남성 마우스의 생식 세포에서 리보태그 면역 강하

여기서, 우리는 리보태그 시스템을 사용하여 성인 남성 마우스 생식세포의 선택집단으로부터 리보솜 및 관련 RNA의 면역침전을 기술한다. 전략적 번식과 신중한 면역 침전은 세균 세포 트랜스라토메에 알리고 돌연변이 표현형의 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하는 깨끗하고 재현 가능한 결과를 초래합니다.

mRNA 풍부에 있는 다름을 정량화하는 것은 세포 생리학에 주어진 유전자 돌연변이의 충격을 이해하는 고전적인 접근입니다. 그러나, 트랜스라토메(번역된 mRNAs의 전체)의 차이를 특성화하는 것은 RNA 조절 또는 결합 단백질의 기능을 이해하려고 할 때 특히 유용한 추가적인 정보 층을 제공한다. 리보솜 프로파일링 및 폴리솜 분석을 포함하여 이를 달성하기 위한 여러 가지 방법이 개발되었습니다. 그러나, 두 방법 모두 중요한 기술적 도전을 수행하고 추가 선별 방법과 결합하지 않는 한 조직 내의 특정 세포 집단에 적용 될 수 없습니다. 대조적으로, RiboTag 방법은 적용 가능한 세포 특정 Cre 드라이버가 유효하다는 것을 제공하는 추가 된 선별 단계 없이 특정 세포 집단에서 리보솜 관련 RNA의 식별을 허용하는 유전 기반, 효율적이고 기술적으로 간단한 대안입니다. 이 방법은 유전 모델, 샘플 수집, 면역 침전 및 다운스트림 RNA 분석을 생성하는 사육으로 구성됩니다. 여기에서, 우리는 남성 불임에 필요한 RNA 결합 단백질을 위한 성인 남성 마우스 세균 세포 돌연변이에서 이 과정을 설명합니다. 배경을 줄이고 출력을 최적화하기 위해 효율적인 식민지 관리 및 올바른 유전 적 배경 및 면역 강박의 생성에 초점을 맞춘 사육에 대한 고려 사항에 특별한주의를 기울입니다. 문제 해결 옵션, 추가 확인 실험 및 잠재적인 다운스트림 응용 프로그램에 대한 논의도 포함되어 있습니다. 제시된 유전 적 도구 및 분자 프로토콜은 돌연변이 표현형의 분자 드라이버에 알리는 것을 목표로 복잡한 조직 또는 비정상적인 mRNA 저장 및 번역을 가진 시스템에서 특정 세포 집단의 리보솜 관련 RNA를 기술하는 강력한 방법을 나타냅니다.

마이크로어레이 또는 RNA 시퀀싱에 의해 조사된 세포 또는 조직의 RNA 풍부도 분석은 돌연변이 표현형의 분자 동인을 이해하는 강력한 도구를 입증했습니다. 그러나, 이러한 상대적으로 불완전한 분석 도구는 세포의 생리학 또는 단백질에, 특히 많은 mRNAs가 신경 및 세균 세포와 같은 번역 이전에 저장되는 시스템에서 통보하지 않을 수 있습니다. 이러한 시스템에서, mRNAs의 집단을 정의하는 것은 적극적으로 단백질, 또는 세포의 translatome로 번역되고, 세포의 실제 생리 상태^1,2의더 나은 지표일 수 있다. 예를 들어, 발달의 다양한 단계에서 의 생식 세포는 나중에 번역을 위해 저장되는 RNA를 전사, 개발³ 또는 신호 큐^4에의해 구동된다. 이 과정은 프로타민을 인코딩하는 mRNAs에 의해 예시되며, 여기서 mRNA 전사체는 단백질이^{1,2,5,6되기}전에 검출 가능한 일수이다. 마찬가지로, 신경 세포는 핵에 RNA를 전사하고 β-actin^7의경우와 같이 축색아래로 수송합니다. 이러한 특수 세포 시스템 이외에, 정상 상태 전사체는 RNA 저장, 리보솜 생물 발생, 또는 mRNA 번역이 영향을 받는 모형에서 유익할 확률이 낮습니다. 다중 다른 요인은 또한 세포의 정상 상태 RNA 풀에 영향을 미칠 수 있는 mRNA 붕괴 및 RNA 결합 단백질의 활성을 포함한다. 이러한 경우에, 활성 번역의 리보솜 관련 RNA 또는 mRNAs를 분석하는 강력한 공구는 생물학으로 관련되는 결과를 산출하기 위하여 확률이 높습니다.

이를 위해 리보솜 관련 또는 활발하게 번역된 메시지를 식별하기 위한 몇 가지 방법이 개발되었습니다. 리보솜 관련 전사체의 스냅샷을 제공하는 폴리솜 프로파일링은 리보솜 소단위 또는 모노-디,폴리-리보솜 복합체^3과관련된 손상되지 않은 RNA를 분리하기 위해 수십 년 동안 사용되어 왔다. 간단히, 수집 된 세포 용해는 선형 자당 그라데이션에 적용되고 고속으로 원심 분리, 리보솜 하위 단위, 그대로 리보솜 및 크기별 폴리좀의 분리의 결과. 전통적으로, 이 기술은 하나 또는 몇 개의 mRNAs를 연구하기 위해 적용되었지만, 최근이 방법은 잠재적 인 번역 조절기의 기능을 해명하기 위해 RNA-seq 연구와 결합되었습니다^8,9 적극적으로 번역 및 비 번역 mRNAs 를 구별하는 강력한 방법은^10,폴리 솜 프로파일링은 시간이 많이 걸리는 방법 (그라데이션 분획 및 초원광)을 필요로할 수 있으며, 좋은 샘플 분석을 필요로 할 수 있습니다. 인구가 어려움을 겪고 있습니다.

트랜스라토메를 검사하는 또 다른 접근법은 리보솜 프로파일링으로, 리보솜과 직접 연관된 전사체의 일부를 식별합니다. 간단히 말해서, 리보솜 관련 RNA 단편은 RNase 보호 분석, 자당 구배를 통해 분리된 개별 리보솜 복합체, 및 RNA-seq 태그로 분리및 변환된 관련 RNA 단편을 통해 생성되며, 깊은 시퀀싱^11에대한 의무가 있다. 리보솜 프로파일링의 주요 이점 중 하나는 번역 시작 사이트의 식별, 리보솜 점유 및 분포의 계산, 리보솜 노점의 식별을 허용하는 격리 시 리보솜의 특정 위치를 결정하는^{기능(12)이다.} 그러나, 이 방법은 장비 요구(그라데이션 분수 및 초원심분리기), 광범위한 트러블슈팅이 필요한 비교적 복잡한 프로토콜, 경험이 없는 사용자가 쉽게 처리하지 못하는 계산 문제를 포함하는 몇 가지 내재된 단점을 가지고^{있다 11.} 중요한 것은, 리보솜 프로파일링은 주로 배양에서 단리된 세포에 적용되고 상당한 물질을 필요로 하며, 생체 내에서 혼합 된 세포 형 조직 또는 분류 된 세포에 적용하기 제한적입니다.

2009년^13년산츠 외가 개발한 포유류 리보태그 방식은 폴리좀 및 리보솜 프로파일링모두에 내재된 여러 가지 문제를 제거한다. 이 방법에서, 리보솜 관련 RNA는 다른 방법^13,14에서필요에 따라 추가적인 절연 기술 및 특수 장비 없이 복잡한 조직에서 세포 형 특이적 트랜스포좀의 조사를 허용하는 특정 세포 유형으로부터 분리될 수 있다. 상기 리보태그 방법의 기초는 60S 리보소좀 소단위 단백질 유전자 Rpl22에대한 변형된 궤적을 운반하는 형질전환 마우스 모델(RiboTag)이다. 이러한궤적(Rpl22-HA)은코딩 영역 내에 C-말단 헤마글루티닌(HA) 태그를 포함하도록 개정된 단말 엑온의 추가 카피를 이어서 플록스형 말단 엑온을 포함한다. 세포 특이적 Cre Recombinase를 발현하는 마우스로 교차할 때, 플록스 드 엑슨은 세포 특이적 방식으로 HA 태그된 RPL22의 발현을 허용하여 제거된다(도1). HA 태그는 그 때 선택된 세포 모형에서 면역 침전제 (IP) 리보솜 및 그들의 관련된 RNA를 이용될 수 있습니다.

이 기술을 개발한 초기 간행물 외에도 다른 여러 실험실에서 RiboTag 모델을 활용했습니다. 마우스 세르톨리 및 Leydig 세포^15,마이크로글리아^16,뉴런^17,18,난모세포^19,배양 세포^20과 같은 다양한 조직이 프로파일화되고 연구되었다. 이 프로토콜은 다양한 조직 유형에 걸쳐 리보솜과 관련 RNA를 성공적으로 분리할 수 있지만, 특히 돌연변이 시스템에 적용될 때 개선이 필요한 영역이 여전히 존재합니다. 특히, 신선한 조직에 대한 일반적인 의존은 분석의 힘을 크게 감소시킬 수 있는 증가된 기술적 변이를 초래한다. 둘째, 앞서 보고된^바와같이비-Cre 재결합 세포 유형으로부터 높은 면역침전 배경이 발생할 때 차별화된 표적의 자신감 있는 식별이 더욱 어려워진다. Sanz 등은 기술의 기본 전제를 설계했지만, 이 원고에서 Snyder 실험실은 이러한 우려를 줄이기 위해 프로토콜의 최적화를 제시하여 방법을 보다 실용적이고 효율적으로 만듭니다.

이 문서의 목적은 세포 특이적 HA 태그 리보솜을 발현하고, 플래시 냉동 샘플에서 이러한 리보솜을 면역 침전시키고, 추가 하류 분석을 위해 관련 RNA를 정화하는 마우스를 사육하는 단계를 설명하는 것입니다. 포유류 남성 생식 세포와 불임 돌연변이가 독특한 도전을 제공함에 따라,이 기술이 다른 세포 시스템에 적응 할 수있는 방법을 조명하기 위한 노력이 이루어졌습니다.

모든 동물 사용 및 취급 관행은 러트거스 대학의 내부 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.

1. 마우스 사육

1. 남성 불임(본원에서 관심 있는 유전자로 지칭되는 제조에서 원고)으로 이어지는 RNA 결합 단백질 돌연변이에 대한 암컷 마우스 동형접합체를 사육하여 Stra8-iCre Eele(B6)에 대한 남성 헤미지구스에 대한 트리오 짝짓기. FVB-Tg (Stra8-iCre)1Reb/LguJ)(Cre+),모든 남성에 두 여성을 페어링으로 사육효율을 증가시킨다.
   참고: 관심있는 돌연변이 유전자 (M)는 M을 위한 암컷 동형접합체가 일반적인 비옥이 있기 때문에, 모성으로 통과되었습니다. 이것은 권장된^21에 따라 남성 생식 세포 Cre (hemizygous)의 친자 전달을 허용하고 원하는 대립 구균 조합으로 자손의 퍼센트를 최적화하는 추가적인 이점이 있습니다. 동형접합체크레스는 생식세포^{독성(22)을}나타내기 때문에, 이종세포 또는 헤미지구스 상태로 유통및 전달되는 것이 바람직하다. 중요한 것은, Cre 발현은 실험 집단까지 Rpl22-HA 말투와 병용되어서는 안 된다. 번식 동물에서 Cre로부터 Rpl22-HA 대립구를 분리하지 못하면 배아 세포 Cre 활성으로 인해 Rpl22-HA를 전 세계적으로 발현하는 자손이 발생하게 된다. 이 문제는 생식 세포에 특정. 추가적으로, Stra8-iCre는 저자의 세포 집단에 특이적이다 관심^22,preleptotenes 및 렙토텐을 포함하여 meiosis에서 아주 초기에 전환하는 세포를 표적으로 합니다. 관심 있는 다른 셀 유형에 특정한 다른 Cre 드라이버를 대신 사용할 수 있습니다. 일반적인 관행은 남성 생식 세포 표현 Cres가 친자 측에 전달되는 지시합니다. 그러나, Stra8-iCre의 모계 전달은 남성 자손에서 유사한 이식 유전자 발현을 초래할 것이다. 선택된 번식 방식에 관계없이 동등한 Cre 발현을 가진 자손을 생성하기 위해 모든 실험 샘플은 동일한 부모 측의 Cre 전송을 통해 생성되어야 합니다(항상 모계 또는 항상 친자).
2. 2.4절에 기재된 바와 같이 남성 새끼를 생성한 유전자형. 하류 사육을 위해 Cre (+/M:Cre+)에대해 M 알레일과 양성을 운반하는 것을 선택하십시오.
3. Rpl22-HA (B6J.129(Cg)-Rpl22^{tm1.1Psam/SjJ)에}대한 수컷 동형접합에 대한 트리오 짝짓기에서 M 알레에 대한 암컷 마우스 동형접합체를 사육하였다.
   참고: Rpl22-HA 배경은 매우 혼합되어 있으므로 변형 성 표현형을 평가할 때 주의를 기울여야 합니다.
4. Rpl22-HA (+/M:Rpl22-HA+)에대한 M 단장 및 양성을 운반하는 사람들을 식별하기 위해 여성 새끼를 생성한 유전자형 (섹션 2.3 참조). 하류 번식을 위해 이 암컷을 선택하십시오.
5. 크로스 +/M:Cre+ 남성 +/M:Rpl22+ 트리오 짝짓기에서 여성. 결과 새끼를 유전자형 (섹션 2.3 및 2.4 참조) Cre + 및 Rpl22+ 및 야생 형 또는 M / M 중 하나 인 남성을 식별합니다.
   참고 : 이 작품은 완전한 남성 불임의 결과로 돌연변이에 초점을 맞추고, 가장 효율적으로 원하는 실험 유전자형을 얻기 위해 번식 계획에서 특별한 고려사항이 촬영되었습니다. 이러한 고려 사항은 다른 실험 모델에서 필요하지 않을 수 있습니다. 전체 사육 도식 및 동반 범례는 번식 고려 사항에 대한 추가 설명에 대한 그림 2를 참조하십시오.

2. 샘플 수집

1. 산후 21일(dpp)에서 수컷 마우스로부터 고환을 수집한다.
   1. _CO2 흡입에 의해 마우스를 희생하고 자궁 경부 탈구를 뒤따릅니다. 두 개의 짧은 (각 2cm) 측면에 각 동물에 복부 절개 (3cm)를 확인, 연결된 측면 절개. 피부와 후피를 당겨 고환을 드러냅니다.
   2. 집게를 사용하여, 부고환과 고환을 드러내기 위하여 바디 구멍의 한쪽에서 epidymal 지방 패드를 당깁니다. tenotomy 가위로, 고환을 절제하고, 부고환, 주변 지방 및 외부 혈관을 잘라내도록 주의하십시오. 깨끗한 1.7 mL 튜브에 그대로 고환을 놓습니다.
   3. 다른 쪽에서 반복하여 두 번째 고환을 첫 번째 튜브에 추가합니다. 이 튜브를 캡을 씌고 즉시 액체 질소에 담그어 플래시 동결하십시오.
      참고: 시료는 사용 전까지 -80°C에서 보존할 수 있습니다.
2. 각 동물(2mm)에 대해 추가적인 테일 팁 샘플을 수집하여 지질질성 확인을 위해.
   1. DNA를 추출하려면 1.7 mL 튜브에 2mm 꼬리 팁에 50 mM NaOH 100 μL을 추가하고 95 °C에서 30 분 동안 끓입니다. 50 mM HCl의 100 μL과 1 M Tris-HCl pH 8.0 및 원심 분리 샘플 을 10,000 x g에서3 분 동안 추가하십시오. 상급물질(게놈 DNA 함유)을 유지하고 추출된 DNA를 다음 의 유질반응에 대한 템플릿으로 사용할 때까지 4°C에서 저장합니다.
3. Rpl22-HA 는 다음 프라이머를 사용하여 산츠 외^13에서 적응한 방법에 따라 Rpl22-HA 지노티핑을 수행한다: 앞으로: 5' GGGAGGCGCTGGATAtG 3'; 역: 5' TTTCCACACAGGAAGTACAC 3'.
   1. 2.2.1단계에서 추출된 DNA의 2 μL, 25 mM dNTP의 0.08 μL, 10 mM 포워드 프라이머의 0.1 μL로 구성된 반응 혼합물을 준비시키고, 0.1 μL 의 10 mM 역프라이머, 2 μL의 중합효소 연쇄 반응(PCR) 완충액(650 mM Tris pH = 8.8, 165 mM (NH₄₎₂SO_4,30 mM MgCl2, 및 0.1% 트웬, 0.2 μL의 Taq 폴리머아제, 및 핵아제 20.
   2. 다음의 열사이클러 조건을 사용한다: 95°C에서 30초 의 프라이머 용융 단계, 64°C에서 30s 어닐링 및 72°C에서 30s 연신, 72°C에서 최종 5분 연신으로 37회 반복하였다.
      참고: 이것은 야생형 시료의 경우 260bp, Rpl22-HA+인 시료의 경우 292bp의 제품 크기를 산출했습니다.
4. 다음 프라이머를 사용하여 Cre genotyping을 수행: 앞으로: 5' GTGCGCTGAACAACACA 3'; 반전: 5' AGGGACACAGCATTGGTC 3'. Cre 프라이머를 이용하여 2.3.2 단계에서 설명한 대로 PCR 반응을준비한다. 다음의 열사이클러 조건을 사용한다: 95°C에서 30초 의 프라이머 용융 단계, 60°C에서 30s 어닐링 및 72°C에서 15s 의 연신을, 72°C에서 최종 5분 연신으로 35회 반복하였다.
5. 관심 있는 유전자의 유전자를 수행 하 고 문제의 유전자에 대 한 표준으로 유전자 형질 티 핑.
   참고 : 저자의 게노티핑 프로토콜은 집중 된 사용자 정의 Taq를사용하므로 다른 사용자는 효소 요구 사항에 맞게 조건을 수정해야 할 수 있습니다. 이 유전자가 번역에 미치는 영향을 더 잘 이해하기 위해, 관심 있는 돌연변이 대문자에 대한 야생형 또는 동형접합효소가 있고 Cre+ 및 Rpl22+가 실험 샘플로 선택되었다. 유전자형 선택은 섹션 1에서 위에서 더 설명합니다.

3. 솔루션 준비

참고: 솔루션 준비 및 모든 후속 단계는 엄격한 조건하에서 이루어져야 합니다.

1. 균질화 완충제(HB)를 준비하려면, 1M Tris pH 7.4, 5 mL의 1 M KCl, 600 μL의 1 M MgCl_2,및 500 μL의 NP-40을 50 mL 튜브에 추가합니다. 디에틸 파이로카보네이트(DEPC)_H2O에 부피(50 mL)를 가져와 모든 성분이 섞일 때까지 섞어 보세요.
   참고 : 최종 농도는 다음과 같습니다 : 50 mM 트리스 pH 7.4, 100 mM KCl, 12 mM MgCl_2,및 1 % NP-40.
2. 높은 염세척완충제(HSWB)를 준비하려면, 1M Tris pH 7.4, 1M KCl의 15 mL, 600 μL의 1 M MgCl_2,및 500 μL의 NP-40을 50 mL 튜브에 2.5 mL을 추가합니다. DEPC H₂O에서 50mL의 부피(50mL)를 가져오고 모든 구성 요소가 통합될 때까지 혼합합니다.
   참고 : 최종 농도는 다음과 같습니다 : 50 mM Tris pH 7.4, 300 mM KCl, 12 mM MgCl₂및 1 % NP-40프로토콜은 여기에서 일시 중지 될 수 있으며, 용액은 사용 될 때까지 실온에서 저장할 수 있습니다.

4. 조직의 준비

1. 모든 샘플 튜브의 무게를 기록하고 액체 질소에서 미리 냉각합니다.
2. 드라이 아이스에 프리쿨 멸균 모르타르, 유봉, 무게 주걱.
3. 플래시 냉동 티슈 샘플을 미리 냉각된 멸균 모르타르와 드라이 아이스에 유봉을 사용하여 미세한 분말로 갈아냅니다.
   1. 플래시 냉동 티슈를 드라이 아이스에 미리 냉각된 박격포에 넣습니다. 유봉을 사용하여 큰 조각으로 티슈를 부드럽게 부수고 티슈가 미세한 분말이 될 때까지 천천히 갈아주세요.
      참고 : 신선한 조직도 사용할 수 있지만 원래 프로토콜^13에따라 플래시 냉동 조직의 사용으로 결과에 유의한 차이가 관찰되지 않습니다. 자세한 내용은 대표 결과 및 토론을 참조하십시오.
   2. 미리 냉각된 주걱을 사용하여 모르타르에서 분말을 긁어 내어 분쇄 된 수집 튜브로 조심스럽게 분쇄합니다. 차가운 모르타르에 수분을 증착하지 않고 조직만 채취되었는지 확인하십시오.
   3. 가능한 한 드라이 아이스를 유지하도록 주의하면서 튜브를 티슈로 계량하십시오. 샘플과 튜브의 무게에서 튜브의 초기 무게를 빼서 조직의 질량을 계산합니다. 용해 버퍼 볼륨의 이후 계산을 위해 이 값을 기록합니다.
      참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있으며 샘플을 사용할 때까지 -80°C에서 저장할 수 있습니다.

5. 샘플의 균질화

1. 용해 완충제 (10 mL HB + 보충제)를 10 μL의 1M 디티오트레이톨 (DTT), 1 프로테아제 억제제 정제, 50 μL의 RNase 억제제 (40,000 단위 / mL), 200 5 mg / mL 사이클로헨시미드의 200 μL, 100 mg / mL 헤파린의 100 mg / mL 의 HB. 모든 성분이 섞일 때까지 섞고 사용할 때까지 얼음을 유지합니다.
   참고: 10 mL HB에서 보충제의 최종 농도 다음과 같이 될 것입니다: 1 mMDTT, 200 U/mL RNase 억제제, 100 μg/mL 사이클로헤시미드, 그리고 1 mg/mL 헤파린. 이 용액은 보충제를 첨가한 후 24시간 이내에 사용해야 하며, 사용 전까지 4°C 또는 얼음 위에 보관할 수 있다.
2. 시료 100 mg당 용해 완충제 1 mL를 추가하십시오. 용해 버퍼를 추가하는 데 사용되는 동일한 파이펫으로, 조심스럽게 결과 조각 세포에 위아래로 용해 파이펫과 혼합. 시료가 더 이상 점성이 없을 때까지 파이펫팅을 계속하십시오(일반적으로 25-30스트로크).
   참고: 용액은 처음에는 매우 점성이 있기 때문에 용액을 혼합하기 위해 큰 직경의 파이펫을 사용해야 합니다. 표준 1000 μL은 일반적으로 100 mg의 조직에 충분합니다.
3. 얼음에 샘플을 10분 동안 놓아 놓습니다. 그런 다음 10,000 x g에서10 분 동안 미리 냉각 된 원심 분리기 (4 °C)에서 샘플을 스핀합니다. 크고 느슨하고 흐린 펠릿은 튜브 바닥에 형성되어야합니다.
4. 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 용해액을 새 튜브로 수집하고 각 샘플에 대한 부피를 기록하십시오. 시료 유출을 방지하려면 시료가 남은 프로토콜 전체에 걸쳐 시원하게 유지되도록 하여 얼음 에 보관하거나 가능하면 4°C에 보관하십시오.

6. 구슬의 평형

1. 5.2 단계에서 용해물의 부피를 사용하여, 적절한 항체 결합 단백질 (이 경우, 단백질 G)에 결합 된 자기 비드의 필요한 부피를 계산합니다. 용해액 1 mL의 경우, 단백질 G 비드 375 μL (30 mg/mL)을 사용하십시오.
   참고 : 공액 구슬의 선택은 사용되는 항 HA 항체에 따라 달라질 수 있습니다. 예를 들어, 토끼 발생 항HA 항체가 선택되면, 단백질 A 비드가 바람직할 것이다.
2. 마그네틱 튜브 랙을 사용하여 비드 용매를 제거하고 구슬에 동일한 부피의 신선한 용해 버퍼를 추가합니다. 4°C에서 5분 회전하여 세척합니다. 벤치탑 튜브 회전기를 사용하여 20rpm으로 설정된 모든 회전 단계를 수행합니다.
3. 튜브를 마그네틱 튜브 랙에 놓고 세척 버퍼를 제거합니다.
4. 6.1-6.3단계를 두 번 더 반복합니다.
5. 평형 구슬에 원래 볼륨에 용해 버퍼를 추가합니다. 4°C또는 얼음에 보관하여 사용할 때까지 보관하십시오.

7. 사전 클리어링 샘플

1. 용해시 1mL마다 50 μL의 평형 구슬을 넣고 용해시료(용해)의 상층부화에 넣고 4°C에서 1시간 동안 회전합니다.
2. 자석 랙에 튜브를 놓고 신선한 튜브에 매해 를 수집합니다. 사용된 구슬을 버리십시오.
3. 매리화에 매 1 mL마다 25 μL의 평형 비드를 추가하고 1 시간 동안 4 °C에서 회전합니다. 남은 평형 단백질 G 비드를 밤새 4 °C에서 저장합니다.
4. 자석 랙에 튜브를 놓고 신선한 튜브에 라세이트 수집합니다. 사용된 구슬을 버리십시오. 클리어된 리세이트에서 50 μL을 유지하여 샘플 입력 제어역할을 합니다. -80 °C에서 보관하십시오.
   참고: 입력 샘플은 조직의 다른 세포 유형과 관련된 RNA를 포함하여 샘플의 전체 RNA 집단을 나타내는 대조군으로서 작용하며, 돌연변이의 함수로서 유전자 발현 변화를 교정하기 위해 다운스트림 분석 중에 사용된다.

8. 항체의 배양

1. 1 mL의 제거 된 용해수분에 대해 항 HA 항체 5 μg를 추가하십시오. 시료 손실을 방지하기 위해 튜브 캡을 실험실 필름으로 밀봉하십시오. 4 °C에서 16-18 h의 시료를 회전시다.
   참고: 항체 배양 시간 및 농도가 최적화되지 않았습니다. 저자는 5 μg를 가진 밤새 배양을 충분하다는 것을 것을을 발견했습니다; 그러나, 더 짧은 배양 또는 더 적은 항체가 적당할 것이고, 또는 더 긴 배양 또는 더 많은 항체가 결합을 향상시킬 수 있다.

9. 구슬의 배양

1. 1 mL의 제거 된 용해수분에 대해 300 μL의 단백질 G 구슬을 추가하십시오. 실험실 필름으로 튜브 캡을 다시 밀봉하고 4 °C에서 2 시간 동안 회전하십시오.

10. 구슬 세척

1. 비드가 IPed 리세이트에서 분리되도록 샘플 튜브를 자석 랙에 놓습니다. 피펫오프 플로우-스루 용해 및 폐기, 비드유지.
2. 800 μL의 HSWB를 구슬에 바르고 4 °C에서 10 분 동안 회전할 수 있습니다. 샘플 튜브를 자석 랙에 놓고 구슬이 세척에서 분리되도록 합니다. 세척을 제거하고 폐기하십시오.
3. 구슬에 HSWB의 또 다른 800 μL을 적용합니다. 샘플을 닫고 4 °C에서 5 분 동안 회전할 수 있습니다. 샘플 튜브를 자석 랙에 놓고 구슬이 세척에서 분리되도록 합니다. 세척을 제거하고 폐기하십시오.
4. 10.3단계를 한 번 더 반복합니다.

11. RNA 추출

1. 샘플 튜브를 자석 랙에 놓고 구슬이 세척에서 분리되도록 합니다. 피펫을 끄고 세척을 폐기하고 RNA 추출을 위한 구슬을 유지합니다. 3.5 μL의 14.2 M 베타 메르카포에탄올(bME)을 구슬에 넣고 15초 동안 소용돌이치면서 섞습니다.
2. 제조업체의 지침에 따라 상업용 RNA 정제 키트를 사용하여 RNA를 추출합니다. RNase 자유 H₂O의 30 μL에서 샘플을 용출.
   참고: 10 μL/샘플 DNase 처리는 대부분의 키트에 대해 선택 사항이지만 강력히 권장됩니다. 이 선택적 정리 단계는 배경을 크게 줄여보다 정확한 최종 농도를 허용합니다. 용해 완충제에 베타 메르카포에탄올(bME)을 함유한 키트를 사용하는 것이 강하게 재구성된다. bME는 RNA 격리 동안 샘플 분해를 방지하기 위해 추가적인 RNase 억제제로서 작용한다.
3. 샘플을 -80°C에서 저장하거나 즉시 분석하십시오.

12. 정량화 및 시료 분석

1. UV-Vis 분광광도계를 사용하여 RNA 농도 및 예비 품질을 정량화합니다.
2. 바이오 분석기를 통해 샘플에서 추출된 RNA의 품질을 분석합니다.
   참고: 생성된 RNA는 북열화 또는 정량적 역전사 PCR(qRT-PCR)과 같은 RNA 시퀀싱 또는 기타 다운스트림 분석에 사용될 수 있습니다.

이전 보고는 Cre^14가결여된 세포에서 비특이적인 면역 침전을 건의했습니다. 이것이 당사의 변형 된 프로토콜의 경우인지 를 결정하기 위해, IP 효율은 Cre 및 Rpl22-HA를 모두 운반하는 동물과 Cre-driver 및 Rpl22-HA,면역 침전 RNA가 모두 없이는 미미해야 한다는 기대와 함께 다른 동물을 모두 운반하는 동물로부터 유래된 샘플에서 결정되었다. 도 3에도시된 바와 같이, 아주 작은 RNA는 IP 배경을 감소시키고 정품 HA 태그리보솜 RNA를 분리하기 위해 이 프로토콜의 효과를 입증하는 Cre 또는 Rpl22-HA가 결여된 샘플로부터 분리된다. 또한 Cre-전용및 Rpl22-HA-전용샘플은 적합한 네거티브 컨트롤을 나타냅니다.

IP의 효율에 현저한 영향을 미치는 시약 공급원에 대한 잠재력을 감안할 때, Cre 및 Rpl22-HA 양성 샘플에서 일련의 항체 및 RNA 절연 프로토콜을 테스트하였다(도4). 이러한 결과는 시약 선택이 IP 효율성에 중대한 영향을 미칠 수 있음을 보여 주므로 시약 선택에 대한 모든 변경은 주의해서 이루어져야 합니다.

RNA 결합 단백질 돌연변이체의 맥락에서 이 프로토콜을 시험하기 위해,야생형-Cre+Rpl22-HA+(야생형) 및 관심 유전자^-/--Cre+Rpl22-HA+(관심 유전자^-/-) 고환은 리보솜 관련 RNA를 분리하는 리보태그 시스템의 효과를 조사하였다(도5). 야생형 입력 및 IP의 RNA 농도가 관심^{유전자-/--입력} 및 IP와 비교되었을 때, 유전자형 간에 유의한 차이는 보이지 않았다. 그러나 두 유전자형 모두, 입력 농도가 IP 농도보다 유의히 높았으며, 이는 입력 샘플에 더 많은 RNA가 있었다는 것을나타낸다(도 5B). 이 결과는 세포에 존재하는 모든 mRNAs가 어떤 주어진 시간에 리보솜과 연관되지 않기 때문에, 특히 RNA가 번역되기 오래 전에 전사될 수 있는 세균 세포의 경우에 예상됩니다.

시퀀싱을 위해 전송된 RNA 샘플의 품질을 확인하기 위해, 샘플을 바이오 분석기에서 실행하였다. RNA 무결성 번호(RN)는 일반적으로 28S 및 18S rRNA 피크의 비율로 계산되어 샘플 간에 비교되었습니다. 총 RNA 풀에서 RIN 값은 10에 가까움을 가지며 RIN은 더 높은 추론된 샘플 무결성 및 품질과 상관관계가 높습니다. IP 샘플은 입력보다 RIN이 낮았지만, RIN은 여전히 허용 가능한 범위 내에 있었으며 샘플 유전자형에 의존하지않았습니다(그림 5C). IPed 샘플에 대한 감소된 RIN 값은 분석된 RNA의 평균 뉴클레오티드 길이의 상대적으로 작은 감소를 감안할 때 매우 미미하지만 RNA 분해의 결과일 가능성이 높습니다. 면역 침전에 필요한 프로토콜 및 온도의 길이를 감안할 때 약간의 저하가 예상된다. 또한 감소된 RIN 및 RNA 길이는 mRNA와 같은 비rRNA 종에 대한 농축의 기능일 수도 있다.

그림 1: 리보태그 방법. 이 방법의 전제는 생물학적으로 간단합니다. 새로운 엑슨 4는 원래 엑슨 4의 Rpl22 궤적 다운스트림의 시퀀스에 삽입됩니다. Cre 드라이버가 있는 경우, 원래 Exon 4의 양쪽에 있는 loxP 사이트가 절단되어 플록스 된 엑슨을 절제합니다. HA 태그된 엑슨 4는 이제 Rpl22 mRNA에 통합되어 CRE를 발현하는 세포에서 HA 태그가 지정된 RPL22를 생성합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 리보태그 마우스에 대한 샘플 사육 방식. 실험동물을 생성하는데 사용되는 사육 방식이 도시되어 있다. 두 갈래의 계획이 활용되었습니다. 1 세대에서, 개종 트리오의 두 개의 병렬 세트가 설립되었다. 한쪽은 관심의 대열 (남성 불모의 이 특정 돌연변이 결과로 모계로 운반)와 hemizygous Cre및 관심의 대틀을 결합하고 다른 한쪽은 Rpl22-HA와 함께 모성으로 다시 운반했습니다. 그런 다음, 2세대에서, 관심의 대립계를 운반하는 첫 번째 페어링에서 수컷과 Cre는 관심의 대립구와 Rpl22-HA를 운반하는 두 번째 페어링의 여성 자손에게 교차된다. 생성된 자손의 유전자형이 결정되고 실험적으로 관련된 동물이 선택됩니다(이 경우 Cre 및 Rpl22-HA 대립유전자를 모두 운반하는 야생형 또는 동형 균 돌연변이). Cre-드라이버를발현하는 세균 세포에 주의하는 것이 중요하며, Cre 및 Rpl22-HA 알레는 실험 생성 될 때까지 함께 번식해서는 안된다. Rpl22-HA 알레르를 번식 세대에서 배아 세포 발현 Cre에 노출하면 생식 세포 Rpl22-HA 절제가 유도될 것이다. 생성된 모든 자손은 Rpl22-HA를 전 세계적으로 발현하여 세포 특이적 리보솜 격리를 방지합니다. 본 명세서에 기재된 시스템에서, 유전자형당 n=4는 다운스트림 분석을 위한 충분한 통계적 힘을 제공했다. 생물학적 복제 수는 각 실험 시스템에 대해 결정되어야 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 네거티브 컨트롤 확인. Cre+ 및 Rpl22-HA+인 샘플은 Cre+ 또는 Rpl22-HA+만 있는 샘플보다 더 높은 RNA 풀다운을 보여줍니다. Cre+와 Rpl22-HA+ 샘플 RNA 풀다운 효능 사이에는 유의한 차이가 없으며, 이는 Cre 또는 Rpl22-HA가 결여된 샘플이 적합한 음성 대조군임을 나타냅니다. "+"는 상응하는 알레일 또는 이식유전자가 이들 샘플에 존재했음을 나타내고 "-"는 그 부재를 나타낸다. IP/입력은 총(입력) RNA에 대한 RNA 면역침전(IP)의 비율을 나타낸다. 나노그램의 농도에서 계산된 값입니다. ** p< 0025를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 시약은 프로토콜의 성공에 영향을 미칩니다. (A)플래시 냉동 조직은 신선한 조직과 유사한 면역 침전 효율을 초래합니다. (B)2개의 상용 항체에 대한 IP 효율을 결정하고, 항체 1 및 항체2(물자 표)로지정하였다. 시험할 때, 항체 1은 음성 (Cre 또는 Rpl22-HA+를 표현하지 않음)과 양성 대조군 (Cre 및 Rpl22-HA +를모두 발현)을 구별 할 수없는 것으로 나타난 항체 2보다 RNA를 당기는 데 더 효율적이다. 개별 생물학적 복제에 대한 IPed 대 입력 RNA의 비율을 나타내는 점. (C)RNA 추출 키트(재료 표)를비교했을 때, 키트 2는 키트 1을 크게 능가했습니다. 두 키트 모두 음성 대조군으로부터 유사한 양의 RNA를 IPed했지만, Kit 2는 양성 샘플로부터 상당히 높은 RNA 수율을 초래하였다. * p < 0.05, ** p < 0.025, *** p < 0.01을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 5: 돌연변이 모델에 대한 방법의 적용. (a) 관심 있는 유전자의 유전자를 이용한 서양 블로팅을 통한 관심 유전자형 확인의 샘플 유전자는 관심 있는 단백질의 유전자에 대하여 맞춤형 사내 항체를 사용하여 ^-/- (M/M)남성이 관련 단백질을 생산하지 못하는 유전자를 입증한다. GAPDH는 로딩 제어로 나타났다. (B)와일드 타입 및 돌연변이 샘플에 대한 페어링 된 입력 및 IPed 샘플에서 그래픽 바이오 분석기 출력. (C) 샘플 유형 및 유전자형별로 RNA 무결성 수치(RIN)를비교합니다. (D)RNA 종의 평균 뉴클레오티드 길이는 시료 유형 및 유전자형별로 바이오분석기별로 분석하였다. * p < 0.05, ** p < 0.025, *** p < 0.01, N.S. 유의하지 않음을 나타냅니다. N = 유전자형당 4. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: Cre 드라이버 확인의 예. 생식 세포 발달 초기에 번역된 유전자의 정량화(Stra8) 및 2개의 유전자가 생식 세포 발달에서 늦게 번역된(Tnp1 및 Prm1)RPL22-HA로부터 면역침전된 RNA의 qRT-PCR에 의해 분석된 두 개의 상이한 생식 세포 CreS, Stra8-iCre(생식 세포 발달 초기에 발현) 및 Hspa-Cre(나중에 발현된 생식 세포 개발) 및 Hspa-Cre(나중에 발현된 발현). 여기서, Stra8의 HA-IP는 면역침전의 세포 특이성을 입증하는 후기 생식 세포 Cre 드라이버가 아니라 초기 생식 세포 Cre 드라이버로 달성된다. 대조적으로, 후기 생식 세포에서 번역된 전사체의 HA-IP는 Stra8-iCre 및 Hspa2-Cre모두에 의해 달성된다. 이것은 Stra8-iCre를 표현하는 세포가 그들의 발달의 전체를 통해 HA 태그된 RPL22를 생성하는 동안 Hspa2-Cre를 표현하는 세포는 그들의 발달의 후반 부분 도중만 이렇게 할 것이기 때문에 예상됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

특정 세포 모형의 translatome를 이해하는 것은 정상 또는 돌연변이 상태에서 세포의 생리학을 보다 정확하게 이해하기를 위해 귀중합니다. 특별한 이득은 번역이 전사에서 아주 멀리 일어나는 신경 조직에서와 같은 전사에서 결합되지 않는 것을, 또는 전사가 번역의 앞에 오래 생기는 세균 세포에서 보입니다. 트랜스라토메 분석의 다른 방법에 비해, RiboTag 시스템의 가장 큰 장점은 Cre 재조합 시스템의 사용에서 온다. 이를 통해 관련 Cre 드라이버가 있는 셀 집단을 자유롭게 타겟팅할 수 있습니다. 둘째, 본 명세서에 기재된 리보태그 IP는 폴리섬 또는 리보솜 프로파일링보다 효과적이고 기술적으로 훨씬 덜 도전적이고 시간이 많이 소요된다. 마지막으로, 리보태그 IP는 벤치탑에서 쉽게 수행할 수 있습니다.

이 프로토콜에는 여러 가지 중요한 단계가 있습니다. 그 중 최고는 연구를위한 리보 태그 마우스 라인의 설립과 실험 동물의 생성이다. 모든 유전 모형에 관해서는, 마우스 식민지 내의 개별의 주의 깊은 추적 뿐 아니라 주의깊은 유전형 분석 프로토콜이 적용되어야 합니다. 산츠 외에 따라 PCR 유전자형 질태는 야생형 대립유전자(260 bp)와 돌연변이체(290 bp)^13을구별하기 위해 야생형 엑소 4의 loxP 부위 5'를 표적화하는 프라이머를 포함해야 한다. 생식 세포 모델에서 RiboTag 분석의 경우 매우 구체적인 사육 요구 사항을 준수해야합니다. 첫째, 불임을 초래하는 돌연변이의 경우, 사려 깊은 번식 전략은 중간 및 실험 세대에서 원하는 유전자형을 가진 자손의 수를 최적화하는 방법을 포함해야합니다. 둘째, 세균 세포 특이적 Cres의경우, Cre 독성에 대한 생식 세포의 민감도를 감안할 때 Cre-zygosity에 대해 주의를 기울여야 한다. 세균 세포에서, Cre 단백질의 상부는 해로운 효력^22를가질 수 있고, 번식 계획에서 Cre/Cre 동물의 사용을 금지합니다. 마지막으로, 세균 세포 Cres를 사용하는 경우, 중간 세대의 배아 세포에서 Cre 발현으로서 최종 생성까지 Cre로부터 리보태그 대립유전자를 분리하는 것이 중요하며, 이는 전 세계적으로 Rpl22-HA를 발현하는 자손을 초래할 것이다.

셀 시스템에 관계없이 Cre 발현 및 특이성의 견고성을 검증하기 위해 여러 가지 권장 컨트롤이 가능합니다. Cre의 적절한 발현 및 Rpl22-HA의 예상 절제는 여러 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 먼저, 실험동물로부터 분리된 조직은 면역조직화학 또는^{면역형광(15)을}이용하여 HA에 대해 염색될 수 있다. 이 방법은 표적 세포 유형에서 번역된 mRNA에 대한 사전 지식이 필요하지 않다는 점에서 최적입니다. 그림 6에서설명되는 두 번째 메서드는 대상 셀 유형에서 번역으로 조절된 메시지에 대한 몇 가지 지식이 필요합니다. 이 방법에서, 공지된 번역 조절 mRNA에 대한 농축은 입력 RNA 대 IPed의 정량적 PCR을 사용하여 선택된 Cre-드라이버로부터확인할 수 있다. 마찬가지로, 강력한 Rpl22-HA 발현은 Cre+/Rpl22+ 샘플(양성 대조군)과 효과적인 네거티브 컨트롤역할을 하는 Cre+/Rpl22+ 샘플(양성 대조군)을 비교하여 확인할 수 있습니다(그림 3참조). 이러한 비교는 qRT-PCR 또는 다른 정량적 방법에 의해 평가된 공지된 번역학적 조절 mRNA에 대한 총 IPed RNA 또는 농축에 의해 수행될 수 있다.

프로토콜의 실행에 있는 일반적인 문제는 RNA 수율이 예기치 않게 낮거나 높을 때만 명백해지는 경향이 있습니다. 이러한 실패의 가장 흔한 원인은 개인의 잘못된 지질 질에서 발생합니다. 예기치 않은 RNA 수율의 경우 모든 샘플의 유전자형을 확인하기 위해 수집된 샘플에서 추가 조직을 유지하는 것이 좋습니다. 일단 확인되면, RNase 오염 또는 견본 분해의 가능성을 포함하여 그밖 가능성을 고려되어야 합니다. 실험실 내RNase 프리 존의 신중한 시료 보관 및 취급 및 유지 관리는 이러한 문제를 크게 줄이거나 제거할 수 있습니다. RNA 격리 문제는 이 프로토콜의 또 다른 잠재적인 문제이지만 상용 키트를 사용하면 RNase가 없는 상태로 유지되고 만료된 솔루션이 포함되어 있지 않은지 확인하기 위해 주의를 기울여야 하지만 이 문제를 크게 줄일 수 있습니다. 마지막으로, 모든 항체 기반 절차와 마찬가지로, 로트, 저장 조건, 농도 또는 심지어 배송의 변이는 항체의 품질과 풀다운의 후속 성공에 부정적인 영향을 미칠 가능성이 있다. 그 결과, 신중하고 반복적인 테스트를 거쳐 가장 일관되고 효율적인 항체를 선택했습니다.

이 프로토콜에는 성공 가능성을 크게 향상시키는 다른 게시된 RiboTag 프로토콜에 대한 두 가지 주요 수정 사항이 포함되어 있습니다. 하나는 플래시 냉동 조직을 사용하여 로트, 기술자 또는 기술 실행 변화와 관련된 문제를 완화할 수 있는 기능입니다. 샘플을 수집하고 저장하여 모든 샘플에서 HA-리보솜을 한 번에 분리하여 주요 변동 원천이 될 수 있는 것을 낮출 수 있습니다. 둘째, 사전 클리어 단계의 추가는 RiboTag 시스템의 다른 사용자에 의해 보고된 배경의 종류를 실질적으로 감소시킨다. 최근, Sanz et al.에 의한 프로토콜 보고서는비-Cre-구동세포(14)로부터리보솜관련 전사체의 풍부성으로 인한 높은 배경의 존재를 나타낸다. 당사의 프로토콜은 Cre 네거티브 IP 샘플에서 RNA의 존재를 효과적으로 제거하는 사전 클리어링 단계를 포함하여 이 문제를 해결합니다.

모든 시스템과 마찬가지로 RiboTag 시스템의 고유한 한계를 염두에 두어야 합니다. 특성이 지정되지 않은 Cre 드라이버를 사용하는 경우 실험 샘플 생산 전에 발현 분석을 수행해야 합니다. 번역의 관점에서,이 방법의 몇 가지 뉘앙스에 주목해야한다. 첫째, RiboTag는 번역할 태세의 mRNAs와 적극적으로 번역하는 mRNAs 간의 차별화를 허용하지 않습니다. 따라서, 현재 의 RiboTag 기반 방법은 개별 mRNA의 함수로서 번역 효율의 정량화를 허용하지 않는다. 번역 효율이 관심있는 경우, RiboTag 방법이 폴리좀 프로파일링과 같은 다른 트랜스라토메 분석 도구와 결합되는 경우 세포별 기준으로 측정될 수 있습니다. 둘째, 개별 또는 유전자형 의존적 분산에서 비롯된 총 RNA 풍부도 변화를 고려하는 것이 근본적이다. 이러한 이유로 입력 RNA의 신중한 격리가 면역 침전을 동반하고 각 에서 파생된 샘플은 모든 다운스트림 분석을 통해 쌍을 이루고 있습니다. 마지막으로, RiboTag 기반 분석에 관해서는 리보솜과의 연관성이 반드시 번역이 일어나고 있음을 증명하는 것은 아니라는 것을 기억해야합니다. 관심 대상의 번역 규정을 확인하기 위해 이차 분석 방법을 수행해야 합니다.

이 프로토콜은 RiboTag 모델을 사용하여 남성 마우스의 생식 세포로부터 리보솜 관련 RNA의 분리를 설명합니다. 마우스 사육 및 샘플 수집을 고려하지 않는 이 프로토콜은 첫날 3시간, 오후에 가장 잘 수행되고, 하룻밤 인큐베이션을 하고, 그 다음날 아침에 5시간의 작업이 뒤따르는 이틀이 걸립니다. 스톡 솔루션 (HB 및 HSWB)과 조직 분쇄의 준비는 사전에 수행되는 것이 좋습니다. 프로토콜의 전반적인 성공은 올바른 지질 분석과 엄격하게 RNase없는 조건에 의존합니다. 특정 세포 모형의 translatome를 검토하는 기능은 무수한 세포 모형 및 돌연변이 배경에 있는 전사, 번역 및 단백질족 사이 관계를 더 잘 이해하는 미래 연구 결과를 허용할 것입니다.

저자는 공개 할 것이 없다.

이 작품은 NIH 보조금 NICHD R00HD083521EMS및 EMS에 러트 거스 대학에서 내부 지원에 의해 지원되었다.