가시 세포 사멸을 방지하기 위해, 세포는 TOR1 유전자의 tor1-1 돌연변이를 보유한다. 또한, 이들 세포는 S. 세레비시아에 FKBP12 단백질의 널 대립유전자인 fpr1Δ를 함유하여, 내인성 Fpr1이 FRB 및 라파마이신 결합에 대해 Rpl13A-FKBP12와 경쟁하는 것을 방지한다. 앵커 어웨이 배경 돌연변이 tor1-1 및 fpr1Δ는 감수 분열 타이밍 또는 염색체 분리²에 영향을 미치지 않습니다.

이 기술의 유용성을 입증하기 위해, 키네토코어 단백질 Ctf19는 감수 분열 전반에 걸쳐 상이한 시점에서 고갈되었다. Ctf19는 유사 분열에 필수적이지만 감수 분열 9,10,11,12,13에서 적절한 염색체 분리에 필요한 키네토 코어의 구성 요소입니다. 감수 분열에서 키네 토코 레는 프로 페이즈 I에서 흘려지고 Ctf19는 키네 토코 레 재 조립에 중요합니다 ^9,14. 이 프로토콜의 경우, NDT80-in 시스템과 세포를 동기화하고, 앵커 어웨이 기술을 사용하여 전구 단계 I에서 방출되기 전후와 감수 분열 I 염색체 분리 후에 핵에서 표적 단백질 Ctf19를 고갈시켰다 (그림 1). 이 프로토콜은 감수 분열 및 유사 분열의 모든 단계에서 관심있는 다른 단백질을 고갈시키도록 조정할 수 있습니다.

1. 필요한 재료의 준비

1. 효모 세포의 성장과 포자 형성을위한 시약을 준비하십시오.
   참고: 신진 효모 균주가 ade2 - 및 trp1-인 경우 1.1.1-1.1.3 단계의 모든 배지를 1 % 주식에서 0.01 % 아데닌 및 0.01 % 트립토판의 최종 농도로 보충하십시오. 오토클레이브로 배지를 멸균하는 경우 시약을 고압멸균하고 실온으로 냉각시킨 후에만 이러한 아미노산을 추가합니다.
   1. 식물 성장을 위해 아미노산이 없는 효모 질소 염기 6.7g, 완전 아미노산 혼합물 2g 및 덱스트로스 20g을 물 500mL에 용해시켜 2x 합성 완전 + 덱스트로스 배지(2XSC)를 준비합니다. 121°C에서 20분 동안 오토클레이빙하거나 0.2μm 필터를 통해 여과하여 혼합물을 멸균합니다.
   2. 포자 형성의 첫 번째 단계를 위해, 아미노산이없는 효모 질소 염기 6.7g, 완전 아미노산 혼합물 2g 및 아세트산 칼륨 20g을 물 500mL에 용해시켜 2x 합성 완전 + 아세테이트 배지 (2XSCA)를 준비합니다. 121°C에서 20분 동안 오토클레이빙하거나 0.2μm 필터를 통해 여과하여 혼합물을 멸균합니다.
   3. 포자 형성의 마지막 단계를 위해, 5g의 KAc를 500mL의 물에 용해시켜 1 % 칼륨 아세테이트 (1 % KAc)를 준비한다. 121°C에서 20분 동안 오토클레이빙하거나 0.2μm 필터를 통해 여과하여 혼합물을 멸균합니다.
2. 현미경 검사, 동기화 및 앵커 어웨이를 위해 약물과 시약을 준비합니다.
   1. 타임랩스 이미징 중에 커버슬립에 세포를 부착하려면 1x PBS에 1mg/mL의 콘카나발린 A(ConA)를 만듭니다. 필터는 0.2μm 필터를 사용하여 멸균하고 -20°C에서 작은(~10μL) 분취량을 보관합니다.
   2. NDT80-in 시스템을 사용하려면 에탄올에 용해된 1mM β-에스트라디올 2mL를 만드십시오. 필터는 0.2μm 필터를 사용하여 멸균하고 분취량(~500μL)을 -20°C에서 보관합니다.
   3. 앵커 어웨이 시스템의 경우 DMSO에 용해된 1mg/mL의 라파마이신을 만듭니다. 필터는 0.2μm 필터를 사용하여 멸균하고 -20°C에서 작은(~10μL) 분취량을 보관합니다.
      참고: 약물의 여러 동결-해동 주기를 피하기 위해 라파마이신의 작은 분취량을 준비하십시오.
3. NDT80-in 시스템(P GAL1,10-NDT80/P_{GAL1,10-NDT80}; GAL4-ER/ GAL4-ER) 및 앵커 어웨이 유전적 배경에서 FRB로 태그된 표적 단백질(tor1-1/tor1-1; fpr1Δ/ fpr1Δ; Rpl13A-FKBP12/Rpl13A-FKBP12)^4,8. Ctf19-FRB를 본 연구에 사용하였다. 또한 히스톤 단백질 Htb2의 사본 한 개에 mCherry가 태그되어 감수 분열 진행 및 염색질 분리를 모니터링 할 수있었습니다.
4. 타임랩스 이미징을 위한 챔버 준비
   1. 이미징 6시간 전에 챔버 준비를 시작합니다-24시간(그림 2). 가열된 메스 또는 기타 날카로운 칼날을 사용하여 피펫 팁 상자 삽입물에서 18mm x 18mm 챔버를 자릅니다.
   2. 플라스틱 피펫 팁을 사용하여 커버 슬립에 부착 될 챔버의 하단 가장자리 주위에 실리콘 실란트의 얇은 층을 펼칩니다. 챔버의 가장자리가 완전히 덮일 수 있도록 충분한 밀봉 제를 추가하십시오 ( 그림 2 참조).
   3. 챔버를 실런트 면이 아래로 향하도록 커버슬립에 부드럽게 배치하여 챔버를 24mm x 50mm 커버슬립에 부착합니다. 챔버가 누출되지 않도록 밀봉 제에 틈이 없는지 확인하십시오.
   4. 8-10 μL의 ConA를 커버 슬립에 펼칩니다. 커버슬립 중앙에 ConA를 분배하고 피펫 팁을 사용하여 ConA를 얇은 층으로 펴서 챔버로 둘러싸인 커버슬립의 대부분을 덮습니다.
      참고: 플라스틱 챔버는 무기한 재사용할 수 있습니다. 타임랩스 이미징이 완료된 후 면도기를 사용하여 커버슬립에서 챔버를 제거하고 챔버에서 실리콘 실란트를 청소한 다음 나중에 사용할 수 있도록 챔버를 95% 에탄올에 담근 상태로 유지합니다.

2. 효모 세포의 포자 형성

1. 감수 분열 프로그램을 유도하기 위해 효모 세포의 기아에 대해 다음 단계를 수행하십시오.
   알림: 이 단계는 효모의 W303 균주의 포자 형성을 위한 것입니다. 다른 균주는 상이한 프로토콜(¹⁵)을 필요로 할 수 있다. 포자 형성 효율은 실험실 균주마다 매우 다양하며 W303은 ~ 60 % ^16,17,18의 포자 형성 효율을 나타냅니다.
   1. 플레이트에서 적절한 이배체 효모 균주의 단일 콜로니를 취하여 2XSC 2mL를 접종하고 롤러 드럼에서 30°C에서 12-24시간 동안 포화될 때까지 성장시킵니다.
   2. 2XSCA 2mL에 2.1.1단계의 배양물 80μL를 첨가하여 포화 배양물을 2XSCA로 희석한다. 롤러 드럼에서 30 ° C에서 12-16 시간 동안 자라게하십시오. 세포가 아프거나자가 형광이 될 수 있으므로 2XSCA에서 16 시간 이상 방치하지 마십시오.
   3. 배양물을 실온(25°C)에서 800 x g 에서 1분 동안 스핀다운하고, 액체를 버리고, 펠렛을 멸균 증류수 2mL에 재현탁시켜 2회 세척을 수행한다.
   4. 두 번째 세척 후 액체를 제거하고 펠릿을 1% KAc 2mL에 재현탁하고 롤러 드럼에서 25°C에서 8-12시간 동안 성장시킵니다. 감수 분열에 들어간 세포는 I 단계의 파키 텐에서 체포됩니다.
2. 프로페이즈 I 방출 시스템
   1. β-에스트라디올을 포자 형성 배양에 직접 첨가하여 최종 농도 1μM까지 하고 배양 튜브를 빠르게 와동시킵니다. β- 에스트라 디올은 I 단계에서 세포를 방출합니다.

3. 앵커 어웨이 기술을 이용한 핵으로부터 표적 단백질 고갈

1. 특정 단계에서 핵으로부터 FRB-태그된 단백질을 고갈시키기 위해 세포에 라파마이신을 첨가한다.
   1. prophase I 출구에서 핵으로부터 단백질을 고갈시키려면, β- 에스트라 디올 첨가와 동시에 포자 형성 배양 튜브에 1 μg / mL의 최종 농도로 라파 마이신을 첨가한다.
   2. 감수 분열의 특정 단계에서 핵에서 단백질을 고갈시키려면 β- 에스트라 디올 첨가 후 60 분부터 세포주기 단계를 모니터링하십시오. 20분마다 배양물 5μL를 24mm x 40mm 커버슬립에 피펫팅하고 18mm x 18mm 커버슬립으로 세포를 덮습니다. 배양물을 시점 사이의 25°C에서 롤러 드럼 상에서 회전시킨다.
   3. A594/mCherry 필터와 형광 현미경의 60x 대물렌즈를 사용하여 세포를 이미지화합니다. 투과율을 2%로 설정하고 노출 시간을 250ms로 설정합니다. 1, 2 또는 4 개의 DNA 덩어리의 존재는 세포가 진행된 감수 분열 단계를 나타냅니다. 관심있는 감수 분열 단계에서 1 μg / mL의 최종 농도로 라파 마이신을 첨가하십시오.
2. 이미징 준비가 될 때까지 롤러 드럼에서 25°C의 셀을 계속 회전시킵니다. 표적 단백질의 핵 고갈은 라파마이신 첨가 ^2,8 후 30-45분 후에 일어난다.

4. 타임랩스 형광 현미경

1. 이미징을 위해 세포의 단층을 만드는 데 사용할 한천 패드를 만듭니다 (4.2 단계 참조).
   1. 실린더를 만들기 위해 1.5mL 미세원심분리 튜브의 캡과 바닥 1/3을 잘라 버립니다. 실린더는 한천 패드의 금형 역할을합니다. 한천이 첫 번째 실린더에서 제대로 중합되지 않을 경우를 대비하여 두 개의 실린더를 추가로 만드십시오.
   2. 절단된 미세원심 튜브 실린더를 깨끗한 유리 슬라이드에 놓고 튜브 상단을 거꾸로 슬라이드에 놓습니다.
   3. 50mL 비커에 5% 한천 용액 6mL(용매로 1% KAc 사용)를 만들고 한천이 완전히 녹을 때까지 전자레인지에 돌립니다.
      알림: 한천은 전자 레인지에서 쉽게 끓습니다. 한천을 관찰하고 한천이 끓기 시작하고 비커를 소용돌이 치기 시작하면 전자 레인지를 시작하고 중지하십시오. 한천을 완전히 녹이기 위해 전자 레인지를 여러 번 시작하고 중지하십시오. 한천 용액은 한천이 완전히 용해되도록하는 데 필요한 양을 초과하여 만들어집니다.
   4. 피펫의 끝을 잘라 더 큰 개구부를 만들고 피펫 ~ 500 μL의 녹은 한천을 각 미세 원심 분리 튜브 실린더에 넣습니다. 한천이 굳을 때까지 실온에 두십시오(~10-12분).
2. 이미징을 위한 효모 세포 준비
   1. 단계 3.2의 포자 배양물 200μL를 800 x g 에서 1mL 미세 원심분리 튜브에서 2분 동안 스핀다운합니다. 상청액 180 μL를 제거하고 버린다. 튜브를 소용돌이 치고 튕겨서 나머지 상청액에 펠릿을 다시 현탁시킵니다.
   2. 농축된 세포 6 μL를 1.4단계에서 제조된 챔버의 중앙에 있는 커버슬립 상에 피펫팅한다.
   3. 4.1단계에서 만든 한천 패드로 실린더를 잡고 유리 슬라이드에서 조심스럽게 밀어냅니다. 한천의 바닥이 완전히 평평한지 확인하고 피펫 팁의 바닥을 사용하여 한천 패드가 튜브 경계보다 약간 위로 밀려나도록 미세원기 몰드에 약간의 압력을 가합니다.
   4. 한천 패드가 챔버를 향하도록 금형을 뒤집습니다.
   5. 집게를 사용하여 한천 패드(여전히 미세원심 튜브 몰드에 있음)를 셀 위에 부드럽게 놓습니다. 피펫 팁을 사용하여 한천 패드를 챔버 주위로 10-20회 부드럽게 밀어 커버슬립에 세포 단층을 만듭니다.
   6. 한천 패드를 챔버에 12-15 분 동안 그대로 두십시오. 이 단계를 통해 셀이 커버슬립의 ConA에 부착될 수 있습니다.
   7. 3.2단계의 포자 형성 배양 2mL를 2개의 미세 원심분리 튜브로 옮기고 15,700 x g 에서 2분 동안 회전합니다. 상청액을 깨끗한 미세원심분리 튜브로 옮기고 15,700 x g 에서 2분 동안 다시 회전시킵니다. 다음 단계에서 사용할 상청액을 깨끗한 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
      참고: 관심 단백질의 효율적인 포자 형성 및 지속적인 고갈을 보장하기 위해 β-에스트라디올 및 라파마이신과 함께 사전 조절된 KAc 상청액을 사용하는 것이 중요합니다.
   8. 한천 패드가 챔버에 12-15분 동안 앉은 후, 이미징하기 전에 한천 패드를 부유시키고 제거합니다. 그렇게 하려면 4.2.7단계의 상청액 2mL를 챔버에 적가합니다. 액체가 챔버의 상단에 도달하면 한천 패드가 떠 있을 가능성이 큽니다.
      알림: 한천 패드가 자동으로 뜨지 않으면 1-2분 동안 기다리십시오. 한천 패드가 여전히 뜨지 않으면 집게로 부드럽게 제거하십시오. 이상적으로, 한천 패드는 부유하기 전에 제거하면 세포가 제거될 수 있기 때문에 자체적으로 부유합니다.
   9. 한천 패드가 떠오른 후 집게로 부드럽게 제거하고 버립니다. 이미징 중 증발을 방지하기 위해 챔버 상단에 24mm x 50mm 커버슬립을 놓습니다.
3. 현미경에서 동영상 설정
   참고: 아래 지침은 24mm x 50mm 커버슬립을 수용할 수 있는 슬라이드 홀더가 장착된 도립 현미경에 대한 것입니다(현미경, 카메라 및 소프트웨어 세부 정보는 재료 표 참조). 60x 오일 이멀젼 대물렌즈는 이미지 획득에 사용됩니다. 이 프로토콜은 다른 현미경이나 다른 슬라이드 홀더를 사용할 때 변경해야 할 수 있습니다. 4.3.2단계부터 4.3.16단계까지 실행하는 정확한 단계는 사용하는 현미경 및 이미징 소프트웨어에 따라 다릅니다. 다른 현미경에 대한 지침은 섹션 4.4를 참조하십시오.
   1. 슬라이드 홀더 내부에 커버슬립을 끼웁니다. 성형 점토를 커버 슬립 측면에 부착하여 슬라이드 홀더에 단단히 고정하십시오.
   2. 이미지 수집 소프트웨어를 엽니다. 코스 및 미세 조정 노브를 사용하여 DIC 또는 명시야를 사용하여 셀의 초점을 맞춥니다.
   3. 이미지 수집 소프트웨어의 메인 메뉴에서 파일 > 수집(3D 해결)을 클릭합니다. 세 개의 창이 나타납니다.
   4. Resolve 3D라는 창에서 삼각 플라스크 아이콘을 클릭합니다. 그러면 타임랩스 동영상을 설정하기 위한 실험을 설정하기 위한 컨트롤이 포함된 실험/실행 창이 열립니다.
   5. 디자인 탭에서 단면화라는 레이블이 지정된 탭으로 이동합니다. Z 단면화 옆에 있는 상자를 선택합니다. z 스택을 다음과 같이 설정합니다: 광학 섹션 간격 = 1 μm, 광학 섹션 수 = 5, 샘플 두께 = 5.0 μm.
   6. 채널 탭에서 + 아이콘을 클릭하여 하나의 채널 옵션이 나타나도록 합니다. 적절한 채널을 선택합니다. 이 실험에서는 mCherry를 이미지화하는 데 사용되는 A594를 선택합니다. 참조 이미지 옆의 상자를 선택하고 드롭다운 메뉴에서 Z 위치를 샘플 중간으로 설정합니다.
   7. %T 및 Exp. 옆에 있는 드롭다운 메뉴에서 값을 선택하여 각각 투과율과 노출 시간을 설정합니다. 이 실험에서는 A594 채널에서 2% 투과율 및 250ms 노출 시간을 사용하고 명시야에는 10% 투과율 및 500ms 노출 시간을 사용합니다.
      알림: 노출 시간과 투과율은 현미경에 따라 다릅니다. 과다 노출을 방지하려면 관심 단백질의 적절한 시각화를 허용하는 가장 낮은 투과율과 가능한 가장 짧은 노출 시간을 사용하십시오.
   8. 타임랩스 탭에서 타임랩스 옆에 있는 상자를 선택합니다. 표시되는 표에서 타임랩스 행의 min 열 아래에 10을 입력하고 총 시간 행의 시간 열 아래에 10을 입력합니다. 이것은 10 시간 동안 10 분마다 이미지를 찍는 시간 코스를 실행합니다.
   9. 궁극의 초점으로 초점 유지 옆에 있는 상자를 선택하여 동영상 중에 스테이지 드리프트를 방지합니다. 포인트 탭에서 방문 포인트 리스트 옆에 있는 상자를 선택합니다.
   10. 주 메뉴에서 포인트 리스트 보기를 클릭합니다>. 포인트 목록이라는 창이 나타납니다. 스테이지를 셀의 단층을 보여주는 챔버 영역으로 이동합니다. 포인트 리스트 창에서 포인트 마크 를 클릭합니다.
   11. 셀을 과다 노출하지 않도록 스테이지를 이동하여 겹치지 않고 25-30 점을 선택하십시오. 각 필드는 각 시간 코스 동안 이미지화됩니다.
   12. 포인트 리스트 창에서 모두 보정을 선택하여 각 포인트의 최종 초점을 설정합니다. 실험 설계/실행 창의 설계 탭에서 포인트 리스트 창에서 가져온 포인트 값의 범위를 방문 포인트 리스트 옆의 상자에 입력합니다. 실행 탭에서 파일을 컴퓨터의 적절한 대상에 저장합니다. 실험 디자인/실행 창에서 재생 단추(녹색 삼각형 아이콘)를 선택하여 동영상을 시작합니다.
4. 선택적 방법: 현미경에서 동영상 설정
   참고: 이 지침은 24mm x 50mm 커버슬립을 수용할 수 있는 슬라이드 홀더가 장착된 도립 현미경용입니다. 사용된 현미경, 카메라 및 이미징 소프트웨어에 대한 사양은 재료 표를 참조하십시오. 60x 오일 이멀젼 대물렌즈는 이미지 획득에 사용됩니다.
   1. 슬라이드 홀더 내부에 커버슬립을 끼웁니다. 이미지 수집 소프트웨어를 엽니다. 코스 및 미세 조정 노브를 사용하여 DIC 또는 명시야를 사용하여 셀에 초점을 맞춥니다. 소프트웨어의 열린 창을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다. 드롭다운 메뉴가 나타납니다.
   2. 획득 제어 > 인수를 클릭합니다. 응용 프로그램을 클릭하여 실험을 정의/실행> 클릭합니다. 그러면 ND 획득이라는 창이 열립니다.
   3. 창이 열리면 XY 옆의 확인란을 선택합니다. 스테이지를 원하는 위치로 이동하고 포인트 이름 아래의 상자를 클릭하여 해당 위치를 포인트 로 선택합니다. 셀의 과다 노출을 피하기 위해 겹치지 않고 25-30 개의 포인트가 선택 될 때까지이 작업을 반복하십시오. 각 필드는 각 시간 코스 동안 이미지화됩니다.
   4. 각 형광 채널에 대한 투과율을 설정합니다. 균주가 Htb2-mCherry를 생성하기 때문에 여기에 mCherry 필터가 사용됩니다. 4.3.3단계에서 열린 획득 창에서 555nm 버튼으로 이동합니다. 5nm가 표시될 때까지 555nm 버튼 아래의 슬라이딩 스케일을 조정하여 투과율을 5%로 설정합니다.
   5. 각 형광 채널의 노출 시간을 설정합니다. 획득 창의 노출 드롭다운 메뉴에서 200ms 를 선택합니다.
      알림: 노출 시간과 투과율은 현미경에 따라 다릅니다. 과다 노출을 방지하려면 관심 단백질의 적절한 시각화를 허용하는 가장 낮은 투과율과 가능한 가장 짧은 노출 시간을 사용하십시오.
   6. ND 획득 창에서 Z 옆에 있는 상자를 클릭합니다. 1.2μM 떨어진 효모 세포의 Z 스택 5개를 설정합니다.
   7. λ 옆에 있는 상자를 클릭합니다. 실험에 사용할 적절한 채널을 선택합니다. DIC의 경우 Z pos 아래의 드롭다운 메뉴에서 홈이 선택되어 있는지 확인합니다. mCherry의 경우 Z pos 아래의 드롭다운 메뉴에서 모두 선택되어 있는지 확인합니다. 이렇게 하면 DIC에 대해 단일 섹션(z 스택 중간)만 사용됩니다.
   8. ND 획득 창에서 시간 옆에 있는 상자를 선택합니다. 단계 아래의 상자를 선택합니다. 간격 아래의 드롭다운 메뉴에서 10분을 선택합니다. 기간에서 10시간을 선택합니다. 이것은 이미지가 10 시간 동안 10 분마다 촬영되도록 시간 코스를 실행합니다.

5. 염색질 분리 분석

1. 피지 소프트웨어를 엽니다. 한 번에 하나의 보기 필드 열기: 각 필드에 대해 DIC 및 mCherry 채널을 엽니다.
2. 단일 이미지를 얻기 위해 mCherry 채널의 최대 강도 투영을 가져옵니다: Z 프로젝트에서 이미지 > >스택 을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 최대 강도를 선택합니다.
3. DIC와 mCherry 채널을 하나의 이미지로 병합: 이미지 > 색상 > 채널 병합을 클릭합니다.
4. 감수 분열을 통해 단일 세포를 따르십시오. 감수 분열 II 완료 후, DNA 질량의 수를 기록한다.

염색질 분리를 모니터링하기 위해, 히스톤 단백질 Htb2에 mCherry로 태그를 지정하였다. 전립선 I 단계에서 염색질은 단일 Htb2 덩어리로 나타납니다. 상동 염색체가 첫 번째 감수 분열에서 분리 된 후, 염색질은 두 개의 별개의 덩어리로 나타납니다 (그림 3A). 자매 염색분체가 분리된 후 염색질은 4개의 덩어리로 나타납니다. 일부 염색체가 스핀들 미세 소관에 부착되지 않으면 감수 분열 I 또는 감수 분열 II 후에 추가 덩어리가 보일 수 있습니다.

위에서 설명한 방법은 신진 효모 감수 분열에서 적절한 염색체 분리를 보장하는 키네토코어 성분 Ctf19의 역할을 연구하는 데 사용되었습니다. FRB로 태그된 Ctf19를 발현하는 앵커 떨어져 효모 균주를 NDT80-in 시스템을 사용하여 프로페이즈 I에서 동기화하였다 (tor1-1; fpr1Δ; RPL13A-FKBP12; CTF19-FRB; GAL1-10은 NDT80을 승격시켰다. GAL4-ER을 참조하십시오. 대조군으로서, NDT80-in 앵커 떨어져 균주 배경이 있지만 FRB-태그된 단백질이 없는 균주를 사용하였다(tor1-1; fpr1Δ; RPL13A-FKBP12; GAL1-10은 NDT80을 승격시켰다. GAL4-ER을 참조하십시오. 세포는 β-에스트라디올의 첨가에 의해 정지된 I 정지 단계로부터 방출되었다. 라파마이신을 첨가하여 방출 시(키네토코어 재조립 전), 방출 후 45분(키네토코어 재조립 후 감수분열 I 전) 또는 방출 후 3시간(감수분열 II 직전)에 핵으로부터 Ctf19-FRB를 고갈시켰다(그림 3A-F). 라파마이신의 첨가 후, 타임랩스 형광 현미경 검사를 수행하고, 감수 분열의 나머지 기간 동안 10분마다 이미지를 획득하였다.

이미징 후 오픈 액세스 소프트웨어 피지를 사용하여 이미지를 열고 시간 진행을 보여주는 수치에 대한 분석을 수행했습니다(그림 3A-F). 감수 분열 II 이후의 DNA 덩어리의 수는 조건 당 감수 분열을 겪고있는 적어도 100 개의 세포에서 계산되었습니다. 앵커 오프 배경을 가진 야생형 세포에서, 감수 분열 II의 말단에 전형적으로 4 개의 DNA 덩어리가 있으며, 이는 감수 분열의 4 가지 생성물을 나타낸다 (그림 3A). 세포의 작은 부분에서, 감수 분열 II 후에 단지 3 개의 덩어리 만 볼 수 있습니다 (그림 3B, G). 그러나 3 개의 종괴는 감수 분열의 4 가지 생성물을 가진 세포의 결과 일 가능성이 높지만이 종괴 중 2 개는 감수 분열 II 후에 함께 나타납니다.

Ctf19-FRB가 I 상 출구 (t = 0 h)의 방출시 고정되면 감수 분열이 완료되면 세포의 약 47 %가 4 개 이상의 DNA 덩어리를 나타내며 이는 키네 토코 레 및 미세 소관의 부착에 결함이 있음을 시사합니다 (그림 3C, G). 키네토코레 조립 후 감수 분열 I 전(t = 45분) 또는 감수 분열 II 이전(t = 3시간) 전에 Ctf19-FRB를 고정하면 세포의 약 16%가 추가 DNA 덩어리를 나타냅니다. 이러한 결과는 Ctf19가 I 단계 방출시 키네토코어 재조립에 중요하지만 키네토코어가 재조립되면 염색체 분리에서 덜 중요하다는 가설을 뒷받침합니다.

여기에서 얻은 결과는 세포 주기 동기화 및 표적 단백질의 조건부 고갈과 결합된 타임랩스 현미경이 특정 감수 분열 단계에서 단백질을 연구할 수 있음을 보여줍니다. Ctf19가 유사분열에 필수적인 것은 아니지만, 감수 분열 키네토코어는 광범위하게 재구성되며, Ctf19는 프로페이즈 I 출구 9,11,12 이후 키네토코어 재조립에 중요한 역할을 합니다. 그림 3의 결과는 키네토코어 재조립 전에 Ctf19가 고갈되면 감수 분열 II 후에 세포의 많은 부분이 추가 DNA 덩어리를 표시한다는 것을 보여줍니다. Ctf19가 키네토코어 재조립 후 감수 분열 I 또는 감수 분열 II 이전에 핵에서 고갈되면 추가 DNA 덩어리를 나타내는 세포가 더 적습니다. 이러한 결과는 Ctf19의 가장 중요한 역할이 I 단계의 말기에 있음을 시사합니다. 다양한 단계에서 Ctf19의 고갈에 따른 염색체 분리 충실도의 이러한 차이는 감수 분열 I 또는 감수 분열 II에서 단백질의 기능을 연구하기 위해 단계 특이 적 조건부 대립 유전자를 사용하는 것의 중요성을 강조합니다. 감수 분열 null 돌연변이는 심각한 결함을 나타 냈을 것이며 각 단계에서 Ctf19의 역할에 대한 정보를 제공하지 않았을 것입니다.

또한, CTF19가 필수 유전자는 아니지만, CTF19 돌연변이체¹⁹의 영양 성장 동안 염색체 투과 충실도 (ctf) 표현형이 존재한다. 널 대립 유전자 또는 돌연변이 CTF19 대립 유전자를 사용하면 감수 분열을 제대로 겪지 않을 수있는 이수성 세포 집단이 생성 될 수 있습니다. 앵커 어웨이 기술과 NDT80-인 동기화 시스템의 사용은 감수 분열 I 또는 감수 분열 II 직전에 핵으로부터 Ctf19를 정확하게 고갈시킴으로써 이러한 문제를 우회하여 분석 된 세포가 이수성 일 우려를 줄입니다.

그림 1: 실험 개요. 한 쌍의 상동 염색체를 보여주는 효모 세포의 만화. NDT80-in 세포는 감수 분열에 들어가 I 단계에서 체포됩니다. β- 에스트라 디올을 첨가 한 후, 세포는 감수 분열에 동 기적으로 들어간다. 라파마이신의 첨가는 표적 단백질(별표로 표시됨)이 멀리 고정되는 시기를 결정합니다. 본 실험에서, 표적 단백질 Ctf19는 전상 I과 동시에 라파마이신 (RAP)을 첨가함으로써(t=0분에서의 RAP 첨가), 전상 I 방출 후(t=45분에서의 RAP 첨가), 및 감수 분열 I 염색체 분리 후(t=3h에서의 RAP 첨가)에 의해 3개의 상이한 시점에 고정되었다. 두꺼운 검은색 화살표는 라파마이신 첨가의 세포 주기 단계를 나타내고, 따라서 표적 단백질 고갈을 나타낸다. 약어 : RAP = 라파 마이신. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 타임랩스 이미징 실험을 위한 챔버 설정. (A) 피펫 팁 홀더 인서트에서 절단된 재사용 가능한 챔버(오른쪽)(왼쪽). 피펫 팁 홀더 인서트는 적색 가열 블레이드로 절단되어 인서트의 4제곱 x 4제곱 부분을 제거합니다. 점선은 챔버를 만들기 위해 절단할 수 있는 팁 홀더의 샘플 섹션을 나타냅니다. 4 정사각형 x 4 정사각형 컷 아웃 내의 나머지 플라스틱 칸막이는 잘리고 속이 빈 챔버는 남아 있습니다 (오른쪽). (B) 최종 챔버를 만들기 위해 실리콘 실란트를 챔버의 한쪽면의 가장자리에 추가 한 다음 커버 슬립 위에 놓습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: Ctf19가 고정되는 시간은 염색질 분리에 영향을 미칩니다. (A-F) 감수 분열 동안 Htb2-mCherry를 발현하는 세포의 대표적인 타임 랩스 이미지. 이미지는 β- 에스트라 디올을 첨가 한 직후 10 분마다 촬영되었습니다. 스케일 바 = 5 μm. 각 프레임의 오른쪽 상단 모서리에 있는 숫자는 각 프레임 사이에 경과된 시간을 표시하고 시간 0은 감수 분열 I에서 염색질이 분리되는 프레임을 나타냅니다. 감수 분열을 완료 한 세포 만 계산되었습니다. (A) KAc 전달 후 12시간 후에 β-에스트라디올이 첨가된 야생형 세포(FRB로 태그된 단백질 없음). 세포는 감수 분열 II가 완료된 후 4 개의 DNA 덩어리를 포함합니다. (b) 라파마이신이 t=0에서 첨가된 Ctf19-FRB 세포 (β-에스트라디올 첨가와 동시에). 이 세포는 감수 분열 II 후 3 개의 DNA 덩어리를 보여줍니다. (c) 라파마이신이 t=0에서 첨가된 Ctf19-FRB 세포 (β-에스트라디올 첨가와 동시에). 이 세포는 감수 분열 II 후 5 개의 DNA 덩어리를 보여줍니다. (d) 라파마이신이 t=0에서 첨가된 Ctf19-FRB 세포 (β-에스트라디올 첨가와 동시에). 이 세포는 감수 분열 II를 완료 한 후에 죽습니다. (e) 라파마이신이 첨가된 Ctf19-FRB 세포에서 β-에스트라디올 첨가 후 45분. 이 세포는 감수 분열 II 후 5 개의 DNA 덩어리를 보여줍니다. (f) 라파마이신이 첨가된 Ctf19-FRB 세포에서 β-에스트라디올 첨가 후 45분. 감수 분열 II 후, 6 개의 DNA 덩어리가 존재합니다. (G) 각 조건에 대해 적어도 100 개의 세포에서 DNA 덩어리 수의 정량화 (각 조건에 대해 2 개의 영화 분석). t = 각 막대 아래는 라파마이신이 첨가된 시간에 대해 β-에스트라디올 첨가를 기준으로 나타낸다. 약어 : MII = 감수 분열 II. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

이 프로토콜은 세포를 동기화하는 NDT80-in 시스템, 핵에서 단백질을 고갈시키는 앵커 어웨이 기술, 감수 분열 동안 신진 효모 세포를 이미지화하는 형광 타임 랩스 현미경을 결합합니다. NDT80-in 시스템은 전상 I 정지 및 방출 ^4,8을 이용하는 감수 분열 세포주기 동기화를위한 방법입니다. 개별 세포는 각각의 후속 감수 분열 단계에서 소요되는 시간이 약간 다르지만 대부분의 세포는 감수 분열 전반에 걸쳐 높은 수준의 동기화를 유지합니다.

앵커 어웨이 기술은 유사분열 및 감수 분열 연구에 적응할 수 있는 도구입니다. 라파마이신의 앵커 떨어져 표적 단백질 및 시간을 추가로 변경함으로써, 이 방법은 출아성 효모 감수 분열의 임의의 단계 동안 다양한 단백질을 연구하는데 적응될 수 있다. 신진 효모 유사 분열을 연구하기 위해 조건부 돌연변이를 만드는 일반적인 방법이 감수 분열 연구에 항상 적합한 것은 아닙니다. 예를 들어, 억제가능한 프로모터의 사용은 종종 표적 단백질의 발현을 변경하기 위해 탄소원의 변화를 필요로 하며, 이는 감수 분열(²⁰)을 방해할 수 있다. 온도에 민감한 돌연변이체는 표적 단백질의 활성을 감소시키거나 폐지하기 위해 온도 변화에 의존합니다. 이러한 조건부 돌연변이의 대부분은 감수 분열 연구에 사용할 수 없기 때문에 영양소 조건이나 온도의 변화가 감수 분열을 방해 할 수 있기 때문입니다 21,22,23. 또한, 감수 분열 초기에 돌연변이 단백질을 발현하는 것이 후기 단계를 차단하거나 부정적인 영향을 미칠 수 있기 때문에 결실 또는 돌연변이는 감수 분열에 대한 연구를 제한 할 수 있습니다. 앵커 어웨이 기술은 영양^{이나 온도 8}의 변화에 의존하지 않기 때문에 이러한 문제를 피할 수 있습니다. 더욱이, 단백질의 고갈은 라파마이신 첨가의 시간이 단백질이 멀리 앵커링될 때를 결정하도록 시간적으로 조절될 수 있다.

앵커 어웨이 기술의 한 가지 한계는 표적 단백질을 핵 밖으로 운반하기 위해 앵커로서 Rpl13A 리보솜 서브유닛에 의존하기 때문에 비핵 단백질에 적합하지 않을 수 있다는 것이다. 그러나, 단백질을 복합체에 고정시키거나 이들을 막(⁸)에 테더링하는 것과 같이 감수분열 동안에도 유용할 수 있는 단백질-단백질 상호작용을 변경함으로써 앵커 어웨이 기술의 다른 응용이 있다. 이전 연구에 따르면 표적 단백질의 핵 고갈은 라파마이신^{추가 30}분 이내에 발생합니다.^2,8. 그러나 일부 단백질은 핵 밖으로 셔틀되기 위해 더 길거나 더 짧은 기간이 필요할 수 있습니다. 표적 단백질이 핵 밖으로 셔틀되는 것을 보장하기 위해, 표적 단백질은 GFP에 융합된 FRB (FRB-GFP)로 태그되어 라파마이신 첨가와 핵 고갈 사이의 시간을 모니터링할 수 있다. 앵커 어웨이 시스템의 또 다른 한계는 일부 단백질이 C-말단의 FRB 및 FRB-GFP 태그에 민감하다는 것입니다. 따라서 표적 단백질의 N 말단 태깅은 표적 단백질을 고정시키기 위한 대체 전략입니다.

염색질 분리를 모니터링하기 위해 신진 효모 세포는 Htb2-mCherry를 발현했습니다. 이 균주에서 Htb2 단백질은 내인성 유전자좌에 태그되어 Htb2가 정상적으로 발현되도록합니다. 다른 형광 태그가 부착 된 단백질도 감수 분열의 다양한 측면을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 타임 랩스 이미징을 위한 균주를 구성할 때 일부 단백질이 C 말단 형광 태그에 민감하다는 점을 고려하는 것이 중요합니다. 형광 태그가 부착된 단백질을 보유하고 있는 균주의 성장 및 포자 형성 분석은 태그가 단백질의 기능을 변경하지 않도록 합니다. 타임 랩스 형광 현미경의 한 가지 과제는 세포를 충분한 형광에 노출시켜 형광 단백질이 검출되도록 하는 동시에 과도한 노출로 인한 감수 분열의 감수 분열 또는 둔화를 방지하는 것입니다. 중요한 문제 해결 단계는 이 균형을 이루기 위해 적절한 현미경 및 카메라 설정을 찾는 것입니다. 필요한 노출 시간은 단백질마다 약간 다르므로 적절한 노출 시간을 결정하기 위해 실험을 여러 번 반복해야 합니다. 타임랩스 이미징 실험을 위해 여기에 설명된 챔버 방법을 사용할 때, 특히 민감한 단계는 이미징될 세포의 단층을 달성하는 것이다. 단층이 없으면 세포가 서로 겹쳐져 적절한 이미징 및 데이터 분석에 어려움이 있습니다. 세포가 ConA에 부착하고 챔버 주위에 세포를 퍼뜨리는 데 도움이 되는 한천 패드를 사용하는 것은 단층을 얻는 저렴하고 효율적인 방법입니다. 한천 패드를 이동하여 단층이 달성되도록 챔버 주위에 세포를 확산시키는 것은 어려울 수 있습니다. 한천 패드가 이동 과정에서 매우 작은 움직임을 보이는지 확인하면 단층을 만드는 데 도움이 될 수 있습니다. 재사용 가능한 챔버를 만들면 타임랩스 이미징 데이터를 저렴하게 생성할 수 있습니다. 적절한 청소 및 소독을 통해 여기에 설명 된 플라스틱 챔버를 무기한 재사용 할 수 있습니다. 타임 랩스 이미징 직후 커버슬립에서 챔버를 제거하고 다음 사용 전까지 95% 에탄올에 보관하는 것이 가장 좋습니다.

타임랩스 이미징은 고정된 세포(^1,2)를 이미징하는 것으로부터 놓칠 수 있는 세포 주기에 대한 정보를 제공한다. 예를 들어, 감수 분열 단계의 지속 기간을 모니터링 할 때, 고정 된 세포 집단과 비교하여 살아있는 세포를 이미징 할 때 단일 세포 간의 변이를보다 정확하게 검사 할 수 있습니다. 효모 단백질은 형광 단백질로 쉽게 태그를 지정할 수 있기 때문에 형광 타임랩스 이미징을 NDT80-in 시스템 및 앵커 어웨이 기술과 결합하면 개별 염색체 분리 및 특정 감수 분열 단계의 타이밍 모니터링과 같은 추가 연구에 적용할 수 있습니다. NDT80-in 세포에서 1상 방출 후 세포 주기 진행을 모니터링할 때 감수 분열의 단계를 표시하는 형광 분자로 태그된 단백질을 갖는 것이 중요합니다. 개별 염색체는 LacI-GFP를 발현하는 세포에서 염색체의 중심체 근처에 있는 lac 오페론(LacO)의 반복을 통합하여 감수 분열 전반에 걸쳐 모니터링할 수 있습니다. LacI-GFP는 LacO에 단단히 결합하고 밝은 초점으로 시각화되며, 이는 타임 랩스 현미경^24,25에 의해 감수 분열 전체에 걸쳐 추적 될 수 있습니다. 형광 태그가있는 다양한 단백질이 감수 분열 단계의 지속 기간을 모니터링하는 데 사용되었습니다. 여기에는 미세 소관에 통합되는 α- 튜 불린 서브 유닛 인 Tub1이 포함됩니다. Zip1, 시냅톤 복합체의 성분; 및 Spc42, 스핀들 폴 바디 구성 요소 1,2,26,27.

결론적으로, 이 방법은 감수 분열 세포 주기 동기화, 표적 단백질의 조건부 고갈 및 감수 분열 염색체 분리를 연구하기 위한 타임랩스 형광 현미경을 통합합니다. 감수 분열 동안 신진 효모 세포를 이미징하고 감수 분열의 의도 된 단계에만 영향을 미치는 조건부 돌연변이를 사용함으로써이 방법은 감수 분열 세포주기에 대한 정확한 데이터를 제공 할 수 있습니다.

저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

인디애나 대학교의 광학 현미경 이미징 센터에 감사드립니다. 이 작업은 국립 보건원 (GM105755)의 보조금으로 지원되었습니다.