난소암 조직에서 미토콘드리아의 준비 및 정량적 프로테오믹스 분석을 위한 난소 조직 제어

이 문서는 인간 난소 암 조직에서 미토콘드리아를 분리하고 정량적 프로테오믹스 분석을 위한 난소 조직을 통제하기 위해 밀도 구배 원심분리와 함께 차동 속도 원심분리의 프로토콜을 제시합니다. 인간 난소암 미토콘드리아 프로테오메의 고품질 미토콘드리아 시료 및 높은 처리량 및 높은 재현성 정량적 프로테오믹스 분석의 결과.

난소암은 사망률이 높지만 분자 메커니즘이 불분명한 일반적인 부인과 암입니다. 대부분의 난소암은 치료를 심각하게 방해하는 고급 단계에서 진단됩니다. 미토콘드리아 변화는 인간 난소암의 특징이며, 미토콘드리아는 에너지 대사, 세포 신호 및 산화 스트레스의 중심입니다. 난소암의 미토콘드리아 프로테오메의 변화에 대한 심층적인 통찰력은 난소암의 분자 메커니즘에 대한 심층적인 이해와 효과적이고 신뢰할 수 있는 바이오마커 및 치료 표적의 발견에 도움이 될 것입니다. 인간 난소암을 분석하고 미토콘드리아 프로테옴을 조절하기 위해 상대적 및 절대정량화(iTRAQ) 정량적 프로테오믹스를 위한 이소바릭 태그와 결합된 효과적인 미토콘드리아 제제 방법이 여기에 제시되고, 차동 속도 원심분리, 밀도 구배 원심분리, 미토콘드리아 시료의 품질 평가, 트립신을 함유한 단백질 소화, iTRAQ 라벨링, 강력한 양이온 교환 분획(SCX), 액체 크로마토그래피(LC), 탠덤 질량 분석법(MS/ MS), 데이터베이스 분석, 미토콘드리아 단백질의 정량분석. 많은 단백질은 인간 난소암 미토콘드리아 프로테오메의 커버리지를 최대화하고 인간 난소암에서 차별적으로 발현된 미토콘드리아 단백질 프로파일을 달성하기 위해 성공적으로 확인되었습니다.

난소암은 사망률이 높지만 분자기전이 불분명한 흔한^{부인과암1,2.} 난소암의 대부분은 심각하게 치료를 방해하는 고급 단계에서 진단됩니다. 미토콘드리아 변화는 인간 난소암의 특징이며, 미토콘드리아는 에너지 대사, 세포 신호, 산화 스트레스^{3, 4,5,6,7의}중심이다. 난소암의 미토콘드리아 프로테오메의 변화에 대한 심층적인 통찰력은 난소암의 분자 메커니즘에 대한 심층적인 이해와 효과적이고 신뢰할 수 있는 바이오마커 및 치료 표적의 발견에 도움이 될 것입니다. 미토콘드리아 대사가 암 치료의 표적으로 제안되고 인식되고 있으며, 항미토콘드리아 요법은 궁극적으로 암의 재발 및 전이를 방지하는 데 매우 유익할 수 있다^8. 개별 적인 대사 프로파일링은 또한 이미 암 계층화 및 예측 전략^9,10에유용한 도구로 실행되고 있다.

이 연구의 장기적인 목표는 난소암과 대조군 난소 조직 사이의 미토콘드리아 프로테오메 변경을 명확히 하기 위한 난소암을 연구하기 위한 정량적 미토콘드리아 프로테오믹스 방법을 개발하고 사용하는 것입니다. 및 그들의 분자 네트워크 변화는 체계적인 다중 omics 각도^11,12,이는 난소암의 분자 기전의 설명을 위한 미토콘드리아 표적 분자^{바이오마커(13)의} 발견을 초래할 것이다, 난소암 환자의 맞춤형 치료. 상대적 및 절대 정량화(iTRAQ) 라벨링3,^4에 대한 등음표는 미토콘드리아 단백질 변화를 정량화하는 효과적인 방법이다. 인간 난소암및 대조군 난소조직에서 고품질 미토콘드리아 시료의 제조는 미토콘드리아 프로테옴의 iTRAQ 정량 분석을 위한^{전제조건3.} iTRAQ 정량 단백질과 결합된 미토콘드리아 제제는 미토콘드리아 단백질레고메 의 확립을 포함한 인간 난소암 미토콘드리아 프로테오메에 대한 장기 연구 프로그램에서 성공적으로 사용되어 왔으며, 미토콘드리아 단백질레오스 기준 맵^3,미토콘드리아 프로파일의 분석은 미토콘드리아 프로파일^4,14 및 포스포릴을 포함한 사후 번역 경로의 중요한 발견을 포함하고 있다. 인간 난소암의 네트워크 변화^5,에너지 대사^4,지질 대사 및 미토파지 경로 시스템^3.

이전 연구는 밀도 구배 원심분리와 함께 차동 속도 원심분리가 인간 난소암으로부터 미토콘드리아를 분리및 정화하고 난소 조직을 조절하는 효과적인 방법인 것을^{발견했으며 3,4,5,14.} 강력한 양이온 교환(SCX)-액체 크로마토그래피(LC)-탠덤 질량 분석법(MS/MS)과 결합된 iTRAQ 라벨링은 준비된 미토콘드리아 샘플의 단백질을 검출, 식별 및 정량화하는 핵심 기술입니다.

여기서, iTRAQ 정량적 프로테오믹스와 결합된 미토콘드리아 제제에 대한 상세한 프로토콜이 기재되어 있다. 이들은 인간 난소암 조직 미토콘드리아 프로테옴의 분석에 성공적으로 사용되어 왔다. 프로토콜은 샘플의 준비를 포함, 차동 속도 원심분리, 밀도 그라데이션 원심 분리, 미토콘드리아 샘플의 품질 평가, 트립신과 단백질 소화, iTRAQ 라벨링, SCX 분획, LC, MS / MS, 데이터베이스 검색, 및 미토콘드리아 단백질의 정량 분석. 더욱이, 이 프로토콜은 다른 인간 조직 미토콘드리아 프로테옴을 쉽게 분석하기 위해 번역한다.

난소암 조직(n=7) 및 정상 대조군 난소 조직(n=11)을 포함하는 난소 조직 샘플을 이 프로토콜에 사용하였다. 본 의정서^3,4,5는 중국 중남대학교 시안야병원 의료윤리위원회의 승인을 받았다.

1. 인간 난소암 조직에서 미토콘드리아의 준비

1. 210 mM 만미톨을 혼합하여 미토콘드리아 절연 완충액의 250 mL를 준비하고, 70 mM 수크로오스, 100 mM 염화칼륨 (KCl), 50 mM 트리스-HCl, 1 mM 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 0.1 mM 에틸렌 글리콜 비스 (2-아미노 에테르) 테트라 아세트산 (EGTA), 1 mMM 페닐메탄설포닐 불소(PMSF) 프로테아제 억제제, 2 mM 나트륨 오르토바나데이트(V), 및 0.2% 소 혈청 알부민(BSA), pH 7.4.
2. 깨끗한 유리 접시에 난소암 조직 1.5 g을 놓습니다.
3. 미리 냉각된 미토콘드리아 분리 완충제 2 mL를 추가하여 조직 표면에서 혈액을 3x 가볍게 세척합니다.
4. 깨끗한 안과 가위를 사용하여 조직을 약 1mm³ 개로 완전히 다진 다음 다진 조직을 50mL 원심 분리튜브로 옮김하십시오.
5. 0.2 mg/mL 의 나가스를 함유한 미토콘드리아 절연 완충액 13.5 mL을 추가한 다음 전기 균질화를 사용하여 다진 조직(2분, 4°C)을 균질화합니다(사용 스케일 2, 10 s 6x, 간격 10초).
6. 또 다른 추가 3 미토 콘 드리 아 절연 버퍼 조직 균질 화 하 고 파이펫팅에 의해 그들을 잘 혼합.
7. 제조 된 조직 균질화 (1,300 x g,10 분, 4 °C)를 원심 분리기. 원유 핵 분획(즉, 펠릿)을 제거하고 상류를 유지합니다.
8. 최근 상월체 (10,000 x g,10 분, 4 °C)를 지내다. 미세한 물질(즉, 상류체)을 제거하고 펠릿을 유지합니다.
9. 미토콘드리아 절연 버퍼 2 mL를 추가하고 라이트 파이펫팅으로 펠릿을 잘 다시 놓습니다.
10. 펠릿 현탁액 (7,000 x g,10 분, 4 °C)을 원심 분리기. 상급을 버리고 조미토콘드리아 (즉, 펠릿)를 유지하십시오.
11. 추출된 조미토콘드리아를 재중단시키기 위해 25% 밀도 그라데이션 배지(즉, Nycodenz)의 12 mL를 추가합니다.
12. 튜브를 34mL 의 5 mL, 30% 8 mL, 25%의 12 mL(1.11단계에서 의 한 미토콘드리아 포함), 8 mL 의 23%, 20% 밀도 그라데이션 배지의 3 mL, 원심분리기(52,000 x g,90°C)로 아래에서 위로 튜브를 채우면서 불연속 밀도 구배를 만든다.
13. 길고 무딘 주사기를 사용하여 25% 및 30% 밀도 그라데이션 배지 사이의 계면에서 정제된 미토콘드리아를 깨끗한 튜브로 수집합니다.
14. 수집된 미토콘드리아에 미토콘드리아 분리 완충액을 추가하여 3배 부피로 희석합니다. 원심분리기 (15,000 x g,20 분, 4 °C)를 폐기한다.
15. 미토콘드리아 절연 완충액 2 mL을 추가하여 펠렛및 원심분리기(15,000 x g,20분, 4°C)를 재중단시스터. 상급을 버리고 펠릿을 유지하십시오.
16. 최종 펠릿(즉, 정제된 미토콘드리아)을 수집하고 -20°C에 보관한다.
    참고: 양적 프로테오믹스 분석을 위해 난소암 조직에서 정제된 모든 미토콘드리아를 미토콘드리아 샘플로 결합합니다.

2. 인간 통제 난소 조직에서 미토콘드리아의 준비

1. 1.1단계에서 기재된 바와 같이 미토콘드리아 격리 완충액의 250 mL를 준비한다.
2. 정상 대조군 난소 조직 ~1.5 g을 깨끗한 유리 접시에 놓습니다.
3. 미리 냉각된 미토콘드리아 분리 완충액 2 mL를 추가하여 조직 표면에서 혈액을 3x 가볍게 씻습니다.
4. 깨끗한 안과 가위를 사용하여 조직을 약 1mm³ 개로 완전히 다진 다음 다진 조직을 50mL 원심 분리튜브로 옮김하십시오.
5. 다진 대조군 조직에 인산완충식염수(PBS)에 0.05% 트립신/20 mM EDTA 8mL을 추가하고, 조직과 세포를 용해시키고 미토콘드리아를 방출하는 데 도움이 되는 다이제스트(30분, 실온)를 첨가합니다. 그런 다음 원심 분리기 (200 x g,5 분). 상급체를 버리고 조직과 세포를 유지하십시오.
6. 0.2 mg/mL 의 나가스를 함유한 미토콘드리아 절연 완충액 13.5 mL을 추가한 다음 전기 균질화를 사용하여 다진 조직(2분, 4°C)을 균질화합니다(사용 스케일 2, 10 s 6x, 간격 10초).
7. 또 다른 추가 3 미토 콘 드리 아 절연 버퍼 조직 균질 화 하 고 파이펫팅에 의해 그들을 잘 혼합.
8. 준비된 조직 균질화 (1,300 x g,10 분, 4 ° C)를 원심 분리. 원유 핵 분획(즉, 펠릿)을 제거하고 상류를 유지합니다.
9. 최근 상류분 (10,000 x g,10 분, 4 ° C). 미세한 물질(즉, 상류체)을 제거하고 펠릿을 유지합니다.
10. 미토콘드리아 절연 버퍼 2mL를 추가하여 라이트 파이펫팅으로 펠릿을 잘 재중단시면됩니다.
11. 펠릿 현탁액 (7,000 x g,10 분, 4 °C)을 원심 분리기. 상급을 버리고 조미토콘드리아 (즉, 펠릿)를 유지하십시오.
12. 추출된 원유 미토콘드리아를 다시 중단시키기 위해 25% 밀도 그라데이션 배지의 12 mL를 추가합니다.
13. 튜브를 아래에서 위로 8mL 38%, 34% 5mL, 25%의 8mL, 25%의 12mL(단계 2.12에서 조미토콘드리아 포함), 8 mL 23%, 20% 밀도 구배 배지 및 3 mL의 20% 밀도 구배 배지, 및 원심 분리(52,00°C)로 튜브를 채우하여 불연속 밀도 구배를 만듭니다.
14. 길고 무딘 주사기를 사용하여 25 %와 30 % 사이의 인터페이스에서 34 %와 38 %의 인터페이스에서 깨끗한 튜브로 정제 된 미토콘드리아를 수집합니다.
15. 수집된 미토콘드리아에 미토콘드리아 분리 완충액을 추가하여 3배 부피로 희석합니다. 원심분리기 (15,000 x g,20 분, 4 °C)를 폐기한다.
16. 미토콘드리아 절연 완충액 2 mL을 추가하여 펠렛을 재중단하고 원심 분리기 (15,000 x g,20 분, 4 °C). 상급을 버리고 펠릿을 유지하십시오.
17. 최종 펠릿(즉, 정제된 미토콘드리아)을 수집하고 -20°C에 보관한다.
    참고 : 정량적 인 프로테오믹스 분석을위한 미토콘드리아 샘플로 제어 난소 조직에서 모든 정제 된 미토콘드리아를 결합합니다.

3. 정제 된 조직 미토콘드리아 샘플의 품질 검증

1. 정제된 미토콘드리아 샘플(즉, 1.16단계에서 난소암 조직에서 펠릿을 취하고 2.17단계에서 난소 조직을 대조군)을 복용하여 전자현미경(EM)으로 검증한다.
   참고 : 상세 한 프로토콜은 이전에^{설명 된 15,16}.
2. 미토콘드리아 단백질 추출 완충액을 8 M 우레아, 2 M 티우레아, 40 mM 트리스, 1 mM EDTA, 130 mM 디티오트레이톨(DTT) 및 4%(3-cholamidopropyl) 3-(3-cholamidopropyl) 디메틸람모니오(CHAP)-1-프로판술포포네이트(CHAP)를 혼합하여 준비한다. pH를 8.52로 조정합니다.
3. 정제된 미토콘드리아 시료(즉, 1.16단계에서 난소암 조직으로부터의 펠릿과 2.17단계에서 난소 조직을 대조군)을 취하고 미토콘드리아 단백질 추출 완충액(미토콘드리아 시료를 단백질 추출 완충액에 미토콘드리아 샘플, 1:5)을 첨가하여 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 샘플을 액체 질소3x로 동결시키고 실온에서 2시간 동안 보관합니다.
4. 12,000 x g,30 분, 4 °C에서 원심 분리기를, 상판 (즉, 추출 된 미토콘드리아 단백질 샘플)을 수집하고, 비신코닌산 (BCA) 단백질 분석 키트로 단백질 함량을 측정합니다.
5. 9.08 g의 Tris 와 40 mL의 ddH₂O를 혼합하고 HCl을 사용하여 pH를 8.8로 조정하고 ddH₂O를 최종 부피 50 mL에 추가하여 1.5 ML 트리스-HCl(pH 8.8)의 50 mL을 준비합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
6. 6.06 g의 트리스와 40 mL의 ddH₂O를 혼합하고 HCl을 사용하여 pH를 6.8로 조정하고 ddH₂O를 최종 부피 50 mL에 추가하여 1 M Tris-HCl(pH 6.8)의 50 mL을 준비합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
7. 아크릴아미드 29g, 비스 아크릴아미드 1g, ddH_2O80 mL를 혼합하고 ddH₂O를 최종 부피에 100 mL를 추가하여 30% 아크릴아미드-비스 용액 100 mL을 준비합니다. 4 °C에서 갈색 병에 저장합니다.
8. 글리신 29g, 트리스 58g, 도데실 황산나트륨(SDS) 3.7g, ddH_2O800 mL를 혼합하여 10x 트리스 글리신 전기 영동 완충액 1,000 mL을 준비한 다음 ddH₂O를 최종 부피에 1,000 mL의 최종 부피에 추가합니다.
9. 글리세린 2 mL, 브로모페놀 블루 0.02 g, SDS 0.4 g, 트리스-HCl pH 6.8, 및 7 mL의 ddH₂O를 10 mL의 최종 부피에 추가하여 10 mL의 로딩 버퍼를 10 mL을 준비합니다.
10. ddH₂O의 4 mL을 혼합하여 10 % 나트륨 도데실 설페이트 폴리 아크릴아미드 젤 전기 영동 (SDS-PAGE) 해결 젤의 10 mL을 준비, 3.3 mL 의 30% 아크릴아미드-비스 용액, 2.5 mL 의 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8), 0.1 mL 의 10% SDS, 0.1 mL 의 10% 황황산염, 그리고 0.004 mL의 테트라메틸레테틸렌디아민(TEMED). SDS-PAGE 분해 젤 용액을 유리 판 사이의 플레이트에 붓고 빗 바닥의 레벨에 넣습니다. 상단에 이소프로필 알코올 2 mL를 추가합니다. 30분 동안 그대로 둡니다.
11. 이소프로필 알코올을 제거하고 ddH₂O 3x로 상단을 세척합니다. ddH₂O의 4.1 mL, 30% 아실아미드-비스 용액의 1.0 mL, 0.75 mL의 1 M Tris-HCl (pH 6.8), 0.06 mL의 10% SDS, 0.06 mL의 10% 퍼설페이트 암모늄, 00m0을 함유하는 5% 농도 겔 용액을 붓습니다. 즉시 농축 젤 용액에 빗을 삽입하고 30 분 동안 방치 한 다음 빗을 꺼내십시오.
12. ddH₂O의 900 mL로 10x 트리스 글리신 전기 영동 완충액 100 mL을 희석하여 1x 트리스 글리신 전기 영동 완충제를 준비하고 전기 영동 탱크에 부어 넣습니다.
13. 난소암에서 미토콘드리아 단백질 30 μg를 혼합하고 3.4 단계에서 난소 조직을 로딩 버퍼로 조절하여 최종 부피에 도달하여 20 μL. 혼합물을 5 분 동안 끓인 다음 100 V의 일정한 전압을 사용하여 10 % SDS-PAGE 해결 젤로 분리하십시오. 브롬페놀 블루가 바닥에 도달하면 전기 동극을 중지하십시오.
14. 10x 트리스 글리신 전기 영동 완충제 150 mL, ddH₂O 1,050 mL 및 메탄올 300 mL을 혼합하여 1.5 L의 전기 영동 전달 버퍼를 준비합니다.
15. PVDF 멤브레인을 100% 메탄올에 10분 동안 담그고 전기 동백 전달 버퍼에서 적어도 5분 동안 담그십시오.
16. 단백질을 함유한 SDS-PAGE 젤을 꺼내 전기 영동 전달 완충제에 10분 동안 담급니다.
17. 흰색 판에 젖은 스폰지, 습식 필터 용지 3 장, PVDF 멤브레인, 단백질이있는 SDS-PAGE 젤, 습식 필터 용지 2 장 및 젖은 스폰지를 아래에서 위로 배치하여 전사 카세트를 만듭니다. 거품을 피하십시오.
18. 전사 카세트를 전기 동환 탱크에 넣고 전기 동환 전달 버퍼에 부은 다음 일정한 200 mA 전류에서 2 시간 동안 전달하십시오.
19. 트리스 12.114g, NaCl 29.22g, ddH_2O를500 mL의 최종 부피에 추가하여 10x Tris 버퍼링 식염수(TBS) 스톡 솔루션을 준비합니다. 10x TBS 200 mL, 트웬-20 mL, ddH₂O 1,798 mL을 혼합하여 1x TBST 의 2L를 준비하여 100 mL의 TBST와 5 g의 BSA를 혼합하여 차단 용액100 mL을 준비합니다.
20. 이송 후 PVDF 멤브레인을 꺼내 TBST에서 5 분 동안 가볍게 씻은 다음 실온에서 1 시간 동안 차단 용액으로 차단하십시오.
21. PVDF 멤브레인(4°C 하룻밤)을 라민 B(세포 핵; 염소 항인간 항체 1: 1,000 차단 용액), 플로틸린-1(사이토막; 토끼 항인간)을 포함한 상이한 세포소기관에 특이적인 다른 원발성 항체와 배양 항체 1:500 차단 액액), COX4I1 (미토콘드리아, 토끼 항인간 1:1,000 차단 용액), GM130 (골지 장치; 마우스 항인간 항체 1:1,000 차단 액), 카랄라제 (퍼록시솜; 토끼 항체 1:1,000 차단 용액), 및 카테신 B (리소좀; 토끼 항 인간 항체 1:1,000 차단 용액). TBST에서 5분 3x로 가볍게 씻으소서.
22. 상응하는 이차 항체(토끼 항염소, 염소 항토끼, 또는 염소 항마우스)로 실온에서 1시간 동안 PVDF 멤브레인을 배양한다. TBST에서 5분 3x로 가볍게 씻으소서. 전기 화학 발광 (ECL)으로 시각화하십시오.

4. iTRAQ-SCX-LC-MS/MS 분석

참고: 섹션 4에 대한 자세한 절차는 iTRAQ지침(재료 표)을참조하십시오.

1. 정제된 미토콘드리아 샘플(즉, 1.16단계에서 난소암 조직으로부터의 펠릿및 2.17단계로부터난소 조직을 대조하는) 정제된 미토콘드리아 샘플에 SDT 완충액(4% SDS, 100 mM Tris-HCl pH 7.6, 및 100 mM DTT)을 첨가한다. 눈에 보이는 침전이 없을 때까지 샘플을 소용돌이.
   참고: SDT 버퍼 비율에 대한 미토콘드리아 샘플은 1:5이어야 합니다.
2. SDT 처리 된 샘플을 5 분 동안 끓인 다음 얼음에서 샘플을 식힌 다음 원심 분리기 (2,000 x g, 2 분).
3. 추출된 미토콘드리아 단백질 샘플로서 상판액을 수집하고 BCA 단백질 분석 키트로 단백질 함량을 측정합니다.
4. SDT 추출된 미토콘드리아 단백질(각 시료의 200 μg)을 섭취하여 트립신, 담수화 및 용이성 화로 환원, 알킬화, 소화를 위해^3,4. 각 샘플에 대해 세 개의 복제를 수행합니다.
5. 트립펩티드(각 시료의 100 μg)를 100 mMM 테트라에틸 암모늄 브로마이드 용액(pH 8.5)으로 4.4단계에서 처리하고, 그 지침에 따라 6-플렉스 iTRAQ 시약 중 하나로 트립틱 펩티드에 라벨을 붙인다^3,4. 각 샘플에 3x 레이블을 지정합니다.
6. 똑같이 6개의 라벨이 붙은 트립틱 펩타이드 샘플(난소암 조직3개, 난소 대조군 조직에서 3개)을 혼합하고 진공 농축기로 건조시면 됩니다.
7. 혼합 iTRAQ 표지 된 펩티드를 SCX 크로마토그래피와 60 분획 (1 분당 1 분분)으로 분획 한 다음 SCX 분별 샘플 (n = 30)으로 모든 두 분획을 결합합니다.
8. 질량 분석기^3,4MS/MS 데이터를 얻기 위해 60분 LC 분리 구배 내에서 나노 LC 시스템과 결합된 질량 분석기^3에서LC-MS/MS 분석에 각각의 SCX 분별 샘플을 적용하였다.
9. MS/MS 데이터를 검색엔진(재료 표)으로단백질을 식별합니다.
10. iTRAQ 리포터-이온 강도를 사용하여 각 단백질을 정량화하고 >1.5 또는 <-1.5 배, p< 0.05의 변화로 미토콘드리아 차동 발현 단백질(mtDEPs)을 결정합니다.

난소암 조직및 대조군 난소 조직에서 미토콘드리아의 준비에 차이가 있었다. 이 연구는 난소 암 조직에서 미토콘드리아를 대조군 난소 조직보다 훨씬 쉽게 준비하는 것이^3,4. 몇몇 개선은 통제 난소 조직에서 미토콘드리아의 준비를 위한 프로토콜에 이루어져야 했습니다. 먼저, 조직 균질화에 앞서, 다진 대조군 조직에 첨가된 PBS 용액에 0.05% 트립신/20 mM EDTA의 8 mL을 추가하고, 실온에서 30분 동안 소화하고, 5분 동안 200 x g에서 원심분리를 추가해야 하였다(프로토콜 단계 2.5 참조). 이것은 미토콘드리아의 준비를 향상시켰습니다. 둘째, 불연속 밀도 구배는 대조군 난소 조직 및 난소암 조직으로부터미토콘드리아의 제조를 위해 상이하였다(도1). 난소암 조직을 위해 34의 5 mL, 30%의 8 mL, 25%의 12 mL(조미토콘드리아 함유), 8 mL의 23%, 및 20% 밀도의 구배 배지를 튜브에서 상부로 추가하여 제조하였다. 정제된 미토콘드리아는 원심분리 후 25%와 30% 사이의 계면에서발견되었다(도 1A,프로토콜 단계 1.12 및 1.13 참조). 대조군 난소 조직을 위해 38의 8 mL, 34의 5 mL, 30%의 8 mL, 25%의 12 mL(조미콘드리아 함유), 8 mL의 23%, 및 3 mL의 20% 밀도 그라데이션 배지를 튜브에서 상부로 첨가하여 제조하였다. 이 경우, 정제된 미토콘드리아는 원심분리 후 34%와 38% 사이의 계면에 25%와 30% 사이의 계면에서 의범위에있었다(도 1B,프로토콜 단계 2.13 및 2.14 참조).

프로토콜은 고품질 미토콘드리아 샘플을 obatined. 고품질 미토콘드리아 샘플은 정량적 미토콘드리아 프로테오믹스의 전제 조건입니다. 본 연구는EM(도 2)및 웨스턴 블롯(WB, 도 3)을통해 차동 속도 원심분리 및 밀도 구배 원심분리로 제조된 미토콘드리아의 품질을 평가하였다. EM 이미지는 난소암과 대조군 난소 조직 모두에서 소소량의 퍼록시좀을 제외하고 는 미토콘드리아를 분리하는 것을 입증했다. 미토콘드리아의 형태는 난소 조직 조절보다 난소암에서 더 많이 변했다(그림2). WB 이미지는 난소암 및 대조군 난소로부터 준비된 미토콘드리아 샘플의 주요 성분이 소량의 퍼옥시좀을 제외하고 미토콘드리아였다는 것을 입증하였다(그림3). WB 결과는 EM 결과와 일치했습니다. 미토콘드리아가 퍼옥시좀3,^17,18과광범위하게 상호작용하기 때문에, 미토콘드리아의 기능적 완전성을 반영하기 때문에, 퍼옥시좀이 준비된 미토콘드리아에 함유되는 것이 합리적이었다. 이러한 결과는 제조된 미토콘드리아 샘플의 높은 품질을 입증하였다.

이 프로토콜로 제조된 미토콘드리아 단백질의 양은 추가 분석에 적합하였다. 난소암에서 충분한 양의 미토콘드리아 샘플을 얻고 난소 조직을 제어해야합니다. 본 연구는 7개의 난소암 조직에서 제조된 미토콘드리아 샘플을 결합하고, 11개의 대조군 난소 조직^3. 총 2,409 μg의 미토콘드리아 단백질 샘플을 난소암에 대해 수득하였고, 4,440 μg의 미토콘드리아 단백질 샘플을 대조군 난소 조직을 수득하였다(표1). 일반적으로 iTRAQ 정량 단백질학의 경우, 각 시료는 적어도 600 μg 의 단백질을 필요로 합니다(각 iTRAQ 라벨당 200 μg 단백질, 3개의 복제). 따라서, 제조된 미토콘드리아 단백질 샘플은 iTRAQ 정량 단백질학 분석을 위해 충분하였다.

정량화된 단백질의 최대 수의 성취는 인간 난소암에 있는 미토콘드리아의 심층적인 조사 이득. 이 연구는 2,565명(50.14%)을 포함한 난소 조직 대조군과 비교하여 난소암에서 5,115개의 단백질을 검출, 식별 및 정량화했습니다. 업규제 단백질(암과 대조군 비율 >1) 및 2,550 (49.86%) 하향 조절 된 단백질 (대조군과 암의 비율 & lt;1)³ (표 2). 또한, 본 연구는 523 (43.66%)을 포함하여 난소암과 대조군 난소 사이에 1,198mtDEPs를 결정했습니다.>1.5 또는 <-1.5 배 변화 (p < 0.05), 포함 하 여 675개(56.34%) 하향 조절 단백질⁴ (표 2). 이 데이터는 현재 난소암에 있는 가장 큰 미토콘드리아 proteome 단면도입니다.

도 1: 조미토콘드리아는난소암(A)및 대조군 난소(B) 조직에 대한 불연속밀도 구배 원심분리로 정제하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 2: 난소암(A)으로부터 분리된 미토콘드리아의 전자 현미경 이미지 및 난소 조절(B) 조직. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 3: 난소암(A) 및 조절 난소(B) 조직에서 분리된미토콘드리아의소기관 특이적 항체 기반 서양 얼룩 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 준비된 미토콘드리아 단백질 샘플의 양.

표 2: 준비된 미토콘드리아 샘플로부터 iTRAQ 식별 단백질의 수.

미토콘드리아 변경은 난소암의 특징입니다. 인간 난소암에서 고품질의 미토콘드리아 시료를 제조하고 대규모 정량적 프로테오믹스에 대한 대조조직을 제조하여 난소암 발병기전 및 미토콘드리아 분자 네트워크 변화에 대한 미토콘드리아 기능에 대한 심층적인 이해를 돕고, 미토콘드리아^4,8에기초한 표적 치료 및 효과적인 바이오마커의 후속 발견을 위한 분자 메커니즘을 명확히 하는 데 도움을 줍니다. 밀도 구배 원심분리와 결합된 차동 속도 원심분리는 인간 난소암으로부터 효과적으로 분리되고 정제된 미토콘드리아및 난소 조직을 조절한다. 제조된 미토콘드리아 샘플은 매우 높은 품질이었고 추가의 정량적 프로테오믹스 분석에 적합하였다.

제조된 미토콘드리아 샘플에는 소량의 퍼옥시좀^3,17,18 및 세포토솔성 단백질^19,20을함유하였다. 미토콘드리아가 더 완전하게 기능할 수 있도록 미토콘드리아와 직간접적으로 상호 작용하거나 부착하기 때문에 이것은 단순히 오염으로 간주되어서는 안됩니다. 연구는 미토콘드리아가 액틴 세포골격^19,20 및 퍼옥시좀^17,18과광범위하게 상호 작용한다는 것을 발견했습니다. 일부 세포질 단백질과 과산화성 단백질이 분리된 미토콘드리아 샘플에 포함되어 있는 것은 피할 수 없습니다.

준비된 미토콘드리아 샘플에서 단백질을 검출, 식별 및 정량화하는 핵심 기술은 iTRAQ 라벨링-SCX-LC-MS/MS였습니다. 이 연구는 1,198 mtDEPs^4,14를포함하여 5,115 개의 미토콘드리아 단백질을 확인하고 정량화했습니다. 난소암 조직에서 발견되는 많은 미토콘드리아 단백질에는 난소암 발병기전에서 미토콘드리아의 역할을 이해하는 데 도움이 될 수 있는 단백질이 포함되어 있으며, 미토콘드리아 대사^8에기초한 맞춤형 표적 요법의 발견을 위한 자원이 될 수 있으며, 심지어 미토콘드리아 게놈에 기초한 효과적인 바이오마커를 찾는 것까지도 포함하며, 조직적인 다중 오믹스 각도^{9,11,12,13에서}proteomics 및 대사체학. 더욱이, 프로테오메에 프로테오폼 및 단백질 종 개념의 도입으로, 미토콘드리아 프로테오폼 또는 단백질 종의 심층 탐사는 난소암에 대한 효과적이고 신뢰할 수 있는 바이오마커 및 치료 표적의 발견으로 직접 이어질 수 있다^10,21,22.

더욱이, 여기에 기술된 인간 난소암 조직 미토콘드리아 프로테오옴의 분석에 대한 본 프로토콜은 다른 인간 질환 미토콘드리아 프로테옴을 연구하기 위해 쉽게 번역된다.

저자는 공개 할 것이 없다.

이 작품은 후난성 백 인재 계획(X.Z.), 시안야 병원 인재 소개 기금(XZ), 중국 국립 자연과학 재단(그랜트 81572278 및 XZ 81272798), 중국 "863" 계획의 보조금에 의해 지원되었습니다. 프로젝트 (그랜트 번호 2014AA020610-XZ), 중국의 후난 성 자연 과학 재단 (그랜트 번호 14JJ7008 에 XZ). X.Z.는 본 원고의 개념을 구상하고, 미토콘드리아 샘플의 iTRAQ 정량적 프로테오믹스 데이터를 획득하고, 원고를 작성 및 수정하고, 관련 작업을 조정하고, 재정 지원 및 대응에 대한 책임을 지었습니다. 작업. H.L. 미토콘드리아 샘플을 제조하였다. S.Q. 부분 작업에 참여했습니다. X.H.Z는 영어 쓰기 및 편집에 참여했습니다. N.L.은 iTRAQ 프로테오믹스 데이터를 분석했습니다. 모든 저자는 최종 원고를 승인했다.