파킨슨병을 연구하기 위한 화학물질, 단백질 또는 바이러스 벡터의 입체성 두개내 전달(Stereotaxic Intracranial Delivery of Chemicals, Proteins or Viral Vectors to Study Parkinson's Disease)

우리는 입체성 프레임을 사용하여 설치류의 특정 뇌 영역에 솔루션을 성공적으로 주입하는 방법을 설명합니다. 이 생존 수술은 파킨슨병의 다양한 측면을 모방하는 데 사용되는 잘 정립된 방법입니다.

파킨슨병(PD)은 전통적으로 안정시 떨림과 무력증으로 정의되는 진행성 질환으로, 주로 흑질의 도파민성 뉴런 손실로 인해 발생합니다. 영향을 받은 뇌 영역은 주로 알파-시누클레인(asyn) 단백질로 구성된 신경내 섬유소 내포물을 나타냅니다. 지금까지 어떤 동물 모델도 이 질병의 모든 특성을 요약하지 못했습니다. 여기에서는 PD의 다양한 측면을 모방하기 위해 화학 물질, 단백질 또는 바이러스 벡터를 두개골 내로 전달하기 위해 입체주사를 사용하는 방법을 설명합니다. 이러한 방법은 잘 정립되어 있으며 PD 분야 전반에 걸쳐 널리 사용됩니다. 입위 주사는 믿을 수 없을 정도로 유연합니다. 그들은 농도, 주입에 사용된 동물의 나이, 표적으로 한 두뇌 지역 및 사용된 동물성 종에서 조정될 수 있습니다. 물질의 조합은 치료를 평가하거나 병리학 또는 행동 결함의 중증도를 변경하기 위해 급격한 변화를 허용합니다. 뇌에 독소를 주입함으로써 염증 및/또는 도파민 뉴런의 심각한 손실을 모방하여 상당한 운동 표현형을 만들 수 있습니다. 바이러스 벡터는 유전적 또는 기계론적 측면을 모방하기 위해 세포를 transduction하는 데 사용할 수 있습니다. Preformed fibrillar asyn 주사는 장기간에 걸쳐 진행성 표현형을 가장 잘 요약합니다. 이러한 방법이 확립되면 새로운 형질전환 라인을 만드는 것보다 새로운 모델을 생성하는 것이 경제적일 수 있습니다. 그러나 이 방법은 사용된 모델에 따라 동물당 30분에서 4시간이 필요하기 때문에 노동 집약적입니다. 각 동물은 약간 다른 표적을 가지므로 한편으로는 결과를 해석하기 어려울 수 있는 다양한 코호트를 만들 수 있습니다. 다른 한편으로는, 환자에게서 발견되는 보다 현실적인 다양성을 모방하는 데 도움이 됩니다. 잘못 표적화된 동물은 행동 또는 영상 판독을 사용하여 식별하거나 희생된 후에만 식별할 수 있으므로 연구가 이미 끝난 후 코호트 크기가 더 작아집니다. 전반적으로 이 방법은 다양한 PD 측면을 평가하는 초보적이지만 효과적인 방법입니다.

파킨슨병(PD)은 비교적 흔한 진행성 신경퇴행성 질환으로, 60세 이상 인구의 최대 1%에 영향을 미칩니다¹. 파킨슨병은 이질적이지만 임상적으로 주로 안정시 떨림, 서동증, 무력증, 경직, 보행 장애 및 자세 불안정을 포함한 운동 증상을 특징으로 합니다. 대부분의 운동 증상은 일반적으로 선조체 도파민(DA)의 60-70%가 흑질(substantia nigra, SN) pars compacta ^2,3에서 진행성 및 뚜렷한 신경 퇴행의 결과로 손실될 때 나타납니다. 살아남은 도파민 뉴런은 루이소체(Lewy body)⁴로 알려진 세포 내 내포물을 포함하고 있습니다. 이러한 응집체는 주로 알파-시누클레인(asyn)으로 구성되며, 이는 뇌의 뉴런에서 작지만 고도로 발현되는 단백질입니다⁵.

파킨슨병에서 신경 퇴행의 근본적인 메커니즘은 아직 알려져 있지 않습니다. 노화는 여전히 이 질환의 가장 큰 위험 요인이다⁶. 더욱이, 인간은 파킨슨병이 자연적으로 발병하는 유일한 종이다. 따라서 파킨슨병의 병리학을 조사하고 질병 진행을 예방하기 위한 신약을 시험하기 위해 다양한 동물모델을 개발하였다⁷. 이상적으로, PD의 동물 모델은 세포 내 내포(intracellular inclusions)와 운동 기능 장애(motor function dys)를 동반하고 SN에서 DA 뉴런의 연령 의존적이고 점진적인 소실을 보여야 하며, DA 대체 요법에 반응해야 합니다. 현재 이용 가능한 동물 모델 중 어느 것도 PD의 모든 임상 증상과 병리학을 완전히 요약하지 않습니다. 각 모델은 질병의 다른 측면을 나타내므로 질문을 기반으로 실험에 사용할 적절한 모델을 신중하게 고려하는 것이 중요합니다.

역사적으로 동물 모델은 6-하이드록시도파민(6-OHDA) 및 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘(MPTP)을 포함한 독성 물질과 로테논 및 파라콰트⁸과 같은 살충제를 기반으로 했습니다. 각 독성 물질은 서로 다른 작용 기전을 가지고 있으며 DA 뉴런 특이적인 것부터 일반적으로 뇌 세포에 해로운 것까지 다양합니다. 독소는 경구로 투여하거나, 복강내로 주사하거나, 혈액 뇌 장벽 투과성에 따라 정위 주사를 사용하여 뇌에 직접 투여할 수 있습니다. 다른 모델과 달리 독소 모델은 높은 수준의 흑선조체 도파민 세포 손실 및 행동 표현형을 보장합니다. 일부 모델은 미묘한 병리학을 나타낼 수도 있습니다. 이러한 특징들로 인해 독소 PD 모델은 대체 요법과 PD ^9,10의 발병에 대한 환경 독소의 영향을 연구하기 위한 훌륭한 도구입니다.

또한, 다양한 프로모터 및 PD 관련 유전자를 사용하여 수많은 형질전환 마우스 모델이 생성되었습니다¹¹. 대부분의 마우스는 흑선조체 병리학을 가지고 있지만 신경 퇴행의 명확한 증거는 없습니다. 형질전환 모델은 동물과 코호트 간에 일관성이 있다는 장점이 있으며 일단 생성되면 유지 및 배포가 용이합니다. 신경 퇴행을 초래하지는 않지만, 그럼에도 불구하고 복합체 생체 내 시스템에서 유전적 변이 및 가능한 약물 후보로 인한 세포 변화를 조사하는 데 유용한 모델입니다¹².

형질전환 모델과는 대조적으로, PD 관련 유전자의 바이러스 벡터 매개 발현은 보다 유연한 접근법을 제공합니다¹³. 입체주사를 사용하면 생쥐, 쥐, 돼지 및 인간이 아닌 영장류와 같은 광범위한 동물 종에 대해 다양한 뇌 영역, 세포 유형 및 발현 수준을 선택할 수 있습니다. 초기에는 쥐 SN에 위치한 뉴런을 형질도입하기 위해 asyn을 인코딩하는 재조합 바이러스 벡터를 사용했습니다. 단백질 축적과 세포 기능 장애는 진행성 도파민 세포 손실에 선행하여 행동 결핍을 초래합니다. 표적화의 차이는 동물 간의 세포 손실(30-80%)의 큰 차이로 이어질 수 있으며, 이는 주입된 쥐의 약 25%에서만 나타나는 다양한 행동 결핍의 원인이 됩니다¹⁴.

최근에 확립된 모델은 미리 형성된 PFF(asyn fibrils) 또는 마우스 또는 환자의 뇌 조직에서 추출한 응집체의 두개내 주입입니다^15,16. 여러 연구에 따르면 PFF 또는 추출물의 주입은 동물의 뇌에 널리 퍼진 아신 병리학을 초래할 뿐만 아니라 SN의 도파민 뉴런 손실을 초래합니다. asyn의 축적은 주입된 부위를 신경 분포시키는 뉴런 내에서 나타납니다. 바이러스 벡터 기반 모델과 달리 PFF 모델은 수개월에 걸쳐 천천히 진행된 후 6개월에 걸쳐 운동 결핍이 발생합니다. 이 모델은 asyn 병리학의 메커니즘 또는 예방을 연구할 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있습니다^17,18.

위에서 언급한 모든 모델은 잘 정립되어 있으며 인간 장애의 다양한 측면을 연구하는 데 여러 번 사용되었습니다. 물질을 뇌에 직접 입체적으로 주입하는 것은 PD 분야뿐만 아니라 다른 신경 질환 분야에서도 이러한 동물 모델의 개발에 큰 역할을 했습니다. 정위 수술은 노동 집약적이지만 사용되는 동물의 연령, 표적 뇌 부위 및 주입 물질에 따라 매우 유연하다는 장점이 있으며 연구 질문에 따라 조정할 수 있습니다. 예를 들어, 질병의 더 많은 측면을 요약하거나 치료를 평가하기 위해 물질을 단독으로 또는 조합하여(벡터 + 피브릴 또는 독성 물질 + 벡터) 주입할 수 있습니다^19,20. 또한, 물질을 일방적으로 주입할 수 있으며, 주입되지 않은 쪽은 신경 퇴행뿐만 아니라 행동을 평가하기 위한 내부 대조군으로 남겨둘 수 있습니다. 따라서 이 원고에서는 입체택시 주입을 사용하여 PD 모델을 생성하는 자세한 단계를 간략하게 설명합니다.

이 연구의 모든 실험은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 실험용 동물 관리 및 사용 가이드(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)의 권장 사항에 따라 엄격하게 수행되었으며 미국 국립 노화 연구소(National Institute on Aging)의 동물 관리 및 사용 위원회(Animal Care and Use Committees)의 승인을 받았습니다.

시작하기 전에 이 절차를 수행하는 데 필요한 기관으로부터 적절한 교육과 윤리적 승인을 받았는지 확인하십시오. 또한 사용되는 마취제(예: 케타민 및 부프레노르핀 또는 펜타닐 및 메데토미딘)는 해당 기관의 관련 규칙에 따라 구입하고 취급해야 합니다.

1. 준비 (소요 시간 1 시간)

1. 동물을 수술실로 데려와 수술 구역을 설정하는 동안 동물이 적응할 수 있도록 합니다. 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용하십시오.
   알림: 이는 현지 안전 규정 및 주입된 물질에 따라 달라질 수 있습니다. 바이러스 벡터는 대부분 생물안전성 레벨 2 PPE가 필요합니다. 일반적으로 최소한 마스크, 장갑 및 일회용 실험복을 착용하십시오. 특정 상황에서는 추가 장갑과 고글을 사용해야 합니다.
2. 오토클레이브 또는 유리 구슬 살균기를 사용하여 수술 도구를 살균합니다. 설치류의 경우 메스 손잡이, 지혈 겸자, Dumont 핀셋, 곡선 집게, 상처 봉합 키트(클립) 또는 가위와 집게(봉합사용) 및 드릴 헤드가 필요합니다.
3. 수술 부위와 정위 기구를 70% 에탄올로 소독하고 정위 기구 옆 부분을 깨끗한 종이 타월이나 멸균 흡수 시트로 덮습니다.
4. 수건에 다음을 놓습니다: 안약(예: Liquigel), 헤어 트리머, 면봉, 희석된 요오딕산올, 일회용 수술용 칼날, 소독된 드릴 비트가 있는 수술용 드릴, 마커 또는 귀깎이, 1.5mL 튜브의 멸균 H₂O, 멸균 H₂O에 3 % H_{2O 2}가 있는 1.5mL 튜브(1.35mL의 H₂O + 0.15mL의 30 % H_{2O 2,} 갓 준비), 33G 바늘과 멸균 PBS 또는 식염수가 포함된 1mL 주사기, 주사 가능한 마취제를 사용하는 경우 진통제 및 해독제가 포함된 주사기(예: 아티파메졸 + 부프레노르핀/케토프로펜, 윤리적 허가에 따라 새로 준비 및 승인됨) 및 고압멸균 수술 도구.
5. 이소플루란을 채우고 가스 마취를 사용하는 경우 O₂ 및 N₂ 압력을 확인합니다. 흡입실 바닥에 종이 타월을 추가하여 건조하고 깨끗하게 유지하십시오.
   주사 가능한 마취제를 사용하고 윤리적 허가에서 승인된 경우 마취제(예: 펜타닐 + 메데토미딘(쥐의 경우) 또는 케타민 + 자일라진 용액(마우스의 경우))을 혼합하여 새로 준비합니다.
6. Hamilton 유리 주사기와 유리 모세관을 조립합니다(그림 1A 1.).
   1. 당겨진 유리 모세관을 테이블 위에 놓습니다. 검지 손가락을 모세혈관이 얇아지는 곳에 놓고 모세혈관을 절단해야 하는 손톱 끝을 놓습니다.
      참고 : 주입 깊이에 따라 0.5-2cm 사이입니다.
   2. 세라믹 타일의 가장자리를 사용하여 바늘 부분을 조심스럽게 몇 번 긁습니다. 한 손에 유리 모세관을 잡고 엄지와 검지로 얇은 바늘 부분을 잡습니다. 바늘이 뭉툭하게 부러질 때까지 중간에서 끝까지 당깁니다.
      알림: 작동하지 않거나 바늘이 가장자리에서 부러지면 몇 번 반복하십시오. 그래도 깨지지 않으면 타일 긁기를 반복하십시오. 바늘 부분이 너무 얇지 않고(직경 >50μm) 쉽게 구부러지지 않는지 확인하십시오.
7. 유리 모세관을 Hamilton 주사기에 밀봉합니다.
   1. Hamilton 유리 주사기에 부착된 뭉툭한 금속 바늘 위에 1cm 수축 튜브를 부착합니다. 그런 다음 유리 모세관의 두꺼운 끝을 Hamilton 금속 바늘 위에 놓습니다.
   2. 유리 모세관의 절반 위에 수축 튜브를 놓고 Hamilton 금속 바늘 끝과 모세관의 원뿔형 전이 사이에 최소 1cm의 공간을 확보합니다. 이것은 나중에 원하는 주사 용액을 보유하는 공간이 될 것입니다.
   3. 라이터나 성냥을 사용하여 수축 튜브를 가열하고 주사 바늘을 밀봉합니다.
      참고: Hamilton 주사기를 왼쪽의 입체 암에 고정할 수 있는 여러 가지 홀더 옵션이 있습니다. Hamilton 주사기의 숫자를 계속 읽을 수 있는지 확인하십시오. 펌프를 사용하여 용액을 주입하는 경우 펌프를 입체 암에 부착하고 Hamilton 주사기를 펌프에 고정합니다.
8. 금속 플런저를 제거합니다. 식염수 또는 PBS가 채워진 1mL 주사기에 부착된 27G 바늘을 Hamilton 주사기 상단 부분에 삽입합니다. Hamilton 주사기를 PBS로 세척하여 밀봉되어 있는지 확인하고 모든 기포를 씻어냅니다.
   알림: 기포는 공기가 액체보다 더 많이 압축되기 때문에 용액의 흡수 및 주입을 방해합니다.
9. 모든 것이 확인되고 준비되면 입체계 기기의 z축 암(그림 1A 2.)에 있는 작은 나사를 열고 암을 시계 방향으로 90° 회전하여 유리 주사기/모세관을 제거합니다(동물을 입체계 기기에 고정하는 동안 모세관이 파손되는 것을 방지하기 위해).
   알림: 모든 스테레오탁스 각도와 설정이 원하는 매개변수(일반적으로 0°)로 설정되어 있는지, 톱니와 이어바가 원하는 좌표로 설정되어 있는지, 해밀턴 주사기/모세관이 모두 직선인지 확인하십시오.
10. 스테레오택스 플랫폼에서 열 패드를 켜고 너무 따뜻하면 상단에 추가 패딩을 사용합니다. 수술 부위 옆에 추가 열 패드가 있는 비어 있고 깨끗한 케이지를 놓습니다.

2. 수술 (소요 시간, 동물당 평균 1시간)

1. 가스 마취용
   1. N₂ + O₂ 공기 흐름(약 1L/분)으로 이소플루란을 5%로 켜고 흡입실로 가는 밸브를 엽니다. 동물을 챔버에 넣고 잘 밀봉되었는지 확인하십시오. 호흡이 상당히 느려질 때까지 호흡을 관찰합니다(심호흡).
   2. 동물이 의식을 잃으면 입위 기구의 밸브를 열고 챔버 밸브를 닫습니다. 이소플루란을 2%로 설정합니다.
   3. 챔버를 열고 목을 잡고 있는 동물을 꺼내고 집게로 입을 벌린 다음 앞쪽 윗니가 구멍에 끼워지도록 동물을 치아 막대(그림 1A 6)에 놓습니다.
      참고: 이 단계는 동물이 이소플루란을 들이마시지 않으면 다시 깨어날 수 있으므로 시간에 민감합니다.
   4. 콧방울을 위에 놓고 호흡을 관찰하여 강제 호흡 없이 일정한 리듬을 유지합니다. 진행하기 전에 뒷다리의 페달 철수 반사 신경이 없는지 확인하여 동물이 깊이 마취되었는지 확인하십시오.
      참고: 동물이 호흡을 멈추거나 깨어나지 않도록 절차 전반에 걸쳐 계속 확인하십시오. 필요한 경우 이소플루란의 %를 조금씩 조정합니다. 뒷다리의 페달 철수 반사를 테스트하려면 핀셋을 사용하여 뒷발을 꼬집습니다. 동물이 팔다리를 집어넣으면(통증 자극을 제거하기 위한 반사) 마취가 너무 낮아진 것입니다.
   5. 두 개의 이어바를 사용하여 동물의 머리를 제자리에 고정합니다(그림 1A 7.). 올바르게 수행되면 귀가 이어바 위로 옆을 향해야 합니다. 머리가 여전히 움직이면 이어바나 노즈콘을 조정하여 머리를 제자리에 더 단단히 고정합니다.
      알림: 이어바를 너무 깊숙이 삽입하여 동물의 고막이 부러지지 않도록 부드럽게 하십시오. 쥐는 이어바가 올바르게 삽입되면 깜박이는 경향이 있습니다.
2. 주사 가능한 마취의 경우:
   1. 동물에게 적절한/권장되는 용량의 마취 i.p.(쥐의 경우 300μg/kg 및 300μg/kg 메데토미딘, 마우스의 경우 100mg/kg 케타민 및 10mg/kg 자일라진)를 주사하고 가정용 케이지에 다시 넣습니다.
   2. 주사 후 5분 후에 동물의 페달 철수 반사를 확인하십시오. 없는 경우 두 개의 이어바를 사용하여 동물의 머리를 제자리에 고정합니다(그림 1A, 7.). 올바르게 수행되면 귀가 이어바 위로 옆을 향해야 합니다. 그런 다음 동물을 이빨 막대에 놓고 (그림 1A 6.) 레버를 조입니다. 머리가 여전히 움직이면 이어바 또는 레버 콘을 조정하여 머리를 제자리에 더 단단히 고정합니다.
      알림: 이어바를 너무 깊게 삽입하면 동물의 고막이 부러질 수 있습니다. 레버를 너무 세게 조이지 마십시오. 동물의 코를 부러뜨릴 수 있습니다.
   3. 페달 철수 반사가 관찰되면 5-10분 더 기다립니다. 그래도 관찰되면 이전 마취제의 10%를 추가로 주입합니다.
      참고: 질식으로 인한 동물의 죽음을 피하기 위해 중간에 대기 시간을 두고 마취 복용량을 천천히 늘리십시오.
   4. 이빨 바 및/또는 이어바 높이를 조정하여 두개골이 평평한지 확인하십시오.
      알림: 막대를 조정하는 동안 머리의 각도가 바뀌고 노즈 콘/레버가 동물의 코를 부러뜨릴 수 있으므로 주의하십시오.
3. 수술 중 눈이 건조해지지 않도록 각 눈에 안약(예: Liquigel)을 바르십시오. 동물의 머리를 눈에서 귀까지 면도하십시오.
4. 요오드포비돈 10%를 사용하여 수술 부위를 소독합니다. 또한 절개 부위에 국소 마취제(예: 0.5% 리도카인)를 피내 주사합니다. 계속하기 전에 작동할 때까지 2-3분 동안 기다리는 것이 좋습니다.
5. 메스를 사용하여 눈 사이부터 귀 사이까지 한 번씩 연속으로 절개합니다.
   알림: 목 근육을 자르면 회복이 복잡해지므로 너무 많이 자르지 않도록 주의하십시오.
6. 솜털을 사용하여 상처를 열고 피가 묻지 않도록 해당 부위를 청소합니다. 쥐의 경우, 지혈 겸자를 사용하여 상처를 피하 조직에 고정하고 양쪽에 늘어뜨려 상처를 열어 두십시오. 마우스의 경우 필요한 경우 마이크로 클립을 사용하십시오.
   참고: 이것은 절차에서 가장 고통스러운 부분입니다. 피부 대신 피하 조직을 고정하면 치유가 빨라집니다.
7. 주사기/모세혈관(그림 1A, 1.)을 z축에서 시계 반대 방향으로 180° 이동하여(그림 1A, 2.) 동물의 머리 위로 가져갑니다. 수술 중 z축 암이 흔들리지 않도록 손잡이를 완전히 닫아야 합니다.
8. 현미경과 각 입체선 암의 손잡이(그림 1A 3.-5.)를 사용하여 유리 모세관(Hamilton 유리 주사기에 부착됨; 그림 1A 1.) 브레그마 바로 위(뼈를 만지지만 누르지 않음). 디지털 디스플레이의 모든 값을 0으로 설정합니다(그림 1A, 8.).
   참고: 브레그마(그림 1B)는 두정골과 전두골의 시상골과 관상동상간 봉합사가 만나는 지점입니다. 이것이 원점이 될 것입니다.
9. 현미경을 통해 모세관의 뭉툭한 끝을 람다 바로 위로 움직입니다. z축(등쪽/복부 = DV) 값이 +/-0.1mm 이내이면 동물의 머리가 수평을 이룬다. 더 높거나 낮은 경우 톱니 막대를 사용하여 +/-0.1mm 이내가 될 때까지 그에 따라 헤드를 조정합니다.
   참고: 람다(그림 1B)는 두정골과 후두골의 시상골과 관상동상간 봉합사가 만나는 지점으로 정의됩니다. 이 방법은 이어바를 개별적으로 조정할 수 있는 경우 두개골의 왼쪽과 오른쪽을 평평하게 하는 데에도 사용할 수 있습니다. 바를 조정하는 동안 머리의 각도가 바뀌고 노즈 콘 / 레버가 동물의 코를 부러뜨릴 수 있으므로 주의하십시오.
10. Allen brain atlas(그림 1C, D)를 사용하여 원하는 대상 영역의 좌표를 식별합니다. y축(전방/후방 = AP) 및 x축(내측/외측 = ML) 암을 사용하여 주사기/모세혈관을 올바른 위치로 이동합니다.
    참고: 염료 주입(그림 2A-E)은 사용된 동물의 균주/연령에 대한 좌표가 정확한지 확인하기 위해 별도의 동물에 대한 수술 절차 전에 수행해야 합니다.
11. 현미경을 통해 살펴보고 모세혈관의 뭉툭한 끝이 뼈와 만나는 곳에 조심스럽게 구멍을 뚫을 준비를 합니다. 시작하기 전에 드릴링하는 동안 모세관이 손상되지 않도록 y축에서 모세관을 충분히 위로 이동합니다. 더 큰 원에서 드릴링을 시작하고 더 깊게 드릴링할수록 작아집니다. 드릴링하는 동안 이어바에 손을 올려 흔들리지 않게 하십시오.
    알림: 뇌 조직까지 뚫지 마십시오. 경막이 손상되지 않도록 뼈를 얇게 남겨 두십시오. 대신 핀셋을 사용하여 남아 있는 얇은 뼈층을 조심스럽게 제거합니다.
12. 현미경을 사용하여 바늘의 뭉툭한 끝이 뼈 조각에 의해 우회되지 않고 경막/뇌 조직에 닿을 수 있는지 확인합니다.
13. 주사기 / 모세관을 청소하여 주입 용액의 오염을 방지하십시오.
    1. 주사기/모세관을 끝까지 움직여 3% H₂O₂가 들어 있는 1.5mL 튜브에 넣습니다. 유리에 묻은 모든 부스러기와 혈액을 제거하십시오. 그런 다음 H₂O 가 들어있는 1.5 mL 튜브에 모세관을 담그고 H₂O₂ 를 씻어냅니다.
    2. 해밀턴 주사기에서 금속 플런저를 제거하고 동물의 머리 위에 있는 주사기/모세관 아래에 거즈를 놓습니다. PBS가 채워진 1mL 주사기를 사용하여 상단에 바늘을 삽입하고 PBS를 분출하여 Hamilton 주사기를 세척합니다. 그런 다음 금속 플런저를 Hamilton 주사기에 삽입합니다.
14. 1μL의 공기를 빨아들입니다. 이렇게 하면 Hamilton 주사기의 PBS와 주입 용액이 모세관에서 혼합되는 것을 방지할 수 있습니다. 그런 다음 원하는 양의 주입 용액을 끌어냅니다. 침전물당 최대 1 μL 및 2 μL는 마우스와 쥐에 각각 권장됩니다.
    참고: 뇌의 압력이 너무 많이 상승하므로 반구당 총 3μL/6μL를 초과해서는 안 됩니다. 펜을 사용하여 용액의 반월판이 있는 곳에 작은 표시를 매우 조심스럽게 만들 수 있습니다. 그런 다음 이 표시를 용액이 뇌에 들어가는지 측정하기 위한 기준점으로 사용할 수 있습니다.
15. 쥐의 경우 25G 바늘을 사용하여 경막에 구멍을 뚫습니다. 모세혈관을 원하는 DV 좌표로 뇌에 삽입합니다. 주사기/모세관을 의도한 것보다 0.1mm 더 깊게 이동하고 용액을 위한 공간을 만들기 위해 다시 위로 당깁니다.
16. 수작업(10-15초당 0.1μL) 또는 펌프(0.4-0.6μL/분)로 용액을 주입합니다. 반월상 연골 부위를 확인하여 용액이 완전히 주입되었는지 확인하십시오.
    참고: 용액이 뇌로 이동하지 않으면 주사기/모세혈관을 위아래로 0.2mm 움직입니다. 그래도 주입되지 않으면 2.13-2.14 단계를 반복합니다. 아마도 바늘은 뇌 조직 파편으로 막혔을 것입니다.
17. 주사기/모세관을 5분 더 제자리에 유지하여 주입된 용액이 분산되고 압력이 내려갈 수 있도록 합니다. 이 대기 기간 동안 진통제를 주사하고 필요한 경우 동물에게 표시를 하십시오.
18. 주사기/모세관을 0.2mm 위로 이동하고 2분 더 제자리에 유지합니다. 음압으로 인해 주입된 용액을 잡아당기지 않도록 주사기/바늘을 매우 천천히 당겨 빼냅니다.
19. 주사기/모세혈관이 뇌에서 나오면 조직이 건조하고 모세혈관을 막는 것을 방지하기 위해 2.13단계에서 설명한 대로 청소합니다.
20. 더 많은 뇌 부위에 계속 주입하거나 수술을 마칩니다.
21. 주사기 바늘을 z축에서 180° 돌려 상처를 봉합하는 동안 파손을 방지하기 위해 주사기 바늘을 옆으로 움직입니다. 그런 다음 클립, 조직 접착제 또는 봉합사로 상처를 봉합합니다. 주사용 마취제를 사용한 경우 동물에게 해독제를 주사합니다.
    참고: 단독으로 수용되지 않는 동물은 서로의 머리를 씻기고 클립, 접착제 또는 실밥을 제거하는 경향이 있습니다.
22. 입체 프레임에서 동물을 제거하고 열 패드 상단의 깨끗한 케이지에 넣습니다. 동물이 합병증 없이 깨어나는지 확인하기 위해 동물을 모니터링하십시오. 처음 24시간 동안 음식과 물에 쉽게 접근할 수 있도록 합니다.

3. 수술 후 관리(3-7일 기간)

1. 적절한 회복을 위해 향후 2-3일(독성 물질 주입의 경우 최대 10일) 동안 동물의 체중(10% 체중 감량 허용), 털, 배설물 및 음식/수분 섭취량을 확인하십시오. 필요한 경우 동물을 격리하고 습식 사료, 식염수 주사 및 발열 패드를 제공하는데, 이는 동물에게 추가적인 전신 문제가 있을 수 있으므로 일부 독성 주사에 필수적입니다.
2. 현지 규정에 따라 통증 완화를 위해 수술 후 1-2일 동안 동물에게 진통제를 더 주사합니다. 봉합사, 클립 또는 접착제가 저절로 떨어지지 않으면 이소플루란을 사용하여 동물을 마취하고 봉합사, 클립 또는 접착제를 수술 후 1주일 후에 제거합니다.

표적 오인을 방지하려면 모든 실험 전에 염료 주입을 사용하여 좌표를 확인하십시오. 동물에게 동일한 프로토콜을 사용하여 0.2-0.5 μL 트립토판 블루를 주입하고, 주입 후 모세혈관을 빠르게 빼내고, 확산을 피하기 위해 뇌를 빠르게 동결했습니다. 마이크로톰을 절편한 후 주입 부위를 파란색으로 볼 수 있습니다(그림 2 C,E). 효과적인 표적화를 위해 실제 실험 전에 2-3마리의 동물에게 염료 주입을 성공적으로 수행해야 합니다.

입정주사는 다양한 정도의 병리학 및 신경 퇴행을 가진 세 가지 주요 파킨슨병 모델을 만드는 데 사용할 수 있습니다. 일반적으로 PD 분야에서 신경 퇴행은 독성 환경으로 인한 TH의 하향 조절이 흑세포 사멸의 환상을 줄 수 있기 때문에 도파민성 뉴런의 마커인 티로신 하이드록실라제(TH)와 일반적인 뉴런 마커(예: 뉴런 핵[NeuN] 또는 HuC)를 정량화하여 평가합니다.

6-OHDA와 같은 독성 물질을 주입할 때 목표는 가능한 한 많은 흑질 도파민 세포를 근절하는 것입니다. 6-OHDA는 모노아민 수송체에 의해 흡수되어 미토콘드리아 호흡을 차단합니다²¹. 데시프라민은 독성 물질이 노르아드레날린성 또는 세로토닌성 세포가 아닌 도파민 뉴런에 의해서만 흡수되도록 하기 위해 각 수술 전에 투여됩니다. 각 주사의 성공 여부를 평가하기 위해, 고정 중뇌 절편은 TH 및 NeuN에 대한 면역 표지를 받아야 합니다. 독소가 빠르게 작용하기 때문에 이 모델은 주입 후 완전히 개발되는 데 2-3주밖에 걸리지 않습니다. 내측 전뇌다발(MFB)에 6-OHDA 주입이 성공적이었다면, 도파민 세포 손실은 PBS 주입 대조군에 비해 80% 이상이어야 합니다(그림 2 F-G). MFB는 흑질선조체(nigrostriatal project)가 함께 뭉쳐진 영역이므로 한 번의 주사로 많은 도파민 뉴런을 표적으로 삼을 수 있습니다. 독성 물질은 덜 심각한 세포 사멸을 위해 흑질 또는 선조체에 직접 주입될 수도 있습니다.

바이러스 벡터 기반 모델은 사용된 벡터의 (sero-)유형에 크게 의존합니다. AAV2는 생산이 용이하고 도파민 뉴런에 대한 친화력이 높기 때문에 가장 일반적으로 주입되었습니다. 발현 프로모터, 바이러스 캡시드 및 외피 단백질의 엔지니어링은 뇌 영역과 세포 집단에 대한 보다 특이적인 표적화의 문을 열었습니다. PD 모델에서 대부분의 바이러스 벡터는 SN에 직접 주입되어 pars compacta에서 도파민 뉴런을 형질전환 합니다. 대부분의 벡터의 발현은 주입 후 3주 후에 안정화되며 외인성 단백질에 대한 면역 표지로 시각화할 수 있습니다. 일반적으로 GFP는 신경 퇴행을 일으키지 않는 역가에서 대조군으로 표현됩니다(그림 2H). PD 관련 유전자는 질병의 유전적 측면, 예를 들어 asyn의 복제 또는 삼중화를 모방하는 데 사용됩니다. 검둥 뉴런에서 asyn의 과발현은 도파민 세포 사멸을 유발합니다(그림 2I).

PFF 모델은 PD 도구 키트에 가장 최근에 추가된 모델입니다. 응집된 asyn은 PFF를 생성하기 위해 재조합 asyn 단백질을 일주일 동안 흔들어 체외에서 얻거나 동물 모델 또는 환자 뇌에서 응집체를 분리하여 획득할 수 있습니다. 주입된 PFF 또는 뇌 추출물은 주입 부위에 돌출된 뉴런에 축적을 유발합니다. 이 모델은 내인성 asyn을 상승시켜 응집을 유도하는 대신 정상 내인성 asyn을 트리거하여 인산화하고 축적하는 데 의존한다는 점에서 독특합니다. Asyn PFF는 일반적으로 선조체에 주입됩니다. 주사 후 몇 주 후, 인산화된 asyn에 대한 면역 표지를 통해 전전두엽 피질, 선조체, 피질 및 SN에서 asyn 병리학을 시각화할 수 있습니다(그림 2K). PBS 또는 혈청 알부민의 대조 주사는 PD의 전형적인 신경세포 내 축적을 초래하지 않습니다(그림 2J).

입체 주사 방법은 까다롭고 비용이 많이 들 수 있으며, 일반적인 오류는 일반적으로 동물을 희생시킨 후에만 감지할 수 있습니다. 뭉툭한 끝의 모세관 두께는 당기는 방법에 따라 10-100μm까지 다양할 수 있습니다. 모세혈관이 너무 얇으면 뇌로 들어가는 동안 막혀 주입에 실패할 수 있습니다(그림 2L). 이 특별한 경우, 주사의 효과는 보이지 않는 동안 흉터 조직과 깨끗하지 않은 혈액 세포로 바늘 요로를 식별할 수 있습니다. 또 다른 일반적인 오류는 잘못된 타겟팅입니다(그림 2M). 나이가 들면 브레그마를 결정하기 어려울 수 있으며, 잘못된 좌표 또는 판독 오류로 인해 주입이 잘못 배치될 수 있습니다. 더 큰 동물(예: 쥐)과 더 큰 뇌 영역(예: 선조체)에서는 표적화가 덜 복잡하지만, 예를 들어 생쥐 SN 주사에서는 점점 더 어려워집니다. 또 다른 흔한 실수는 복용량입니다. 대조 물질은 그 자체로 10-15% 이상의 세포 사멸을 일으키지 않아야 합니다. GFP(그림 2N) 또는 PBS 주입의 발현이 독성이 있는 경우 병리학 및 세포 사멸이 주입된 물질에 특이적인지 확인하기 위해 매개변수를 변경해야 합니다.

그림 1. 정위 수술을 위한 설정. (A) 디지털 리더 및 유리 주사기를 포함한 생존 수술 중 입위 세공 설정의 개략도, 오른쪽에 자세히 설명되어 있습니다. (B) 설치류의 두개골 해부학적 구조로 뼈판(전두골, 두정골 및 후두골)과 그에 상응하는 봉합사가 브레그마(bregma)와 람다(lambda)를 생성합니다. (씨,디) Allen brain atlas 웹페이지에서 발췌한 이미지로, 마우스 선조체(C)와 중뇌(D)의 관상 절편을 mm 단위의 해당 좌표 그리드와 함께 보여줍니다. biorender에서 채택한 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2. 파킨슨병 동물 모델의 조직학적 예. (A) 마우스 뇌의 방향에 대한 개략도. 파란색 선은 B와 C의 관상 선조체 절편의 위치를 나타내고, 녹색 선은 D와 E의 관상 중뇌 절편의 위치를 나타냅니다. (B,D) B의 선조체 영역과 D의 중뇌 영역을 보여주는 관상 마우스 뇌 절편의 그림. 블랙 박스는 F-N의 확대된 복부 중뇌(substantia nigra) 영역을 나타냅니다. (씨,이자형) 좌표는 실험 전에 0.2μL 트립토판 블루를 주입하여 정확도를 테스트했습니다. 수술 후 즉시 뇌를 적출하여 동결하고 마이크로톰에서 절단하여 표적을 분석했습니다. 선조체(striatum) 및 흑질(substantia nigra)의 올바른 표적화에 대한 예는 각각 C 및 E에 나와 있습니다. (여,지) 6-하이드록시도파민(6-OHDA) 모델의 대표적인 이미지는 흑질 절편에서 도파민 마커 티로신 하이드록실라제(TH)에 대한 면역 표지로 표시됩니다. 6-OHDA(3μg/μL의 4μL; G) 또는 대조군(F)으로서의 PBS를 내측 전뇌 다발(MFB)에 주입하고 수술 6주 후 랫드를 희생시켰다. 주사 30분 전에 노르아드레날린성 세포 사멸을 방지하기 위해 25mg/kg 데시프라민을 IP로 투여했습니다. (H,나) 바이러스 벡터 기반 동물 모델의 예는 형질도입된 세포를 녹색(GFP 전이유유전자[대조 벡터], H) 또는 빨간색(asyn, I에 대한 면역 표지) 및 DA 뉴런(흰색)으로 보여줍니다. 혈청형 6(7 x 10¹³ 바이러스 게놈/mL 1 μL)을 가진 AAV를 substantia nigra pars compacta(SN)에 직접 주입하고 수술 4주 후 마우스를 희생했습니다. (제이,케이) 8μg의 마우스 asyn PFF(K) 또는 PBS를 대조군(J)으로 주입한 쥐의 대표적인 이미지는 인산화된 asyn(갈색) 및 크레실 바이올렛(자주색)을 가진 세포핵에 대해 면역 표지되었습니다. 랫드를 선조체(2 x 2 μL 침전물)에 주입하고 주입 후 8주 후에 희생시켰습니다. Duffy et ^al.21에서 발췌한 이미지. (엘,엠,엔) 입체택시 실험의 일반적인 오류는 주입된 바이러스 용액이 없음(L, 화살표로 표시된 바늘 관), 잘못된 표적(M, 이 경우 너무 측면) 및 대조군 주입으로 인해 세포 사멸(N, 빨간색 원으로 표시된 누락된 세포)이 발생합니다. 형질도입된 뉴런은 GFP의 경우 녹색, TH의 경우 흰색으로 면역 표지됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

정위 주사는 모든 외과 절차와 마찬가지로 동물의 복지와 생존을 보장하는 데 가장 큰 어려움이 있습니다. 따라서 시술 전반에 걸쳐 동물을 면밀히 모니터링하는 것이 중요합니다. 호흡 불규칙, 호흡 상실 또는 반사 신경과 움직임의 재발을 관찰하는 것이 주요 초점이 되어야 하며, 특히 경험이 부족한 외과의의 경우 더욱 그렇습니다. 또한 진통제를 사용하는 것은 회복 과정을 돕는 데 중요합니다. 독성 물질과 관련된 수술은 특히 회복이 어려울 수 있으므로 추가 습식 사료를 공급해야 합니다.

동물 복지 외에도 정위 주사의 주요 기술적 복잡성은 잘못된 표적화입니다. 따라서 각 실험을 시작하기 전에 이전 실험에서 정확했던 경우에도 좌표를 확인하는 데 조종 동물을 사용해야 합니다. 번식, 식단 및 나이는 머리와 뇌의 모양과 크기에 영향을 미칠 수 있으며 좌표의 총체적인 과대평가/과소평가로 이어질 수 있습니다. 작은 동물을 대상으로 하는 것은 더 까다롭기 때문에 재현성 있는 주입 결과를 보장하기 위해 머리를 적절하게 수평을 맞추는 것이 중요합니다. 입체 기구를 컴퓨터 프로그램에 연결하는 새로운 기술은 두개골 상단의 특정 지점을 측정하여 각 동물의 좌표를 조정하고 오류를 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다. 특히 장시간 수술 후 좌표를 읽는 오류도 디지털 도구로 줄일 수 있으며 재정적 투자의 가치가 있습니다. 돼지 및 영장류와 같은 대형 동물의 경우 MRI 또는 CT 스캔을 사용하여 보다 정확한 좌표를 계산하고 잘못된 표적 가능성을 줄입니다.

또 다른 어려운 장애물은 주사 중 모세 혈관이 막힐 수 있습니다. 각 모세관의 모양, 크기 및 두께는 특히 손으로 당기는 경우 다를 수 있습니다. 유리가 너무 얇으면 수술 중에 모세혈관이 끊어지거나 구부러지거나 주입 경로를 방해하는 조직을 흡수하여 막힐 수 있습니다. 모세혈관이 너무 두꺼우면 뇌로 들어가 흉터 조직을 남기는 동안 많은 구조를 파괴하고 파괴할 수 있습니다. 따라서 Sutter Inc.는 다양한 모양과 크기의 모세관을 만들기 위한 쿡북(https://www.sutter.com/PDFs/pipette_cookbook.pdf)을 제공하지만 대부분 전기 생리학에 최적화되어 있습니다. 최신 당기는 기계는 수술에 사용되는 더 긴 모세혈관을 위해 수동으로 작동해야 합니다. 또 다른 훌륭한 대안은 주사에 필요한 정확한 사양의 사전 당겨진 모세혈관을 주문하는 것입니다. 이상적으로는 무딘 유리 모세관의 직경이 80-100μm까지 올라갈 수 있지만 20μm보다 작아서는 안 되며 길이는 주입 깊이(DV 좌표)에 따라 다릅니다. 유리를 주입 모세관의 재료로 사용하는 것이 중요합니다. 유리는 금속 바늘보다 미세한 게이지로 사용할 수 있으며 주입 가능한 물질은 유리와 상호 작용하거나 유리에 결합하는 경향이 적습니다.

각 동물은 서로 조금씩 다르기 때문에 표적화도 동물마다 다르기 때문에 다양한 세포 사멸 및 병리학을 가진 다양한 코호트를 만들 수 있습니다. 이러한 다양한 코호트로 인해 결과를 해석하거나 좋은 N 번호를 얻기가 더 어려워질 수 있습니다. 따라서 각 연구가 성공하기 위해서는 적절한 동력이 공급되어야 합니다. 생체 내 모델을 개발하기 위한 보다 일관된 전략에는 형질전환 동물을 만들기 위한 유전자 변형이 포함됩니다. 이 방법은 CRISPR 기술을 사용하더라도 초기 단계에서는 비용이 많이 들고 어렵지만, 이러한 모델은 동물 내 변동이 거의 없고 최소한의 추가 작업이 필요하기 때문에 나중에 성과를 거둘 수 있습니다. 또한 형질전환 동물을 실험실에서 실험실로 옮기는 것이 상당히 복잡하지 않아 많은 과학자들이 쉽게 사용할 수 있는 도구입니다. 적어도 파킨슨병 분야에서는 형질전환 접근법의 약점은 도파민성 세포 사멸¹¹, 일반적으로 적절한 제어 라인, 가설 또는 새로운 증거에 따라 모델을 변경 및 조정할 수 있는 유연성이 부족하다는 것입니다. 또한, 이종교배는 정해진 실험에 필요한 것보다 훨씬 더 많은 동물을 생산할 것이다. 일단 설정되면 입체성 동물 모델은 독성 물질, 바이러스 벡터 및 피브릴 균주를 보다 쉽게 변경할 수 있으므로 보다 비용 효율적이고 유연할 수 있습니다. 두 방법 모두 신경 퇴행 분야에서 타당한 위치를 차지하고 있으며 제기된 과학적 질문을 해결하기 위한 적절성에 따라 선택되어야 합니다.

PD 동물 모델에서 독성 물질을 사용하면 지속적이고 심각하며 재현 가능한 도파민 변성을 초래할 수 있습니다. 독성 물질을 사용하는 동안 오류는 주로 이러한 물질을 취급하는 동안 발생합니다. 6-OHDA와 같은 대부분의 독성 물질은 빛과 온도에 민감하며 산화되기 쉽습니다. 이것은 주입 전에도 물질을 무력화시키고 독성이 낮거나 전혀 없을 수 있습니다. 그러므로, 용액은 산화를 방지하기 위해 아스코르브산을 첨가하여 신선하게 준비되어야 하며, 주입 전과 주입 중에 빛 노출로부터 보호되어야 한다²². MPTP는 동물에게 전신적으로 투여할 수 있으며, 며칠에 걸쳐 급성 투여할 경우 SN에서 상당한 DA 세포 손실을 유발할 수 있다²³. 이 모델은 또한 행동 결함을 초래하지만 대부분 병리학적 측면이 부족합니다. MPTP 사용의 단점은 쥐와 일부 마우스 계통에 독성이 없고 연구자와 동물 관리인 사이에서 신경독성 위험이 있다는 것입니다. 이러한 위험 때문에 실험실에서 MPTP를 사용하기 전에 적절한 작업 절차를 수립하는 것이 절대적으로 필요합니다. 독성 물질은 보다 간단한 도구이지만, 바이러스 벡터가 효율적으로 기능하기 위해서는 올바르게 복제되고 생산되어야 합니다. 플라스미드에는 복제 중에 재조합적으로 손실될 수 있는 바이러스의 패키징에 필요한 두 개의 반복적인 염기서열이 포함되어 있기 때문에 클로닝이 복잡할 수 있습니다. 또한 패키징 제한으로 인해 AAV 또는 Lentivirus에 대해 각각 4.5 또는 11 kbp인 발현 카세트만 허용됩니다. 이 제한은 때때로 여러 벡터 또는 창의적인 편집을 사용하여 우회할 수 있습니다. 미래의 벡터 엔지니어링은 의심할 여지 없이 벡터 게놈의 크기를 확장하는 데 초점을 맞출 것입니다. 바이러스 입자의 생성은 최종 생성물이 순수해야 하지만 높은 역가를 가져야 하기 때문에 어려울 수 있습니다²⁴. 염증 증가 또는 낮은 발현을 방지하기 위해 바이러스 벡터의 각 배치를 사용하기 전에 품질 관리가 필요합니다. 또한, GFP 발현 벡터는 세포 기능 이상과 세포 사멸을 초래할 수 있으므로 용량-반응 곡선을 생성해야 합니다²⁵. 벡터 모델과 마찬가지로 PFF의 품질 관리가 가장 중요합니다. 미리 형성된 섬유소의 생산은 서로 다른 프로토콜이 서로 다른 섬유소 응집체의 균주를 생성하고 다양한 병리학적 패턴을 유발할 수 있기 때문에 오랫동안 큰 논쟁의 대상이 되어 왔습니다^26,27. 제대로 조립되지 않은 원섬유의 주입은 원하는 병리학적 표현형을 생성하지 않습니다. 또한 대부분의 실험실에서 PBS를 대조군으로 사용한다는 점도 언급할 가치가 있는데, 이는 단량체 asyn의 주입이 더 긴 시점에서 여러 세포 내 응집체를 유발할 수 있기 때문입니다²⁸. 이러한 도구를 사용할 때 발생하는 초기 위험을 방지하려면 경험이 풍부한 연구자 또는 회사로부터 바이러스 벡터 또는 PFF를 획득해야 합니다. 이를 통해 초기 고장률을 크게 줄이고 입체주사 주입을 사용하여 경험을 쌓을 수 있는 시간을 제공할 수 있습니다.

입체주사는 매우 다재다능한 방법이기 때문에 이 기술을 더 쉽고 간소화하기 위해 새로운 기술이 지속적으로 개발되고 있습니다. 전동 로봇 사출 팔부터 자동 드릴링, 동물 머리의 3D 재구성에 이르기까지. 이를 통해 향후 더 빠르고 정확한 주입이 가능할 것입니다. 또한 새로운 바이러스 벡터는 유전체 용량을 증가시키는 동시에 확산과 특이성을 개선하기 위해 지속적으로 개발되고 있습니다. 또한 PD뿐만 아니라 일반적인 신경 퇴행에 대한 새로운 통찰력은 이러한 모델을 만들기 위해 주사 가능한 도구를 개선하는 데 도움이 될 것입니다. 최근의 과학적 발견을 통해 PFF 모델을 개발할 수 있게 되었으며, 유전적이든 기계적이든 미래의 발견은 PD 모델을 발전시키고 치료법을 찾는 데 도움이 될 것입니다.

저자는 공개할 내용이 없습니다.

이 연구는 미국 국립보건원(National Institute of Health), 국립노화연구소(National Institute on Aging)의 교내 연구 프로그램(Intramural Research Program)의 일부 지원을 받았습니다. CES는 NS099416에서 지원됩니다. 저자는 NIMH IRP 설치류 행동 코어(ZIC MH002952 및 Yogita Chudasama에 MH002952) 및 NICHD IRP 현미경 및 이미징 코어의 지원에 감사를 표합니다.