형광 활성 세포 선별을 통해 확립 된 정제 GABAergic 또는 Glutamatergic 뉴런의 일차 세포 배양

이 프로토콜은 출생 후 생쥐 또는 쥐의 신 피 질 및 해 마 로부터 형광 GABAergic 또는 glutamatergic 뉴런의 정제 및 배양을 위한 세포 선별 방법을 설명 한다.

이 프로토콜의 전반적인 목표는 GABAergic 또는 glutamatergic 뉴런에서 파생 된 정제 된 뉴런 배양 물을 생성 하는 것입니다. 정제 된 뉴런은 16 일 동안 시험관 내에서 정의 된 배지에서 배양 될 수 있으며, 전기 생리학적, 형태학 적 및 생존 분석을 포함 하 여 해리 된 배양 물에서 통상적으로 수행 되는 모든 분석을 가능 하 게 한다. 이러한 배양의 주요 이점은 신경 교 세포 또는 다른 뉴런 유형에 서 발생 하는 것과 같은 복잡 한 외부 영향이 없는 특정 세포 유형이 선택적으로 연구 될 수 있다는 것 이다. 그러나 순화 한 세포를 가진 실험을 계획할 때, 신경 세포는 그들의 성장과 생존을 위한 글 리아 컨디셔닝 된 매체에 강하게 의존 한다는 것을 주의 하는 것이 중요 합니다. 또한, glutamatergic 뉴런은 시 냅 스 전달의 확립에 대 한 글 리-분 비 인자에 의존 한다. 따라서 우리는 또한 신경 세포를 비 접촉 배열로 배양 하는 방법을 기술 한다. 이러한 방법을 사용 하 여, 우리는 GABAergic 및 glutamatergic 뉴런 네트워크의 개발 사이의 주요 차이점을 확인 했습니다. 따라서, 정제 된 뉴런의 문화를 연구 하는 것은 신 경계가 어떻게 발전 하 고 기능 하는지에 대 한 우리의 이해를 촉진 하기 위한 큰 잠재력을가지고. 더욱이, 정제 된 배양 물은 약리학 적 제제, 성장 인자 또는 특정 세포 유형에 대 한 유전적 조작의 결과를 탐구 하기 위한 직접적인 작용을 조사 하는데 유용할 수 있다. 더 많은 형질 전환 동물이 사용할 수 있게 되 면, 관심의 추가 특정 세포 유형에 라벨링, 우리는 여기에 설명 된 프로토콜이 그들의 적용 가능성과 잠재력에 성장할 것으로 예상.

세포 분류는 세포의 이종 혼합물 로부터 관심 있는 살아있는 세포를 분리 하기 위한 강력한 도구입니다. 세포는 형광 표지^1,2의 발현 뿐만 아니라 크기 및 형태 기준에 기초 하 여 정렬 될 수 있다. 종종 형광 단-공액 항 체는 세포 특이 적 표면 항 원을 표적화 하 여 별개의 세포 유형에 라벨을 지정 하는데 사용 된다^3,4. 대안적으로, 형질 전환 동물 또는 바이러스 전달 시스템은 세포 특이 적 프로모터^5,6하에서 형광 단을 발현 하도록 설계 되었다. 역사적으로, 형질 전환 도구 및 동물의 개발은 비용과 시간이 많이 소요 되었습니다. 최근에는 비용 절감과 기술적인 어려움이 적기 때문에 사용 가능한 리포터 회선 수가 크게 증가 했습니다. 형질 전환 도구 및 리포터 동물의 가용성이 계속 해 서 증가 함에 따라 형광 기반 세포 선별 방법의 유용성 및 적용 성이 있어야 한다.

우리는 최근 세포 배양⁷에 대 한 준비에서 일차 뉴런을 정제 하기 위해 형질 전환 동물 로부터 세포 선별을 일상적으로 적용할 수 있음을 입증 하였다. 쥐 또는 마우스 중 하나에서 세포를 선별 함으로써, 우리는 GABAergic 또는 glutamatergic 뉴런^6,9중 어느 하나에 특이 적으로 형광 리포터 단백질을 발현 하는 형광 뉴런을 분리 하 고 배양 할 수 있었다. 이러한 정제 된 뉴런 배양 물을 연구 함으로써, 우리는 GABAergic 및 glutamatergic 뉴런 들이 시 냅 스 전송⁷의 확립에 대 한 글 리 분 비 인자에 의존 하는 방식에서 중요 한 차이를 확인할 수 있었다. 추가적으로, 정제 된 뉴런을 가진 신경 교 세포를 공동 배양 함으로써, 신경 교 세포 들이^10,11의 성장 및 생존에서 재생 하는 중요 한 역할을 보여주는 이전의 관측 들을 확대할 수 있었다. 따라서, 세포 분류와 세포 배양의 조합을 통해 서, 우리는 고립 된 특정 뉴런 유형의 개발 뿐만 아니라 그들의 기능에 신경 교 세포의 영향을 조사할 수 있었습니다.

우리는 여기에 형질 전환 쥐 또는 쥐의 피 질 및 해 마 로부터 GABAergic 및 glutamatergic 뉴런의 정제 및 배양을 위한 프로토콜을 제시 한다. 우리는 또한가이 슬 러 외¹²에서 적응 된 정제 뉴런 및 신경 교 세포의 비접촉 공동 배양을 위한 방법을 제시 한다. 정제 된 GABAergic 배양 물을 생성 하기 위해, 우리는 VGAT-비너스 로부터 형광 뉴런 들을 선별 하 여,이를 선택적으로 > 95%의 향상 된 황색 형광 단백질 변이체 (Venus)를 발현 하는 Wistar 랫 트⁸ 또는 Vgat-비너스 마우스 (¹³) 대뇌 피 질의 GABAergic 뉴런. 순화 된 glutamatergic 문화를 생성 하기 위하여는, 우리 NexCre에서 형광 성 뉴런을 분류 했습니다; Ai9 마우스 (⁶)는 대뇌 피 질 glutamatergic 뉴런에서 tdtomato를 발현 한다. 전체 선별 및 배양 절차는 3-4 h 내에서 수행 될 수 있으며 전기 생리학적, 형태학 적 및 세포 생존 분석에 적합 한 수백 개의 복제 배양을 생성 하는 데 사용 될 수 있습니다. 이 방법은 간단 하 고 재현 가능 하며 관심 있는 세포 유형에 대해 97% 이상의 순수 한 정제 된 뉴런 배양 물을 생산할 수 있습니다.

모든 절차 및 동물 유지 관리는 제도적 지침, 독일 동물 복지 법 및 동물 보호에 관한 유럽 위원회 지침 86/609/EEC에 따라 수행 되었으며, 현지에서 허가를 받았습니다. 정부 기관 (0215).

참고: 이 프로토콜은 단일 형질 전환 쥐 또는 강아지 쥐 (출생 후 0 ~ 2)에서 정제 된 뉴런의 배양을 설명 합니다. 모든 기술은 무 균 조건 하에서 수행 되어야 한다. 모든 솔루션은 0.2 µm 필터를 사용 하 여 소독 해야 합니다 ( 재료 표참조). 유리 커버 슬립 및 해 부 도구는 185 ° c에서 3 시간 동안 열 살 균 해야 합니다.

1. 폴 리 라이 신과 코팅 유리 커버 슬립

1. 200 µ 폴 리 라이 신 (PLL) 용액의 5Ml 분 취를 제거 하 여 유리 커버 슬립을 준비 합니다. 순수한 주입 학년 물 45 mL를 추가 하 여이 원 액을 20 µ g/mL에 희석 하십시오. 필터-용액을 새로운 50 mL 원추형 튜브로 소독 하십시오. 이 튜브를 "PLL 멸 균"으로 라벨을 부착 합니다.
   참고: 상 온에 저장 된 물을 사용 하 여 해 동 공정의 속도를 높일 수 있습니다.
2. 멸 균 PLL 솔루션에 100 멸 균, 원형, 12mm 유리 커버 슬립을 추가 합니다. 심지어 코팅을 보장 하기 위해, 2 ~ 3 분에 대 한 매 5-10 분 마다 튜브를 교 반. 이 방법으로 커버 슬립을 1 시간 동안 코팅 합니다.
   참고: 독일에서 제조한 원형 유리 커버 슬립 (지름 = 12mm)은 안정적인 배양 표면을 제공 하 고 24 웰 세포 배양 판의 웰에 쉽게 들어갈 수 있기 때문에 선호 됩니다.
3. PLL 코팅의 40 분 후에 티슈 페이퍼 2 개를가지고 흐름 캐비닛에 평평 하 게 놓습니다. 70% 에탄올을 사용 하 여 종이를 소독 한 다음 평평 하 게 하 여 주름을 제거 하 고 건조 상태로 둡니다.
4. 유리 커버 슬립을 PLL로 1 시간 코팅 한 후 과량의 PLL 솔루션을 제거 하 고 멸 균 주입 등급 물을 추가 하십시오. 2 ~ 3 초 동안 커버 슬립을 부드럽게 교 미 하 여 초과 PLL의 제거를 허용 합니다. 이 헹 굼 단계를 추가로 2 회 반복 합니다.
5. 여분의 물을 제거한 다음 커버 슬립을 멸 균 티슈 페이퍼로 옮겨 준다. 각 커버 슬립을 곡선형 핀셋으로 조심 스럽게 분리 하 고 건조 시켜 둡니다.
   참고: 쉽게 분리 되지 않는 커버 슬립은 폐기 될 수 있습니다. 대안적으로, 소량의 물을 첨가 하 여 분리를 도울 수 있다.
6. 건조 한 후 커버 슬립을 24 웰 배양 플레이트에 옮겨 주세요.
   참고: 커버 슬립은 해 부 과정을 시작 하기 전에 약 30 분-1 시간을 준비 해야 합니다. 플레이트는 필요할 때까지 37 ° c 및 5% CO2에서 인큐베이터 에 보관할 수 있습니다.

2. 하 마 및 피 질 조직의 해리

1. 세포 배양 용액의 제조
   1. 신경 조직의 해리에 대 한, 먼저 세포 배양 완충 액의 40 mL 분 취를 제 상 한다 (mM에서의 조성 물): 116 염화 나트륨, 5.4, 1.3 0.52ha2·1c4 · 2N·22h 및 25d 포도 당, pH = 7.4). 15 mL 원뿔형 튜브에 대 한 12 mL의 세포 배양 완충 액을 측정 하는 단계; "BSA"로 레이블. 5 mL의 세포 배양 완충 액을 다른 15 mL 튜브로 측정 하는 단계; "파파 인"으로 라벨을 지정 합니다. 37 ° c에서 15 분 동안 수조 내에 두 튜브를 배양 합니다.
   2. 나머지 세포 배양 완충 액을 필터-멸 균 하 고, 필요 시까지 4°c에서 보관 하 여 "완충 메 마른"으로 라벨을 부착 한다.
   3. 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 120 mg을 계량 하 고 "BSA" 라는 레이블이 붙은 튜브에 추가 합니다. 파파 인 7 mg을 무게를 내 고 튜브에 추가 합니다. 15 분 동안 수조에 두 튜브를 돌려줍니다.
      참고: 파파 인 분말의 전달을 용이 하 게 하기 위해 계량 보트에 소량의 버퍼를 추가 하는 것이 도움이 된다.
   4. 모든 분말이 용 해 되 면, 각 용액을 신선한 15 mL 원추형 튜브에 필터-살 균 합니다. 튜브 파파 인에 대해, 필터링 된 용액에 "파파 인-멸 균"으로 라벨을 부착 합니다. 튜브 BSA에 대 한, 3 튜브에 멸 균 BSA 솔루션을 분할, BSA 용액 4 mL를 포함 하는 각각. 각 튜브에 ' BSA 멸 균 '과 ' 1 ', ' 2 ' 또는 ' 3 '으로 라벨을 부착 합니다. 모든 튜브를 다시 수조에 반환 하 고 필요할 때까지 37 ° c에서 계속 배양 합니다.
2. 조직 해 부를 위한 준비
   1. 35 mm 여과 지 ( 재료 표참조)를 한 장씩 복용 하 고 70% 에탄올로 소독 하십시오. 100 mm 페 트리 접시의 뚜껑을 흐르는 캐비닛에 두고 건조 시킵니다.
   2. 해 마와 피 질의 해 부에 필요한가 위, 집게, 메스 및 주걱 ( 재료 표참조)을 배치 합니다.
   3. 장소 2 35 mm 페 트리 접시와 100 mm 페 트리 접시 흐름 캐비닛의 중앙에 접근 할 수 있는 위치에 멸 균 필터 종이를 포함.
   4. 트랜스 제 닉 NexCre를 수집; Ai9 및 VGAT 금성 마우스 새끼는 해 부 해야 합니다. 적절 한 여기 및 방출 필터 ( 재료 표참조)가 있는 형광등을 사용 하 여 야생 유형 littermates의 형광 새끼를 구별 하십시오.
   5. 동물을 하 부 하기 직전에 냉장, 멸 균 세포 배양 완충 액으로 35 mm 페 트리 디쉬를 각각 채 웁 니다.
      참고: 한 페 트리 접시는 분리 사이의 도구를 청소 하는 것입니다, 다른 하나는 해 마와 피 질을 수집 하기 위한 것입니다.
3. 조직 해 부
   1. 세포 배양 완충 액이 부 어 지 면 서, 출생 후 하루 0-2 형질 전환 마우스 또는 쥐 새끼 큰, 날카로운가 위를 사용 하 여 머리를 흐름 캐비닛으로 전달 하는 멸 균 100 mm 페 트리 접시를 사용 합니다. 포 셉,가 위 및 주걱을 사용 하 여 신중 하 게 형질 전환 강아지의 뇌를 멸 균 여과 지에 전달 합니다.
   2. 소 뇌를 멀리 하 고 2 반구를 분리 하는 타입 22 메스를 사용 합니다. 작은 주걱을 사용 하 여 횡 방향으로 반구를 굴려. 각 반구에서 부드럽게 아래로 눌러 피 질이 필터 종이와 접촉 하도록 합니다. 조심 스럽게 해 마와 피 질을 나타 내기 위해 중간 뇌 부위를 이동 합니다.
      참고: 반구에 아래로 누를 때 너무 많은 압력을 적용 하지 않도록 주의 하거나 세포가 분쇄 될 수 있다.
   3. 각 반구에서 해 마와 피 질을 분리 하는 메스 또는 주걱을 사용 합니다. 해 부 조직을 냉장 세포 배양 완충 액을 함유 하는 35 mm 페 트리 디쉬에 전달 한다.
      참고: 여러 동물을 하 부 하는 경우, 얼음에 50 mL 원추형 튜브에 멸 균 세포 배양 버퍼를 저장 합니다. 각각의 해 부 후, 해 부 된 조직을 냉장 세포 배양 완충 액으로 전달 한다.
   4. 코르 티코-해 마 조직의 성공적인 해 부 후, 흐름 캐비닛에 물 욕조에서 멸 균 파파 인 용액을 전송 한다. 3 mL 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 해 부 해 마와 피 질을 멸 균 35 mm 페 트리 접시의 뚜껑으로 옮겨 준다. 조직이 작은 조각에 있을 때까지 유형 22 메스의 평평한 부분을 사용 하 여 십자 동작으로 들어온다.
   5. 소량의 파파 인 용액을 사용 하 여 페 트리 디쉬의 뚜껑 으로부터 다진 조직을 무 균 파파 인 튜브로 전달 한다. 파파 인 튜브를 수조에 반환 하 고 25 분 동안 37 ° c에서 조직을 배양 한다.
   6. 파파 인 인큐베이션 동안, 완전 한 형광 매체 용액을 구성 한다. B27의 1ml의 분 취 제를 제 상, Glutamax 및 펜 strep의 0.5 ml의 분 취 액의 0.5 ml의 분 취 액. 최대 절전 모드의 aliquot 48.5 mL은 50 mL 원뿔형 튜브에 낮은 형광 매체를 제공 합니다. B27, Glutamax 및 펜 Strep를 솔루션에 추가 합니다. 용액을 잘 흔들어 준 다음 필터 소독 하 고 "완전 한 미디어 최대 절전 모드" (날짜 및 이니셜 포함)로 라벨을 지정 합니다. 수 조에서 37 ° c에서 배양 합니다.
   7. 파파 인 배양 후, 유로 파파 인과 멸 균 BSA 튜브를 흐름 캐비닛에 전달 합니다. 1 mL 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 파파 인 튜브에서 BSA-튜브 1로 코르 티코 해 마 조직을 제거 하십시오.
      참고: 과도 한 파파 인 용액의 전달을 최소화 하기 위해 주의 하십시오.
4. 세포의 해리
   1. 조직의 큰 덩어리를 분해 하기 위해, 1 mL 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 조직을 여러 번 트리 팅 합니다. 이 후, 미세 팁 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 조직 7 번을 삼 출 한다. 조직에서 30 초 동안 방치 하면 더 큰 조직을 퇴적 물에 사용할 수 있습니다.
   2. 30 초 후에 BSA 튜브 1에서 BSA 튜브 2로 1 mL의 용액 및 조직을 전송 합니다. 미세 팁 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 BSA-튜브 2 여러 번에 조직을 삼 투.
      1. Trituration 후, BSA 튜브 1에서 조직 및 용액의 낮은 1 mL를 다시 전송 하지만, 지금 BSA-튜브 3. 미세 팁 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 BSA-튜브 3 여러 번에 조직을 삼 출.
      2. Trituration 후, BSA 튜브 1로 튜브 2 및 3에서 모든 솔루션과 조직을 전송 합니다. 3000 x g 에서 3 분간 원심 분리기를 2-3.
   3. 원심 분리 중에 완전 한 신경 기저 A 배지 (NBA 미디어)를 구성 합니다. 용 수 조에서 37 ° c에서 48.5 ml의 원뿔형 튜브에 NBA 미디어의 aliquot를 50를 배양 한다. 이 튜브에 라벨 "NBA만". 또한, B27의 1Ml의 분 취 제를 해 동 하 고, 실 온에서의 Glutamax 및 펜 Strep의 0.5 mL의 분 취 액을 0.5.
   4. 원심 분리 후, 펠 라이 온 조직에서 상층 액을 조심 스럽게 제거 하 고 2 mL의 완전 한 배지에서 세포를 재 일시 중단 한다. P1000 파이 펫을 사용 하 여 조직을 위 아래로 20 회 트리 트 레이트 합니다.
      참고: 세포를 너무 세게 피 펫 팅 하지 않도록 주의 하십시오. 너무 많은 압력이가 해지면 세포가 손상 될 수 있습니다.
   5. 1 mL 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 30 µm 세포 체를 통해 세포 현 탁 액을 폴리스 티 렌 샘플 튜브로 걸러 냅니다.
      참고: 세포 현 탁 액이 세포 체를 통해 즉시 통과 하지 않는 경우에, 흐름을 시작 하기 위하여 살 균 장갑을 가진 체의 꼭대기에 눌러야 할 수 있습니다. 이 중요 한 단계 는 셀 분류기의 막힘을 방지 합니다.
   6. 선별 후 뉴런을 수집 하려면 완전 한 미디어의 300 µ L을 폴 리 프로필 렌 튜브의 필요한 수로 피 펫 팅 하 여 수집 튜브를 준비 하십시오.
   7. 셀 서 스 펜 션을 정렬 하기 위해 셀 분류기로 이동 시킬 준비가 되었습니다. 샘플을 희석 해야 하는 경우에는 셀 서 스 펜 션, 여분의 수집 튜브 및 여분 미디어를 가져가 라.

3. 정제 된 GABAergic 또는 Glutamatergic 뉴런의 세포 분류

참고: 선별 하는 동안 세균 오염의 가능성을 최소화 하기 위해 선별 기의 샘플 튜브를 70% 에탄올로 헹 구 어 정렬 하기 전에 5 분 이상. 상세한 정렬 매개 변수는 계측기 마다 다르며 근본적인 고려 사항은 다음과 같습니다.

1. 첫 번째 셀 정렬 중에 야생 유형 동물의 세포를 정렬 하 고 비교 하 여 레이블이 없는 셀에서 배경 형광 수준을 설정 합니다.
2. 정렬할 각 형광 셀 유형에 대해 적절 한 여기 및 방출 필터를 선택 합니다. 각각 488 nm 또는 531 nm 여기 파장을 사용 하 여 금성 및 TdTomato 단백질을 자극 합니다. 530/40 및 575/30 방출 필터 세트를 통해 방출 된 빛을 각각 감지 합니다.
3. 완전 한 매체의 300 μ l를 포함 하는 폴 리 프로필 렌 수집 튜브를 세포 수집을 위한 셀 분류기에 추가 하십시오.
4. 고 순도의 경우, 밝게 표시 된 형광 셀을 정렬 하십시오 ( 그림 1b 참조: 정렬 된 셀의 도트 플롯).
5. 정렬 후 최적의 결과를 위해 정렬 된 셀의 순도 테스트를 수행 하 여 순도 수준을 추정 합니다. 정렬 다음의 일반적인 셀 회수율은 70 ~ 80%입니다.
6. 각 수집 튜브에 정렬 된 셀 수를 기록해 둡니다. 이 값은 셀 정렬 도구에 의해 주어진 다.
   참고: 셀 정렬은 70 µm 노즐 (70 psi 보호관 유체 압력) 또는 100 µm 노즐 (20 psi 외피 유체 압력)을 사용 하 여 수행할 수 있습니다.

4. 정렬 된 뉴런의 배양

1. 셀 선별 후, 1 mL 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 수집 된 세포를 2 mL 둥근 바닥 원심 분리기 튜브로 옮깁니다. 세포를 3 분간 3000 x g 에서 원심 분리 하 여 세포 펠 렛을 형성 한다.
   참고: 셀 펠 렛의 위치를 식별 하는 데 도움이 되도록 둥근 바닥 원심 분리기 튜브를 바깥쪽으로 향하게 하 여 뚜껑의 힌지 (즉, 튜브의 동일한 측면에서 힌지로)를 원심 분리기 튜브 뒤쪽에 형성 할 수 있습니다.
2. 원심 분리 하는 동안 B27 0.5, Glutamax 및 펜 Strep의 0.5 ml의 1 mL을 미리 데워 진 NBA 미디어의 48.5 mL에 추가 하십시오. 용액을 잘 흔들어 다음 멸 균 및 라벨을 "NBA 완료 미디어" (날짜 및 이니셜 포함)로 표시 합니다. 필요할 때까지 물 목욕으로 돌아가십시오.
3. 원심 분리 후, 1 mL 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 상층 액을 다른 원심 분리기 튜브로 이송 (세포 펠 렛이 교란 된 경우 상 등 액을 유지 한다). 1000 셀/µ의 세포 밀도를 달성 하기 위해 미리 데워 진 완전 한 NBA 미디어의 필요한 양으로 세포 펠 렛을 재 일시 중단 하 고 P200 또는 P1000 파이 펫을 사용 하 여 위아래로 파이 펫 팅 하 여 세포를 재 정지 시킵니다.
4. 해리 된 세포의 존재를 확인 하려면 4 배 또는 10 배 대물 렌즈를 사용 하 여 현미경으로 세포 용액을 확인 하십시오. 대안적으로, 커버 슬립 상에 소량의 세포 용액을 파이 펫 팅 하 고 현미경 하에서 확인 한다. 다 수의 세포가 존재 하는 경우에, 4.3 단계의 상층 액은 폐기 가능 하다.
5. 세포를 도금 하기 전에 2 ~ 3 초 동안 중간 속도로 소용돌이를 하 여 균일 한 세포 현 탁 액을 보장 한다. Vortexing에 따라, 셀 현 탁 액의 10 µ L을 각 커버 슬립의 중심으로 신속 하 게 피 펫 팅 합니다. 세포를 피 펫 팅 한 후 각 플레이트를 인큐베이터 (5% CO2/37 ° c)로 신속 하 게 복귀 하 고 1 시간 동안 배양 합니다.
   참고: 여러 개의 24 웰 플레이트에 셀을 추가 하는 경우, 플레이트 사이에 세포를 볼 텍 싱 하 여 균일 한 세포 밀도를 보장 합니다.
6. 1 시간 후, 미리 따뜻하게 완전 한 NBA 미디어의 500 µ L로 세포를 공급 하 고 인큐베이터로 돌아갑니다.
   참고: 세포를 공급할 때 세포 분리를 피하기 위해 매체를 우물의 측면 아래로 부드럽게 피 펫 하는 것이 중요 합니다. 짧은 실험 (< 16 일)의 경우, 상기 밀도에서 먹이는 것은 필요 하지 않습니다. 더 큰 밀도의 세포를 도금 할 때 더 빈번한 급지 간격이 필요할 수 있습니다 ( 토론참조).

5. 성상 세포 강화 신경 교 지원 배양 물

참고: 신경 교 배양¹⁴ 의 제조 및 세포 배양 삽입물의 사용은 이전에 기술 되었다¹². 간단히 말해, 농축 된 아 교 세포 배양 글 리아는 코 티코-하 마 조직 으로부터 유래한 다 (meninges 제거 됨; P2-P5), 20 µ의 PLL 코팅 6 웰 플레이트에서 일주일 동안 배양 되었으며, DMEM 배지를 보충 한 혈 청.

1. 정제 된 뉴런 및 신경 교 세포를 공동 배양 하기 위해, 필요한 수의 세포 배양 삽입 (0.4 µm 기 공 크기에 대 한 교 활 신경 교 세포를 통로- 물질 표참조). 세포를 통과 시키기 위해, 부 화기 로부터 confluent 신경 교 세포를 함유 하는 6 웰 플레이트를 제거 하 고 2 개의 웰 스를 2 회 세척 한 후, 2 mL의 미리 따뜻하게 (37) 인산 완충 식 염 수 (PBS)를 사용 한다.
2. PBS 용액을 흡 장 하 고 P1000 피 펫을 사용 하 여 미리 데워 진 (37°c) 트립 신 (1:250)/EDTA (0.25%/0.02%) 각 웰에 대 한 해결책.
3. 6 웰 플레이트를 인큐베이터에 반납 하 고 세포 분리를 위해 2 ~ 3 분 간격으로 점검 합니다.
4. 중요 한 세포 분리가 발생 한 후에는 미세 팁 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 세포 및 세포 용액을 부드럽게 위아래로 피 펫 하 여 개별 세포를 더 분리 하 고 분리할 수 있도록 돕습니다.
5. 셀 용액을 15 mL 원추형 튜브로 전송 하 고 3 분 동안 3000 x g 에서 원심 분리기로 이동 합니다.
6. P1000 피 펫을 사용 하 여 세포를 재 일시 중단 하 고 미리 데워 진 (37 ° c) NBA 완전 배지는 셀 펠 렛이 용액에 있을 때까지 위아래로 부드럽게 파이 펫 팅을 수행 합니다.
7. 하 모 세포종 또는 자동화 된 세포 카운터를 사용 하 여 세포 수를 수행 합니다.
   참고: 문화 7 일 후 약 750000-1000000 세포는 6 웰 플레이트의 각 웰에서 수확 할 수 있습니다.
8. 4만의 각 세포 배양 액을 500 µ L 방울 (80 세포/µ L)에 삽입 하는 교 신경 세포.
9. 세포가 1 시간 동안 부착 되도록 허용한 후, 멸 균 포 셉을 사용 하 여 정제 된 뉴런을 포함 하는 24 웰 플레이트에 신경 교 피복 세포 배양 삽입물을 전달 한다. 세포 배양 삽입물 (약 300 µ L)의 표면에서 과잉 배지를 제거 한다.
   참고: 기포가 종종 세포 배양 삽입물 아래에 갇 히 게 될 수 있으므로, 삽입을 부드럽게 기울여 이러한 기포를 분리 해야 할 수 있습니다. 더 많은 신경 교 세포가 세포 배양 삽입물에 첨가 되는 경우, 추가적인 세척 및 원심 분리기 단계는 세포 생존에 유해할 수 있는 과잉 트립 신을 제거 하기 위해 요구 될 수 있다.

형질 전환 마우스 또는 랫 트 코르 티코-하 마 조직 으로부터 형광 뉴런의 해리 및 세포 분류는 약 3 ~ 4 시간 내에 수행 될 수 있다. 결과는 16 일 동안 배양에서 성장할 수 있는 매우 순수한 형광 뉴런의 인구입니다.

정제 된 배양 물을 생성 하기 위해, 형질 전환 동물을 적절 한 필터 세트로 형광 램프를 사용 하 여 먼저 동정 하였다 (형광 신생아 VGAT 금성 및 NexCre의 예; Ai9 마우스 새끼는 도 1a에 나타나 있다). 형질 전환 동물의 동정에이 어, 해 부 된 조직은 해리 되 고, 가장 강하게 형광 뉴런은 정제 된 세포 집단을 생성 하도록 분류 되었다. 예를 들면 형광 강도 도트 플롯 NexCre; FACS 동안 얻어진 Ai9 및 VGAT 금성 마우스 뉴런은 도 1b에 나타나 있다. 최적화 될 때, 그것은 개별 P0 NexCre의 피 질과 해 마에서 50만와 80만 세포 사이에서 수확 하는 것이 가능 합니다; Ai9 또는 VGAT 비너스 마우스. 셀은 600 이벤트/s의 속도로 정렬 될 수 있습니다. 세포 순도의 추정치는 핵 마커로 서 DAPI를 사용 하 여 수행 하였다 (도 1c). 강하게 양성 세포를 분류 함으로써, 97% 이상의 순도는 일상적으로 달성 될 수 있다⁷.

성공적인 선별 후, 도금 된 뉴런은 둥근 모양으로 나타나야 하 고, 매끄러운 멤브레인을가지고 있으며, 신경 세포를 시험관 내 약 1 시간 후에 새싹을 볼 수 있어야 합니다 (그림 2a, B). 7 일 동안 시험관 내에서, 일부 세포 사 멸은 명백 할 수 있지만, 생존 가능한 세포는 모든 배양 조건 (도 2c, D)에 존재 해야 한다. 시험관 내에서 12 ~ 16 일 동안, 전체 세포 패치-클램프 기록 물 및 바이 셀 틴-필 링 (¹⁵)을 사용 하 여 정제 된 뉴런의 형태학 적 및 전기 생리학적 개발을 조사할 수 있다 (도 3). 순화 한 문화의 분석은 glutamatergic와 GABAergic 신경 둘 다가 그들의 세포 바디에서 축 삭과 모 수석을 확장할 수 있었습니다 (그림 3a, B) 및 반응에 있는 활동 잠재력을 생성 하는 능력을 유지 한다는 것을 계시 합니다 (그림 3c, D). 특히, 그러나, 정제 다음, GABAergic 뉴런은 상당한 양의 자발적인 시 냅 스 전달을 받았으며, glutamatergic 뉴런은 신경 교 세포의 부재 하에 매우 작은 시 냅 시스 전달을 받는다 (도 3e , F) ⁷.

우리가 이전에 보고 한 바와 같이, 정제 된 배양의 세포는 정렬 되지 않은 문화권에서 보다 더 저조한 생존 하는 경향이 있고 상당히 작은 모 수석 및 축 삭⁷. 이러한 적자를 극복 하기 위해, 우리는 신경 교 세포 들을^12,14로 정제 된 배양 물의 개발을 지원 하기 위한 방법 들을 적응 및 적용 하였다. 우리의 신경 교 지원 배양 물 (DIV7)의 세포 조성은 도 4a에 나타나 있다. 이들 배양 물은 주로 신경 교 섬유와 산 성 단백질 (GFAP) 양성 성상 세포를 포함 하지만 또한 분화 분자 (CD11b) 양성 미세 교 및 myelin 염기 단백질 (MBP) 양성 oligodendrocytes의 일부 군집을 함유 하였다. 7 DIV 이후에, 이들 세포는 정제 된 뉴런의 비접촉 지 지체를 제공 하기 위해 세포 배양 삽입물을 통과 시킬 수 있다 (도 4b, C). 글 리아 뉴런 공동 배양의 분석은 약 4만 신경 교 세포가 정제 된 glutamatergic 및 GABAergic 뉴런 모두의 장기적인 생존과 성장을 개선 하기에 충분 하다는 것을 보여준다 (도 4d, E). 더욱이, 전기 생리학적 분석은 신경 교 세포와 공동 배양 한 glutamatergic 뉴런 들이 매우 활발 하 게 활동 하 고 있으며, 네트워크 활성 (신경 교 glutamatergic 뉴런의 움직임을 폭발적으로 증가 시켰다는 것을 보여준다 잠재력: 62%; n=28; 도 4f , G). 따라서 신경 교 지원은 뉴런 성장과 생존 촉진 뿐만 아니라, 시 냅 스 전달을 촉진 하 고 glutamatergic 문화권에서 네트워크 활동의 확립에도 중요 합니다.

그림 1: glutamatergic 및 GABAergic 뉴런의 정제 (A) 상기 NexCre에서 TdTomato의 이식 유전자 발현 으로부터의 형광 신호를 보여주는 이미지; Ai9 마우스 (상단)와 VGAT 비너스 마우스 (하단)의 비너스. 축척 막대 = 5mm. (B) NexCre에서 코 티코-해 마의 해리 된 세포의 TdTomato와 금성 형광의 강도 산 점도 플롯; Ai9 마우스 (상단)와 VGAT 비너스 마우스 (하단). 강하게 형광 TdTomato 또는 비너스 뉴런을 선별 (게이팅 박스에 의해 표시) 하도록 선택 하였다. (왼쪽) 정렬 된 TdTomato (상단) 및 금성 (바닥) 긍정적 인 뉴런의 공초점 이미지. (C, 오른쪽) DAPI (파란색 의사 색상)와 공동으로 얼룩진 셀을 보여주는 병합 된 이미지입니다. TdTomato 형광 내 생 이며 고정에도 불구 하 고 강한 남아 (마젠타 의사 색). 금성 발현은 GFP 및 알 렉 사 Fluor-488-공액 이차 항 체 (녹색 의사 색)에 대하여 지시 된 일차 항 체의 조합을 사용 하 여 향상 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: 정제 된 glutamatergic 또는 GABAergic 뉴런의 세포 배양. (A) 결합 된 적외선 (밝은 필드) 이미지와 TdTomato (왼쪽)와 비너스 (우측)에서 형광 신호를 중첩 하 여 시험관 내에서 1 시간 동안 배양 하였다. 백색 화살표는 성장 하는 신경의 위치를 나타낸다. (B) 양성 뉴런의 TdTomato (left) 및 비너스 (우측)의 공초점 이미지를 시험관 내에서 1 시간 동안 배양 하였다. (C, D) 밝은 필드 (상단)와 TdTomato (C) 및 금성 양성 뉴런 (D)의 결합 된 밝은 필드 및 형광 이미지를 시험관 내에서 7 일 동안 배양 하였다 (DIV). 흰색 화살표는 죽은 세포에서 응축 된 핵의 위치를 보여줍니다. 유색 화살표는 형광 표지 뉴런을 식별 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: 정제 된 뉴런의 형태학 적, 전기 생리학적 및 시 냅 스 성질. (A, B) TdTomato (A) 및 비너스 포지티브 뉴런의 공초점 이미지는 각각 13 및 14 div에 있다. 셀은 신경 세포 시각화를 돕기 위해 거꾸로 된 룩 업 테이블을 사용 하 여 검은색으로 표시 됩니다. Insets는 확인 된 뉴런에 의해 발현 되는 형광 신호를 보여준다. (C, D) TdTomato (C)와 비너스 포지티브 뉴런 (D)에서 하이퍼 편광 (200 pA, 20pa 스텝) 및 전 셀 패치 클램프 레코딩에의 한 디 편광 (200 pA) 전류 펄스 로부터의 전압 응답. Insets는 상응 하는 기록 된 뉴런을 보여줍니다. 각 셀의 휴식 막 전위는 기록 추적의 왼쪽에 표시 됩니다. (E) 대표적인 전압-클램프 레코딩 (10 초) 및 비너스 포지티브 뉴런 (F)에서 얻어진 다. 자발적인 흥분 성의 후 시 냅 스 이벤트 (EPSCs)는 TdTomato 양성 뉴런에서 기록 되었다, 50 mV의 유지 잠재력에 유지. 자발적으로 발생 하는 억제 후 시 냅 스 이벤트 (IPSCs)는 0mv의 유지 전위에서 유지 되는 금성 양성 뉴런 으로부터 기록 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4: 신경 교 공동 배양을 통한 신경 발달 지원. (A) 신경 교 세포의 면역 표지 된 신경 교 배양 물 (gfap, 좌측), 분화 분자 (CD11b, 중) 및 마이 엘 린 염기 단백질 (MBP)에 대 한 공초점 이미지. 신경 교 세포는 7 DIV를 위해 배양 하였다. (B) 세포 배양 삽입물의 이미지는 비 접촉 배열에서 정제 된 뉴런을 갖는 신경 교 세포를 공동 배양 하는 데 사용 된다. (C) 신경 세포와 글 리아를 공동 배양 하는 데 사용 되는 공간적 배열의 개략. (단, E) 신경 교 지원의 부재 (왼쪽) 또는 존재 (우측)에서 14 일 동안 성장 한 TdTomato (D) 및 비너스 포지티브 뉴런 (E)의 공초점 이미지. (F, G) TdTomato (F)의 전류-클램프 기록 (60 s)과 금성 양성 뉴런 (G)은 신경 교 지원의 부재 (위) 또는 존재 (바닥)에서 14 일간 배양 하였다. 뉴런은 그들의 휴식 막 전위 (각 기록 추적의 왼쪽에 제시)에서 기록 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

우리는 여기에 정제 된 신경 세포 배양 물을 생성 하기 위해 일차 뉴런의 선별 및 배양을 결합 하는 방법을 설명 합니다. 이 방법은 일반적인 일차 해리 된 뉴런 배양 프로토콜 보다 약 1 시간 이상 소요 되지만, 특정 뉴런 유형을 포함 하는 수백 개의 복제 배양을 생성 하는 것을 허용 한다. 정제 된 뉴런은 적어도 16 일 동안 단독으로 성장할 수 있으며, 축 삭과 모 수석을 연장 하 고 활동 전위의 반복적인 기차를 발사할 수 있습니다 (그림 2 와 그림 3). 중요 하 게는, 이들 세포는 전기 생리학적, 형태학 적 및 생존 분석을 포함 하는 규칙적인 일차 해리 된 뉴런 배양 물과 동일한 실험적 분석을 가능 하 게 한다. 이러한 정제 된 배양 물에 대 한 작업의 주요 이점은 특정 세포 유형의 개발이 단독으로 연구 될 수 있다는 것 이다. 정제 된 배양 물의 개발을 지원 하기 위해, 우리는 또한 신경 교 세포와 정제 뉴런을 공동 배양 하기 위한 프로토콜을 제시 한다. 이전에 나타난 바와 같이, 신경 교 세포로 정제 된 뉴런을 공동 배양 하 여 생존 율을 높이고, 성장을 촉진 하 고, 네트워크 형성⁷ 을 촉진할 수 있다 (도 4). 따라서, 우리는 여기에 글 리아-신경 상호 작용의 연구를 추가 해야 하는 방법의 조합을 제시 하 고 관심의 다른 세포 유형의 개발 및 상호 작용을 연구 하는 데 유용 증명할 수 있습니다.

정제 된 glutamatergic 뉴런의 배양에 관한 연구는 신경 네트워크 및 시 냅 스 형성의 발달을 촉진 하는 신경 교 세포 인자를 분 비 하는 방법에 대 한 근본적인 통찰을 밝혀 내었다^16,17,18 . 일반적으로 특정 뉴런 유형을 정화 하는 방법은 GABAergic 뉴런 보다는 glutamatergic 뉴런의 개발을 연구 하는 데 더 성공적으로 적용 되었습니다. 이것은이 두 세포 유형이 어떻게 발전 하는지에 대 한 우리의 이해에서 차이를 이끌어 냅니다. GABAergic과 glutamatergic 뉴런은 해부학, 생리학 및 발달 기원 측면에서 크게 차이가 나는 것을 감안할 때, 우리는 그들의 기능과 생리학을 더 잘 이해 하기 위해 자신의 권리로 GABAergic 뉴런을 연구 하는 것이 중요 합니다. 여기에 제시 된 프로토콜을 사용 하 여, 우리는 이전에 GABAergic 및 glutamatergic 뉴런은 시 냅 스 전송⁷의 확립에 대 한 글 리 분 비 요인에 의존 하는 방법에 중요 한 차이점을 확인 했습니다. 이 프로토콜을 게시 함으로써 우리는 다른 사람들이 뉴런 및 신경 교 세포 사이의 중요 한 상호 작용에 대 한 더 많은 통찰력을 얻을 수 있기를 바랍니다.

이 프로토콜에서, 우리는 다른 형질 전환 설치류 라인에서 GABAergic 또는 glutamatergic 뉴런을 정제 하는 데 사용 하는 유 세포 분석 기반의 세포 선별 방법을 설명 합니다. 비너스 포지티브 GABAergic 뉴런은 VGAT 금성 마우스 (¹³ ) 또는 쥐 (⁸ )와 tdtomato 양성 glutamatergic 뉴런 으로부터 정렬 되어 nexcre 로부터 정렬 되었다; Ai9 마우스 (NexCre⁹ 및 Ai9 리포터 라인⁶에서 원래 사육, 2018⁷)를 참조 하십시오. 최근 몇 년 동안, 기술 발전으로 인해, 형질 전환 동물의 생성이 현저 하 게 쉬워진다. 따라서 형광 분자를 발현 하는 동물의 가용성은 다양 한 세포 유형에 서 급격히 증가 하 고 있습니다. 이것은, 차례로, 형광 활성화 한 세포 분류의 사용 그리고 적용 성을 증가 시켰습니다. 관심 있는 세포를 분리 하는 대안적 방법은 현재^16,19,20이 존재 하지만, 자연적으로 발생 하는 표면에 대 한 적절 한 항 체의 가용성에 대 한 의존성에 의해 다소 방해 된다 항. 이것은 이미 유효한 많은 세포 특정 형질 전환 리포터 동물에서 세포를 분류 하기 위하여 이용 될 수 있는 형광 근거한 세포 분류 방법과 비교 될 때 그들의 다양성을 제한 합니다. 그럼에도 불구 하 고 최적화 된 항 체 기반 선별 방법은 신속 하 고 높은 항복이 가능 하며, 축 삭과 모 수석으로 세포를 정제 할 수 있게 함으로써 세포 해부학을 더 잘 보존 할 수 있습니다²¹. 따라서 선별 전략을 결정할 때 항 체 선별 방법이 여전히 고려 되어야 합니다. 궁극적으로, 관심의 세포 유형, 세포가 정렬 되어야 하는 나이, 형질 전환 동물 또는 표면 항 원의 가용성 및 필요한 세포 수는 가장 적합 한 선별 전략을 선택할 때 결정적인 요인이 될 것 이다.

형광 기반 세포 선별은 세포를 정화 하는 간단 하 고 재현성 있는 방법 이지만, 세포 품질을 유지 하기 위해서는 프로토콜의 특정 단계에서 주의를 기울여야 합니다. 예를 들어, 각각의 원심 분리 단계에 따라, 세포 펠 렛이 가능한 한 빨리 재 현 탁 되 고 세포가 성공적으로 회복 되었는지 확인 하는 것이 중요 합니다. 때때로, 상 등 액을 제거할 때 세포 펠 렛이 교란 될 수 있다. 따라서 원심 분리 단계 사이에서 현미경으로 세포의 존재를 확인 하 여 광범위 한 세포 손실을 배제 하는 것이 좋습니다. 세포 도금 후에, 세포는 먹이 기 전에 적어도 1 시간 동안 고착 하는 것이 허용 되어야 합니다. 세포가 너무 빨리 공급 되 면 일부 세포가 커버 슬립에서 빠질 수 있으므로 배양 밀도가 감소 합니다. 배양 후 1 시간 후에는 세포 건강을 평가 하는 것이 좋습니다. 세포가 건강 하 게 나타나지 않는 경우 (건강 한 세포의 예가 도 2a에 도시 되어 있음), 또는 현저한 세포 사 멸이 있는 경우,이는 해리 또는 선별 과정 중에 문제의 징후 일 수 있다. 더 중요 한 고려 사항은, 임의의 세포 유형을 배양 할 때, 세포 배양 배지를 관리할 때 주의 하는 것 이다. NBA 미디어에는 pH 지시약²²로 작용 하는 페 놀 레드가 포함 되어 있습니다. 미디어가 너무 황색으로 되 면, 이것은 pH가 너무 산 성이 있음을 나타낸다; 미디어가 너무 분홍색이 되 면 용액이 너무 알칼리 성 임을 나타냅니다. 스톡 솔루션은 오랜 기간 동안 개방, 특히 원추형 튜브에 인용 된 미디어는 시간이 지남에 따라 더 알칼리 성이 되는 경향이 있습니다. 그것은 따라서 매주 신선한 완전 한 NBA 미디어를 구성 하는 것이 좋습니다 매 2 주마다 전체 미디어 (대기 조건에서 중간 버퍼 따라서 더 안정적 이어야 한다). 이러한 점을 고려 하 여 세포 선별 및 세포 배양 장비에 액세스 할 수 있는 모든 실험실에서 정제 된 세포 배양을 확립 할 수 있어야 합니다.

우리의 실험의 대부분에서 우리는 단일 동물에서 정제 된 문화를 생산. 그러나 생화학 적 분석을 위해 세포를 정화 할 때 분류를 위해 여러 동물을 함께 풀 해야 할 수도 있습니다. 우리는 위의 프로토콜을 사용 하 여 8 배아 마우스 (배아 날 13 마리의 동물)까지 성공적으로 정렬 했습니다 (데이터는 표시 되지 않음). 그러나, 더 많은 동물이 정렬 될 경우, 조직 양의 증가를 수용 하기 위해 파파 인 및 BSA 용액 (2.1.4 단계에서 설명)의 부피를 증가 시킬 필요가 있을 수 있다. 추가적으로, 더 많은 세포가 문화에서 도금 되는 경우에, 더 빈번한 먹이 일정은 요구 될 수 있습니다. 시작 점으로 서, 세포는 컨디셔닝 된 미디어의 100 µ L을 제거 하 고 신선한 완전 한 NBA 미디어의 200 µ L을 추가 하 여 7 일 마다 공급 될 수 있습니다. 신경 생존을 위해, 더 많은 동물을 분류 하는 경우, 가능한 한 많은 정렬 시간을 최소화 하기 위해 생각 해야한다. 이는 정제 된 세포를 효율적으로 사용 하기 위해 다운스트림 분석을 신중 하 게 최적화 해야 하는 경우가 많습니다. 우리는 600 이벤트의 속도로 마우스 뉴런을 일상적으로 분류 했으며, 동물 당 최대 500000-800000 세포 (출생 후 0 ~ 2 일)에 해당 합니다. 그러나, 이것은 정렬 속도 및 조건의 철저 한 최적화 없이 했다. 따라서 정렬 속도 및 수율의 추가 개선이 가능 해야 합니다.

정제 된 뉴런은 생존을 위해 글 리아 컨디셔닝 미디어가 필요 합니다. 이는 신경 교 컨디셔닝 배지¹⁰으로 뉴런을 치료 하기 전에 뉴런 및 신경 교 세포를 별도로 배양 하 여 이전에 입증 되었다. 우리의 실험에서, 우리는 세포 배양 접시 내부에 배치 되는 반 투과성 세포 배양 삽입물에 신경 교 세포를 배양 하 여 정제 된 뉴런을 지원 하기로 결정 했습니다. 이 방법은 신경 교 유래 세포 외 기질 단백질과 뉴런 (¹²)과의 상호작용을 연구 하기 위해 성공적으로 적용 되었다. 이러한 방법에 의해 제공 되는 비 접촉, 연속 지 지체는 세포의 별개의 배양 물에 비하여 많은 장점을 가진다. 가장 주목할만 하 게, 신경 교 세포의 공동 배양은 생체 내 상황을 더욱 유사 하 게 하는 세포 배양 배지를 지속적으로 조절 하 고 컨디셔닝 할 수 있게 한다. 또한, 세포의 연속적인 공동 배양은 분리 된 배양 물에서 불가능 한 신경 세포와 글 리아 사이에 잠재적인 피드백 시그널링을 허용 한다. 우리의 프로토콜에서, 필요 하다 면, 연속적인 공동 배양 방법은 쉽게 생략 될 수 있고 글 리아 컨디셔닝 배지를 갖는 뉴런의 고전적 치료가 수행 될 수 있다.

요약 하자면, 여기에 제시 된 프로토콜은 독자에 게 자신의 정제 된 세포 배양 실험을 확립 할 수 있는 견고한 기초를 제공 하는 것을 목표로 합니다. 우리는 형질 전환 동물 및 바이러스 성 작 제물이 예측 가능한 미래를 위해 계속 증가할 것 이라는 것을 예상 합니다. 따라서 형광에 기초한 세포 선별 기술은 더욱 널리 사용 되 고 가치 있게 될 가능성이 있다.

저자는 경쟁 하는 재정적인 이익이 없다는 것을 선언 합니다.

저자 들은 제니 키 쉬와 아나 테이 뮬러가 제공 하는 우수한 기술 지원에 대해 감사 하 고 싶다. 유 세포 분석 핵심 시설, 도이체스 레 우 스, 베를린. 생존 분석에 대 한 도움을 주셔서 감사 드립니다. 또한, 리 타 Loureiro에 게 그 프로토콜의 중요 한 판독을 위해 형광 마우스와 크리스티안 Ebner의 이미지를 포착 하는 데 도움을 주셔서 감사 하 고 싶습니다. VGAT-비너스 트랜스 제 닉 쥐는 일본의 생리 과학 연구소에서 pCS2를 사용 하 여,이 야 나가와 키 박사에 의해 생성 되었다. 이 작품은 독일 연구 위원회에 의해 지원 되었다 (도이치, DFG EXC 257에 IV).