생체 외에서 피부 세포 마이그레이션에 비소의 효과 설명 하기 위해 분석 결과 스크래치

이 연구는 상처 치유 (스크래치 분석 결과의) 메커니즘으로 비소 영향 세포 마이그레이션 등 어떻게 환경 오염 물질을 결정 하기 위한 생체 외에서 모델에 중점을 둡니다. 결과이 체 외 분석 결과 제공 신속 하 고 초기 징후 vivo에서 실험 전에 셀룰러 마이그레이션에 대 한 변경 하는 방법을 보여 줍니다.

상처 치유의 생리 적인 메커니즘을 이해 몇 년 동안 지속적인 연구의 초점 되었습니다. 이 연구는 직접 임상 표준 상처 치료 및 환자에 대 한 병 적 상태와 사망률 감소에 대 한 사용에 변화를 변환 합니다. 상처 치유 전략적 세포 및 조직 상호 작용 및 기능을 요구 하는 복잡 한 프로세스입니다. 상처 치료의 많은 매우 중요 한 기능 중 하나는 개인 및 집단 셀룰러 마이그레이션입니다. 부상 시 빠르게 연결, 그리고 상피 조직 주변 혈액에서 다양 한 세포 화학 및 물리적 자극을 통해 상처 사이트에 마이그레이션합니다. 이 마이그레이션 응답 결과 상처를 치유의 성공에 크게 지시 수 있습니다. 이 특정 세포 기능을 이해 하는 것은 변환 약 치료 결과 향상 된 상처로 이어질 수 있는 중요 합니다. 여기, 우리는 상처 치유, 그리고 어떻게 세포 환경에 변경 내용을 크게이 과정을 변경에 관련 된 세포 마이그레이션 이해 하는 데 사용 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이 예제에서는 연구, 피부 섬유 아 세포 단층 문화 조직 배양 플라스 크에로 미디어 소 태아 혈 청 (FBS)와 보충에서 성장 했다. 셀 aseptically 취급 하는 조직 문화 12-잘 접시로 전송 되었고 100% 합류로 성장. 합류에 도달, p200 피펫으로 팁을 사용 하 여 셀은 단층에 긁힌 수직으로 했다. 비소 문화 미디어 FBS와 보완에 희석에 추가 되었습니다 개별 우물에서 환경 관련 복용량 0.1-10 M. 이미지까지 거꾸로 가벼운 현미경 관찰 셀룰러 마이그레이션 (상처를 사용 하 여 24 시간 기간 동안 모든 4 시간 (h)를 점령 했다 폐쇄)입니다. 이미지, 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 분석 개별적으로 되었다 및 % 상처 폐쇄 계산 했다. 결과 비소 상처 치유 감속 하는 방법을 보여 줍니다. 이 기술은 상처 치유에 오염 물질의 효과의 평가 대 한 신속 하 고 저렴 한 첫 번째 화면을 제공합니다.

상처 치유 단계를 포함 하는 다양 한 세포 유형, 신호 분자 및 세포 외 매트릭스 구성 요소¹중복의 복잡 한 일련의 구성 됩니다. 함께, 이러한 구성 요소는 상처 해상도 또는 외상¹의 정도 따라 보호 fibrotic 흉터의 형성에 이르게 궁극적으로 복구를 달성 하기 위해 콘서트에서 작동. 개별 프로세스와 상처의 기능을 하나의 실험에서 치유 어렵습니다; 상처 치유 과정에서 각 단계 확인을 별도로 테스트 해야 합니다. 상처 치유의 여러 단계 중 세포 마이그레이션 프로세스 간주 되었습니다 중요 한 치유 속도²를 평가할 때. 세포질 마이그레이션 상처 치유의 모든 단계에서 관찰 될 수 있다 하 고 따라서 더 셀 마이그레이션 변경 상처 폐쇄 영향을 미칠 수 어떻게의 이해를 필요로. 예를 들어 셀룰러 마이그레이션 모두 초기 및 늦은 단계 염증, 상처 사이트³에서 혈액 응고와 혈소판 집합에에서 표시 됩니다. 이 이벤트는 조직³없는 부 상자 영역을 채우기 위해 임시 방해를 형성 하 여 과도 한 혈액 손실 방지. 순환에서 혈소판 합성 하 고 분 비 혈 요인, 마이그레이션용 염증 성 백혈구 (백혈구)에 대 한 상처 조직에는 함께 신호 수리⁴함께 vasoactive 중재자. 다시 epithelialization 조직 부상의 시간 이내 발생 하 고 취재 활동 및 더 오염을 방지 하기 위하여 상피 keratinocytes의 마이그레이션 또는 상처 사이트²외국 입자의 침공을 통해 상처 사이트 포함. 이러한 예제는 많은 셀 마이그레이션 기능 관련 된 몇 가지 상처 치유만 캡처.

스크래치 분석 결과 설명 되었고 셀 마이그레이션 및 상처 치유^5,6에 그것의 많은 역할을 더 잘 이해 하는 데 사용. 이 분석 결과 단순한 것으로 간주 됩니다, 높은 처리량을 제공 하 고 대표 셀 마이그레이션 데이터를 수집 조사 수 있습니다. 마이그레이션 분석 실험은 특정 화합물 가속 수 있습니다 또는 셀룰러 마이그레이션⁶의 속도 느리게에 성공적으로 설명 했다. 또한, 이러한 분석 결과 농도, vivo에서 실험 전에 관심의 유전자를 주입 하는 대상 치료를 공식화 하는 데 사용할 수 있는 변환 생리 정보를 제공 합니다. 분석 결과 기본적인 세포 문화 기술 및 용품, 선택, 및 이미징 기술을 운동 시간이 나 운동 치료에 대 한 응답에서을 통해 캡처의 셀 라인 필요 합니다.

분석 결과 쉽게 조작 하거나 탐정의 요구에 맞게 맞춤 될 수 있습니다. 그러나, 실험 하기 전에 고려해 야 할 4 개의 기본적인 질문 있습니다. 어떤 일반 또는 특정 질문은 /는 외관이 대답 하려고? 이 연구를 주도 대부분 가설에 대 한 진정한 보유 하 그러나,이 분석 결과에 중요 한 때문에 이다 그것은 결정할 것입니다 많은 매개 변수에 정확 하 게 하는 데 필요한 완전히는 질문 대답 무슨 선 세포 또는 (해당 되는 경우 여러) 라인 셀 공부 되 고 생리 시스템을 표현 하기 위해 사용 해야 합니까? 예를 들어 치유 연구, 피부 섬유 아 세포^5,,67,⁸, 줄기 세포 피부에 상처 또는 표 피 keratinocyte⁹ 일반적으로 발견 되는 세포 인구를 대표 하는으로 간주 될 수도 에 피부 조직¹⁰에서 풍부. 또는, 호 중구, 대 식 세포 또는 다른 염증 세포 수 평가 셀 마이그레이션 상처 치유 피부 조직¹⁰의 다른 구성 요소를 나타내는 데이 시스템. 또한,는 시 약은 세포 신진 대사 활동을 촉진 하는 데 사용할 최적의 식별 하는 데 도움이 됩니다 평가 특정 셀 라인을 식별. 어떻게 셀 이동 추적/몇 군데 있을 것인가? 셀 마이그레이션 접시 또는 플라스 크 내에서 관찰 하는 데 사용 하는 기술도 많습니다. 염색 또는 붙일 셀 태그를 사용 하 여 형광 또는 confocal 이미징 셀 추적 세포 대 세포 비 위치 및 세포질 운동^{11 명확 하 게 정의 하는 탐정을 수 있는 강한 대조를 제공 하는 예를 들어} . 이 연구에서 설명 하는 또 다른 일반적인 기술은 위상 대비^6,7거꾸로 가벼운 현미경의 사용 이다. 셀 염료 및 형광이이 대안 말기 이미징 이전 셀을 수정 하지 않고 트랙 셀 사는 사용자 허용 하 고 개별 우물 시간 지점에서 셀의 부상된 monolayers를 포함 하는 동일의 이미지를 캡처 수 있습니다. 어떤 결과 측정 하는 것은 분석에 사용할 수 것입니다? 연구를 통해 모여 이미지를 사용 하 여 셀룰러 마이그레이션 속도 변화를 이해할 수 있는 데이터를 생성할 수 있습니다. 우리 실험실에서 현미경 이미지 반전된 가벼운 현미경에서 캡처한 이미지 분석 소프트웨어를 업로드 하 고 백분율 상처 폐쇄 및 곡선 (AUC) 아래 요약된 영역 계산 됩니다.

우리는 알려진된 환경 오염 물질, 비소의 피부 섬유 마이그레이션 변경 내용을 명료 하이 분석 결과의 구체적인 사용 강조 표시 됩니다. 비소는 자연스럽 게 발생 준금속 지구의 표면에서 발견. 다양 한 위치 비소, 이러한 위치 근처에 사는 개인에 게 위험이 높은 수준의 발견 되었습니다. 결과적으로, 음식과 물 소스 비소 오염, 비소에 노출 되는 개인에 대 한 가능성을 증가의 레벨을 증가 표시 되었습니다. 환경 비소 노출 위 또는 심지어 아래 현재 미국 환경 보호 기구 (USEPA) 최대 오염 물질 수준 (MCL) 10 ppb (10 µ g/L)^12, 의 인구에 장기 건강 결과가지고 표시 되었습니다. ¹³.이 제한을 초과 하는 비소 농도 USEPA는이 MCL을 설정 하 고 그것을 마시는 한계에 대 한 안전한 것으로 간주, 비록 전세계 물 소스에 흔히 되지 않습니다. 남서 미국에 수많은 지 하 수, 우물 물, 그리고 스프링 비소¹⁴의 수준에 관한 포함 하도록 문서화 되었습니다. 예를 들어 베르데 밸리, AZ, 몬테 주 마 잘 비소¹⁵의 210 µ g/L를 포함합니다. 베르데 강, AZ 주위 지 하 수는 1.3 mg/L^15,16를 도달 하는 피크 값 평균, 비소의 16 µ g/L를 포함 합니다. 특히, 베르데 강 물 창 고에 많은 스에서 비소 농도 초과 50 µ g/L^15,16. 이 지식으로, 환경 관련 비소 농도 했다 10 µ M (750 ppb) 현재에에 MCL 위에 연구^14,,1516 MCL 0.1 µ M (7.5 ppb)에 그 범위를 선정 ^{, 17 , 18 , 19 , 20} _.

이 실험에서 수집한 정보 비소로 오염 된 셀룰러 마이그레이션 속도는 비보에 상처에서 잠재적인 변화의 초기 표시기로 사용 됩니다. 그 후, 상처 치유와 세포 이동 촉진의 역할에 따라 신호 분자를 선택할 수 있습니다. 그리고 미래의 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) 기반 유전자 식 실험 전류에의 완료에 따라 설정할 수 있습니다. 연구입니다. 이 분석 결과에서 마이그레이션 속도 변경 비소의 존재, 특정 유전자 목표 세포 마이그레이션에 관련 된 비소의 해로운 효과 대 한 대상 수 있으며 따라서 장애의 메커니즘을 수 있습니다.

1. 2 차 Biosafety 내각 (BSC)의 준비

참고:이 프로토콜에서 설명 하는 방법 무 균 기술을 달성 하기 좋은 연구실 관행을 사용 하는 동안 개인 보호 장비와 함께 실시 한다.

1. BSC 보호 유리 운영 높이를 들어올린 층 류 팬 들을 켭니다.
   1. 70% 소 프로 파 놀 용액을 사용 하 여 작업 영역의 위생 닦아 수행. 뒤쪽 벽 및 측 벽에서 BSC를 닦 고 기본 격판덮개로 작동.
   2. 모든 자료를 70% 알코올 (소 프로 파 놀 또는 EtOH) 분석 결과에서 사용 될 것 이다 하 고 BSC 안으로 넣어 닦아.

2. 인간 피부 섬유 아 세포 T75 플라스 크에 뿌리기

1. 원하는 cryopreserved 셀 라인 (신생아 인간 피부 섬유 아 세포 [hDFn], 500, 000 셀/유리병, 셀 농도 통로 p3-p5) 튜브를 얻을.
   1. 셀과 유리병 녹고 있도록 37 ° C에서 1.0 cm 깊은 물 욕조에 배치 합니다. 유리병을 녹여 셀 솔루션의 약 70% 액체 때까지. 70% 알코올로 유리병 아래로 닦 고 유리병 랙 BSC 내부에서 유리병을 배치.
      주: 물 않는 스레드 또는 시드 셀 동안 잠재적인 오염을 방지 하기 위해 유리병의 뚜껑 접촉 하지 확인 하십시오. 물에 셀의 완전 한 녹고 방지 목욕으로 이렇게 하지 않으면 의도 하지 않은 세포 죽음을 발생할 수 있습니다.
2. 미디어의 10 mL에 밖으로 그리기 보충 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS). 사용 하 여 자동 pipettor 10 mL 피 펫 팁 T75 조직 배양 플라스 크로 발음을. 미디어 완전히 부드럽게 앞뒤로 플라스 크를 흔들어 하 여 플라스 크의 포화를 허용 합니다.
   1. 세포 막으로 되는 pipetting 속도 유리병에서 셀 주식 및 aspirate 솔루션 오픈 유리병 cryopreservation 취약 될 것입니다.
   2. 미디어 T75 조직 플라스 크에 세포를 전송. 다시 되는 pipetting 속도 조직 플라스 크에 해 동된 셀을 꺼냅니다.
      참고: 6600 셀/c m²로 직선 근사 줄은 시드 조직 플라스 크에 세포의 밀도. 밀도 시드 사용자와 실험의 원하는 타이밍에 맞게 변경할 수 있습니다.
   3. T75 조직 플라스 크에서 미디어의 1 mL에 밖으로 측정 하 고 다시 유리병에 볼륨을 전송. T75 플라스 크에 다시 유리병에서 볼륨을 전송.
      참고: 유리병에서 셀 수확량을 확대 하는 데 도움이 됩니다이 단계를 수행.
   4. 조직 배양 플라스 크 모자를 강화 하 고 부드럽게 전체 표면에 걸쳐 균일 하 게 분산 된 셀 서 스 펜 션에 바위. 거꾸로 현미경을 사용 하 여 셀의 분배를 확인 합니다.
3. 셀 유형, 날짜와, 이니셜, 혈통, 목적 플라스 크 레이블 (예:hDFn, 07/11/2018, 국방, 통로 4, 비소 스크래치 분석 결과). 72 h에 대 한 37 ° C와 5.0% CO₂ 습도 인큐베이터에 조직 배양 플라스 크를 배치 합니다.
   참고: 성장 매체 변경된 12 24 h 후 초기 시드 cryopreservative, 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 상당량을 제거 하 고 셀 영양 제대로 되도록 그 후 모든 48 h를 변경. 부 화와 성장 기간 스크래치 시험에 필요한 셀의 계산된 수에 따라 달라 집니다. HDFn 셀에 대 한 복제에 일반적으로 정상적인 조건 하에서 16-24 h. 그러나, 두 배로 속도 상승, pH, 온도, 습도, 중간 유형, 등으로 인해 변경 될 수 있습니다 및 실험을 계획할 때 설명 되어야 합니다.

3. 셀 계산 및 12 음 조직으로 하위 문화 접시

1. 인큐베이터에서 T75 조직 배양 플라스 크를 검색 합니다. 10 배 목표 확대 (100 X 총 확대)에 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 준수 세포를 관찰 하 고 대략적인 셀 합류를 결정.
   1. 접근은 관찰 하는 가장 대표적인 비율을 보장 하기 위해 합류 하는 때 조직 배양 플라스 크의 대부분을 검사 합니다. 개별 셀 형태학 어떤 이상이 나 세균 및 곰 팡이 오염에 대 한 평가.
2. 10 mL 피 펫 팁 자동 pipettor 조립. Pipettor를 사용 하 여 폐기물 컨테이너 T75 및 전송 솔루션에서 미디어의 전체 볼륨을 발음. 세포 접착 표면 접촉에서 피펫으로 팁을 방지 합니다. 생물 학적 빈에서 피 펫 팁을 버리십시오.
   1. 5 mL 피 펫 팁 자동 pipettor 조립. 균형된 소금 솔루션의 5 mL을 발음, 플라스 크에 분배 하 고 부드럽게 초과 미디어, 죽은 세포, 및 폐기물 제품 린스를 플라스 크 락.
   2. 볼륨은 T75에서 그리고 폐기물 콘테이너로 분배. 생물 학적 빈으로 피 펫 팁을 삭제 합니다.
   3. 5 mL 피 펫 어댑터 자동 pipettor 조립. 재고에서 트립 신 2 mL를 발음, 플라스 크에 분배 하 고 부드럽게 준수 셀 동안 효소를 분산 플라스 크 락. 부착 표면의 완전 한 채도 확인 합니다. 2-3 분 (분) 동안 인큐베이터에 조직 플라스 크를 놓습니다.
      참고: 최대 효소-기질 반응 10 분 초과 하지 않아야 합니다.
   4. 10 X 렌즈 배율 (100 배 총 확대)에 거꾸로 현미경 조직 플라스 크를 관찰 합니다. 부드러운 진동 세포 분리를 촉진 하기 위해 적용 됩니다.
   5. 70% 알코올 및 BSC 내부 장소 T75 플라스 크를 닦아냅니다.
   6. 5 mL 피 펫 팁 자동 pipettor 조립. 주식에서 미디어의 5 mL을 발음 하 고 효소-기질 반응을 중지 하 T75 조직 플라스 크에 추가 합니다. 미디어: 트립 신 비율 3:1 이어야 한다. 플라스 크의 위아래로 피펫으로 2-3 회 린스와 반응 중지 되었습니다 확인 하십시오. 플라스 크를 살 균 15 mL 원뿔 튜브로 전송 액체의 완전 한 볼륨 발음
   7. 두 번째 15 mL 원뿔 튜브를 미디어의 동일한 볼륨을 채우십시오.
   8. 서로 대척점 위치에 모두 15 mL 원뿔 튜브를 배치 합니다. 25 ° C에서 5 분 동안 원심력의 200 g 장비의 실행 매개 변수를 설정 하 여 적용 됩니다.
   9. 15 mL 원뿔 튜브 수송과 세포 70% 알코올로 닦 고 BSC 안으로 배치.
   10. 자동 pipettor를 사용 하 여 미디어, 액체 및 셀 펠 릿의 약 250 µ L을 남겨두고 떨어져 피펫으로에 5 mL 첨부. 피펫으로 팁의 위치에 주의 셀 펠 릿은 그대로 유지 됩니다. 폐기물 용기에 수집 하는 볼륨을 분배 하 고 생물 빈에서 팁 삭제.
   11. Microcentrifuge 튜브 랙을 사용 하 여 방해 하 고 다시 셀 펠 릿 ("긁어 랙"이 라고도 함)을 일시 중지를 빠른 진동 만드는 유리병 슬롯에 걸쳐 원뿔 튜브의 하단 실행.
       참고:이 단계를 수행 하는 소용돌이 믹서를 사용 하지 마십시오. 중력 힘 소용돌이 믹서에 의해 만들어진 셀 g-포스 임계값을 초과 하 고 lysing 발생할 수 있습니다. 올바르게 완료 되 면 새로운 셀 솔루션 없이 나머지 펠 릿으로 흐린 혼합으로 표시 됩니다. 이 단계를 수행 하는 실사 자주 단일 세포 현 탁 액을, 셀을 계산 하는 경우 높은 정확도로 이어지는 만들어집니다.
   12. 셀 주식 또는 물의 resuspension 미디어의 2 개 mL를 추가 합니다. 피펫으로 튜브 20의 측면 아래로 부드럽게 셀 모든 대단히 짧은 시간을 휴식 시간. 총 셀 서 스 펜 션 볼륨을 기록 하 고 정해 짧게.
3. 피펫으로 20 µ L Trypan 블루 재고 (0.4%) 96 잘 접시의 빈 우물에 살 균 피펫으로 사용 하 여.
   1. 전송 전에 균일 한 세포 현 탁 액을 생성 하기 위해 재고 셀 솔루션을 믹스. 피펫으로 멸 균 팁을 사용 하 여 셀 주식 (튜브 벽을 만지고 피)의 20 µ L를 제거. Trypan 블루 솔루션 96 잘 접시에서의 20 µ L를 추가 합니다.
   2. 피펫으로 내용을 혼합을 부드럽게입니다. 피펫으로 10 µ L는 coverslip 세기 사이 혼합물의 챔버는 hemocytometer에.
   3. 전지와 10 X 목표 아래 표를 준수 합니다. 보기의 필드 내에서 9 개의 큰 사각형을 관찰 합니다. 중앙에 4 모서리 사각형 (5 사각형의 총)만 셀을 계산 합니다.
      참고: 셀의 균일 한 분포에 대 한 정확한 조사를 위해 전체 그리드에 걸쳐 보세요.
   4. 집계에 5 확인 된 사각형 모눈의 모든 셀 (투명 하 고 청색). 별도로, 같은 5 사각형에 미달 (파란색) 셀만 집계.
   5. 계산 가능한 셀 수를 사용 하 여:
      여기서 x = 실행 가능한 세포 수, 한 총 세포, b = = 비 가능한 셀
   6. 사용 하 여 실행 가능한 세포 밀도 계산.
      여기서 x = 가능한 셀 밀도 y 가능한 셀의 총 합계 =.
   7. 총 실행 가능한 세포를 계산.
      여기서 x 총 가능한 셀, y = 가능한 세포 밀도, f = = 셀 서 스 펜 션 볼륨 (mL).
   8. % 세포 생존 능력 계산:
      어디 x % 세포 생존 능력, y = = 그리드, f 에 계산 가능한 셀 = 총 셀 격자 계산.
4. 아래쪽 이미징 동안 참고 표 역할을 12-잘 접시의 가로줄을 표시 합니다.
   1. (3.3.7 계산) 가능한 셀 밀도 사용 하 여 계산 시드의 12 음 조직 문화 접시에 셀 주식 희석 미디어의 볼륨.
      참고: 최적의 셀 hDFn 셀 밀도 시드 5000 셀/c m²입니다.
   2. 19000 셀/mL을 셀 주식 희석 미디어를 사용 하 고 셀의 1 mL와 잘 모든 씨앗. 주기적으로 모든 12 우물에서 시드도 셀 수 있도록 셀 주식 혼합.
   3. 셀 타입, 혈통, 사용자 이니셜 및 목적 각 접시를 레이블. 37 ° C와 5.0% CO₂로 설정 하는 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 셀 100% 합류 스크래치 분석 결과 대 한 달성 될 때까지 성장 하는 것을 허용 한다.

4. 비소 (로) 재고 솔루션 및 계산

1. 나트륨 arsenite (NaAsO₂) 10% 셀 문화 미디어에 직접 희석 작업 10, 1.0, 0.1, 0.01 µ M으로의 농도에서 FBS.
2. 이 위해 미디어의 30 mL에 나트륨 arsenite의 3.9 mg를 diluting 하 여 초기 1 m m 재고 솔루션으로 확인 합니다. 직렬 솔루션으로 나머지 1 m m 재고 희석.

표 1입니다. 비소 주식 그리고 직렬 희석입니다. 이 테이블 계산으로 재고 솔루션 및 치료 그룹에 대 한 재고 솔루션을 작업을 만드는 데 사용에 대해 설명 합니다.

5. 스크래치 시험 기술 및 비소 오염

1. 인큐베이터에서 셀 12-잘 접시를 가져옵니다. 객관적인 확대 (100 X 총 확대) X 10에 세포를 볼. 각 잘 내 셀 합류를 결정 합니다.
   참고: 각 개별 잘 해야 도착 긁 적 전에 100% 합류. 이 중요 한 단계 분석 결과 내에서 일관성을 보장 하 고 실험을 통해 분석 결과 프로토콜을 표준화 하는 데 도움이. 어떤 우물에 100% 합류에 도달 하지 않은 경우 추가 시간 모든 우물에는 100% 합류에 도달 했습니다 때까지 품 어를 셀 수 있습니다. 이미 100% 합류에 우물에 추가 성장 시간 영향을 받지 않습니다. Confluent 세포 성장 체포 될 일반적으로 되며 하위 confluent 웰 스 100% 합류에 도달 하면서 단층 문화로 남아 있다.
2. 10 mL 피 펫 팁 자동 pipettor 조립. 모든 우물에서 성장 미디어 발음 액체 폐기물에서 볼륨 및 생물 학적 빈에서 피 펫 팁 삭제 합니다.
   1. 1-200 µ L 멸 균 팁과 p200 pipettor 조립. 각 잘에서 글 라이 딩 팁 셀 표면에 걸쳐는 12-시에서 6 시 위치에 의해 처음 "모의 상처"를 생성 합니다.
      참고: 일관성에 크게 영향을 미칠 것입니다 3 요소는 속도, 압력, 및 팁 각도입니다. 스크래치를 신속 하 게, 일정 한 압력으로 체재 하는 접시의 베이스에 수직 팁 각도의 생각 되는 동안 수행 되어야 합니다. 너무 천천히 긁 적 비뚤어진된 라인 하면, 초과 압력 수 영구적으로 점수 셀 접착 표면 및 팁 각도 90 ° 스크래치 폭을 좁힐 것 이다 보다는 더 적은. 이러한 일반적인 실수 중 하나는 변경 된 마이그레이션 속도 패턴을 발생할 수 있습니다.
   2. 잘 당 균형된 소금 솔루션의 1 mL와 rinsing 여 멀리 초과 파편과 세포 덩어리 취소 합니다. 바위는 접시 사이드-투-사이드 세척을 촉진 하기 위하여. 우물에서 균형된 소금 솔루션을 제거 하 고 폐기물 컨테이너에 처분. 생물 학적 빈에 5 mL 피 펫 팁의 처분.

그림 1: 스크래치 분석 결과의 도식 대표. 모든 작업은 오염의 기회를 감소 하는 무 균 필드 내에서 수행 됩니다. 세포 조직 배양 플라스 크에 원하는 밀도에 씨를 뿌리고 있으며 인간의 생리 조건 (5% CO₂, 37 ° C)로 설정 하는 인큐베이터에서 성장. 도달 되 면 원하는 합류, 셀 aseptically 하위 교양 원하는 시드 밀도에서 12 음 조직 문화 접시에. 셀은 100 %12-잘 접시 및 살 균 피펫으로 팁을 사용 하 여 긁힌 각 우물에 합류에 성장 된다. 이 "처음" 생체 외에서 모의 상처를 (두 배 이끌린 화살표로 표시 됨), 있는 세포는 자연스럽 게 열려있는 영역을 마이그레이션할 만듭니다. 각 잘 수 있는 유일 하 게 단련 하 고 셀룰러 이동 요금을 관찰 하 고 다른 치료 조건에서 측정할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

3. 사용 하 여 p1000 pipettor 1000 µ L 팁 피펫으로 1000 µ L 비소 주식에서 치료 그룹으로 무작위로 할당 된 우물에. 각 잘 새로운 피펫으로 팁을 사용 하 여 교차 오염을 방지 하기 위해. 치료 추가 때 시간을 기록 합니다. 37 ° C와 5.0% CO₂에서 설정 하는 인큐베이터에서 12-잘 접시를 놓습니다.

6입니다. 영상

1. (0, 4, 8, 12, 16, 20, 및 24 h) 24 h 동안 객관적인 확대 모든 4 h X 10 각의 이미지를 캡처하십시오. 이전 이후의 시간 지점에서 각 잘 내 스크래치 함께 같은 위치 이미지를 접시의 바닥에 그려진 라인을 참조 합니다.
   참고: 동일한 위치 정확한 이미지 분석을 허용 하 고 대표 데이터를 얻기 위해 각 시간 지점에서 촬영은 필수적 이다.

7. 이미지 분석

1. 컴퓨터를 거꾸로 가벼운 현미경에 캡처한 이미지를 업로드 하 고 자세한 파일 이름 가진 JPEG 이미지 저장.
2. ImageJ를 엽니다.
3. 변환할 픽셀 밀리미터 (mm) 끌어서 소프트웨어 창에 파일을 삭제 하 여 이미지를 측정 하는 경우 소프트웨어에 알려진 거리 무대 마이크로미터의 이미지를 업로드.
   참고:는 마이크로 미터 라인 알려진된 1 m m 길이 정해 고 이미지 셀의 이미지를 캡처하는 데 사용 하는 동일한 배율에서 촬영 해야 합니다. 예를 들어 이미지 총 확대 100x에서 찍은이 연구에 따라서 스테이지 마이크로미터의 이미지 찍은 총 확대 100x에.
   1. 직선, 세그먼트또는 자유형 선 옵션을 클릭 합니다.
   2. 각 눈금에 관련 된 길이 눈금을 사용 하 여 알려진된 거리의 라인 마이크로미터 이미지에 그릴 자국. 직선을 그리려면: 마우스 클릭, 잡고, 원하는 위치에 커서를 끌어 다음 마우스의 가자.
   3. 분석 을 선택 다음 비율 설정을 선택 합니다.
   4. 이전 단계에서 그린 라인의 알려진된 길이에 알려진 거리 를 설정 합니다.
   5. Mm 길이의 단위 를 설정 합니다.
   6. 글로벌 상자를 확인 합니다.
   7. 확인 메뉴에서 종료를 선택 합니다.
   8. 무대 마이크로미터 이미지를 닫습니다.
4. 드래그 앤 드롭 이미지 파일 창에 여 ImageJ로 하나의 스크래치 분석 결과 이미지를 업로드 합니다.
   1. (오른쪽 앞 가장자리를 왼쪽된 앞 가장자리)에서 스크래치의 너비에 걸쳐 직선을 그립니다.
   2. 그려진 직선의 측정을 기록 하는 키보드에 문자 M 을 누릅니다. 작은 결과 창 문자 M을 입력 한 후 즉시 나타납니다. 이것은 폭 측정 될 것입니다.
5. 단계 7.4 총 스크래치의 길이 따라 10 측정을 10 회 반복 합니다.
   참고: 그것은 스크래치의 전체 길이 아래로 가장 표현 폭 값을 생성 하는 것이 중요입니다. 아래로 위에서 처음의 길이 따라 동일 하 게 10 폭 측정 밖으로 공간을 확인 하십시오.
6. 복사 하 여 붙여 측정 스크래치 분석 결과 스프레드시트 파일을 만듭니다.
   1. 복사 하 고 결과 창에서 10 폭 측정 (표 2) 스프레드시트 파일에서 적절 한 열에.
      참고: 때 측정 결과 창에서 복사 되 고 스프레드시트에 붙여, 거기 있을 것입니다 값;의 외부 열 이러한 값을 삭제 해야, 10 폭 측정만 보존.

표 2입니다. 원시 폭 측정 테이블 형식. 이 표에서 얻은 원시 측정에 대 한 조직 구조를 보여 줍니다.

7. 스크래치 분석 결과 이미지의 나머지 부분에 대 한 위의 단계를 반복 합니다.
8. 각 점에서 시간 (0-24 h) 모든 잘 10 측정의 평균을 계산 합니다.
9. % 폐쇄 단계 7.8에서에서 값을 사용 하 여 계산을 결정 합니다.
   1. 스프레드시트 "폭 측정 평균" 제목 아래에 테이블을 만듭니다 (표 3).
   2. 복사 및 붙여넣기 10 측정의 평균 행 계산 "폭 측정 평균" 테이블에 7.8 단계.
   3. 폭 측정 평균 테이블 옆에 있는 다른 테이블을 만듭니다. 이 제목 테이블 % 상처 폐쇄 (표 4).
      참고: 각 잘 0 h 열에서 값 때문에 스크래치는 초기 0 h 사진 모든 우물에 0 %0 이어야 합니다.
   4. (4 h) 동안 다음 열으로 이동 합니다.
   5. 4, 8, 12, 16, 20, 및 24 시간 포인트에 대 한 백분율 폐쇄 계산:
      
      어디, x % 폐쇄, = 나 = 초기 스크래치 너비 (0 h 폭), f = 최종 스크래치 너비 (4, 8, 12, 16, 20, 또는 24 h 폭).

테이블 3입니다. 폭 측정 평균 테이블 형식. 이 테이블 폭 측정 평균 표 2에서 원시 폭 측정을 사용 하 여 계산에 대 한 조직 구조를 보여 줍니다.

표 4입니다. % 상처 폐쇄 테이블 형식. 이 테이블 백분율 상처 폐쇄 값은 표 3에 평균 폭 측정을 사용 하 여 계산에 대 한 조직 구조를 보여 줍니다.

10. % 상처 폐쇄 테이블 옆에 있는 다른 테이블을 만듭니다. 이 제목 테이블 AUC (표 5).
    1. 0-4 계산 곡선 (AUC) 값 0-4에서에서 h 지역 각 잘 h 열:
       
       여기서 x = 0-4 h AUC 값, % 폐쇄 값 0 h, b = % 폐쇄 값 4 h, h = = (이 연구에서 4 h) 두 측정 사이의 시간.
    2. 각 잘 한 4-8 h 열 곡선 (AUC) 값에서 4-8 h 면적을 계산:
       
       여기서 x = 4-8 h AUC 값은 % 폐쇄 값 4 h, b = % 폐쇄 값 8 h, h = = (이 연구에서 4 h) 두 측정 사이의 시간.
       참고: 하나의 AUC 값 한다 산출 될 각 4 h 시간 간격에 대 한 각 우물에 대 한 24 시간 기간 동안.
    3. 각 잘 요약된 AUC 값을 모두 0-24 h (단계 7.10.1-7.10.2에서 계산)에서 AUC 값의 합계. 이러한 값을 제대로 통계 분석을 위해 저장 확인 하십시오.

표 5입니다. AUC 테이블 형식입니다. 이 테이블 AUC 값은 표 4에서 폐쇄 값 상처는 %를 사용 하 여 계산에 대 한 조직 구조를 보여 줍니다.

8. 통계 분석

1. 실험 설계와 분석 결과 중 얻은 총계 AUC 값에 가장 적합 하는 통계 분석 방법을 결정 합니다.

모든 치료 그룹에 대 한 샘플 크기 (n)은 n = 28. 셀 했다 성공적으로 경작된 다음과 같은 무 균 기술 및 실험실 프로토콜 (그림 1). 균일 한 흠집 의미 스크래치 폭 0.8 m m 0.4 m m (그림 2)를 측정 모든 치료 그룹에서 관찰 되었다. 제어 그룹 했다 1,355.83;의 커브 값에서 평균 요약된 영역 치료 그룹으로 0.01 µ M 평균 했다 1,366.21; 곡선 값 아래에 있는 영역을 표현 치료 그룹으로 0.1 µ M 평균 1,326.24의 곡선 값 아래에 있는 영역을 표현 했다, 치료 그룹으로 1.0 µ M 평균 했다 1,295.10; 곡선 값 아래에 있는 영역을 표현 그리고 마지막으로 10 µ M 치료 그룹 했다 통계적으로 낮은 535.12의 커브 값에서 평균 총계 지역에 비해 다른 모든 그룹 (p < 0.05) (그림 3). 통계 분석 연구-프로그램 치료 그룹 (p < 0.05) 간의 통계적 차이 확인 하려면 Tukey 특별 게시 조정 일방통행 ANOVA를 실행 사용 되었다.

그림 2: 20 h 기간 동안 대표 스크래치 시험의 이미지. 이미지 A-D 대표 세포 이동 제어 셀; 이미지 E H 대표; 1.0 µ M으로 오염 하는 세포의 세포질 마이그레이션 이미지 L로 10 µ M으로 오염 하는 세포의 세포질 마이그레이션을 나타냅니다. 이 이미지에서 셀룰러 마이그레이션 비소의 둔화는 분명 하다.입니다. 다른 두 처리로 서 그룹 하지 "치유 했다" 하는 동안 컨트롤 이미지 20 h 후 완전히 "치유" 스크래치를 표시 합니다. 치료로 10 µ M 저해 완전 한 폐쇄 후 24 h. 전부 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: 비소 스크래치 분석 결과에서 셀룰러 이동 속도가 느려집니다. 이미지 관찰 셀룰러 마이그레이션 속도 비소의 다양 한 농도의 변화를 24 시간 동안 체포 했다. Raw 이미지는 자동화 된 소프트웨어 (예를 들면, MATLAB에서), 어떤 처음 측정된 상처 폭 계산 % 폐쇄 그리고 마지막으로 (AUC) 곡선 아래의 영역을 사용 하 여 분석 되었다. 오차 막대는 뜻의 표준 오류를 나타냅니다. 치료 그룹으로 10 µ M는 통계적으로 인간 피부 섬유 아 세포 신생아 (hDFn) Tukey 특별 게시 조정 (p 일방통행 ANOVA를 사용 하 여 다른 모든 치료 그룹에 비해 통계적으로 낮은 AUC 값 표시의 셀룰러 이동 둔화 < 0.05). 통계적 인 차이 편지 "A"와 "B", R 프로그램에서 사용할 수 있는 소형 문자 표시 방법을 사용 하 여 통해 가져온으로 표시 됩니다. 일반적인 편지를 공유 하지 않는 치료는 서로에서 통계적으로 유의 한 (p < 0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

이 분석 결과의 응용 프로그램 셀룰러 이동의 높은 처리량 및 적절 한 평가 제공 하 고 복잡 한 생리 시스템^5,,67직접 번역할 수 있습니다. 이런 이유로 제안 된 벤치 탑 모델 조정 되어과 상처 치유⁶에 다양 한 치료제 및 환경 독 소의 효과 평가 하기 위해 연습. 현재 연구에 사용 된 비소의 농도의 알려진된 노출 수준, 광범위 한 문학 검색을 통해 환경 관련 지었다 그리고 다양 한 데이터의 회고전 검토에서 기초^{14,15, 16,17,,1819,,2021}. 이 생체 외에서 스크래치 분석 결과의 사용 시연 내 환경 관련 범위 하지만 높은 비소 농도에 노출, 지연 상처 폐쇄 (셀룰러 마이그레이션).

이 벤치 톱 모델 또한 격리 하 고 더욱 구와 마이그레이션 상처 치유 결과에 기여 하는 방법을 이해 하는 개별 셀 라인 (fibroblast) 공부 고용 되었다. 또한, 분석을 방해할 수 있는 복잡 한 생체 내에서 시스템에서 다른 많은 세포와 조직 현재 개별 셀 라인의 기능을 공부 하기 어렵습니다. 또한, 분석 결과 반 양적 % 상처 폐쇄 데이터 대상으로 특정 세포 메커니즘을 통해 화합물 영향을 미칠 수 상처 치유 하는 데 사용할 수를 달성 하는 수단을 제공 합니다. 예를 들어 스크래치 시험에 사용 되는 셀 수집 및 저장 원하는 시에 하 수 유전자 발현에 사용 (신호 mRNA) 또는 단백질 표정 분석 실험²². 그들은 어떤 신호 또는 단백질 대부분에 기여 수 있습니다 다양 한 트리 트 먼 트 (즉, 비소)²²존재 세포질 마이그레이션에 변화 이해를 추구 하는 경우이 정보 조사에 유용 수 있습니다.

인간의 신생아 피부 섬유 아 세포는 상처 치유에 있는 그들의 저명한 역할에 따라이 작품에 대 한 선정 됐다. 그러나,이 스크래치 시험 프로토콜 구현 되었습니다 사용 하 여 다양 한 세포 유형 및 다양 한 연구 목적에 대 한. 예를 들어 스크래치 분석 결과 마이그레이션 억제 화학요법 약²³;의 공부에 대 한 종양학 분야에 채택 되었습니다. 골격 근육 세포 이동, 확산, 고 확산²⁴; 세포질 마이그레이션²⁵;에 식물 추출 물의 효과 연구 하 그리고 이해를 어떻게 keratinocyte 마이그레이션 및 확산에 기여할 상처 치유⁹. 또한, 핀 토 외 에 의해 이전 종이 스크래치 분석 결과⁶을 사용 하 여 hDFn 마이그레이션에 우라늄 (U) 및 혈소판이 풍부한 혈장 (PRP)의 효과 평가 합니다. 이 작품의 목적은 정도는이 분석 결과 속도 셀룰러 마이그레이션 (PRP)를 생각 하는 에이전트 및 셀룰러 마이그레이션 (U), 천천히 생각 하는 에이전트의 효과 테스트할 수를 이해 하는 것 이었다. 앞서 언급 한 작품에서 볼 수 있듯이 고 다른 수 사관, 스크래치 분석 결과의 응용 연구 잠재력이 높은 사용에 대 한 다양 한 실험 모델²⁶에. 메서드 내에서 제공 하는 세부 사항에도 불구 하 고 조사와 실험 사이 차이 예상 한다. 예를 들어 셀룰러 마이그레이션 속도 사용, 독특한 셀 형식에 필요한 필수 미 량 영양소 뿐만 아니라 셀 라인에 따라 변동 가능성이 것입니다. 셀 생산량 및 생존에 도움이 중요 한 관측의 많은이 프로토콜을 통해 노트 로 표시 됩니다. 그러나, 조사 일반 셀 문화 작품 보충 지시로이 메서드를 사용 하 고 최적의 성장 조건에 대 한 제조업체의 권장 사항을 따라 하는 것이 좋습니다.

스크래치 분석 결과 세포 활동의 연구에 대 한 매우 다양 한 뜻하지 않은 편견 측정 기술에서 발생할 수 있습니다. 예를 들어 ImageJ를 사용 하 여 수동으로 셀 마이그레이션 전선 추적을 변형 정확도 및 대표 데이터 수집을 제한할 수 있는 사용자 간에 존재할 수 있습니다. 또한는 마이그레이션 전선 읽어야 장 님 사용자 바이어스를 최소화 하기 위해 치료에 주목 한다. 또한, 수동으로 마이그레이션 전선 식별 pseudopod 형성으로 인해 세포와 그들의 능력을 시각적으로 오해의 소지가 될 수 있는 형태 초점 유착에 밖으로 도달 하 여 여행 평균 거리의 오산 발생할 수 있습니다. 방식 처럼, 세포 표면에 형광 "셀 추적기"를 사용 하 여 염료 또는 마이그레이션 감지 하 핵 단백질 실수로 시간이 지남에 셀룰러 마이그레이션 측정할 때 부정확의 결과로 세포를 해결할 수 있습니다. 적절 한 긍정적인 또는 부정적인 컨트롤 완전히 엉덩이를 실험에 내에서 등록 하는 것이 좋습니다 셀 라인에 치료의 효과. 이 분석 결과의 실천의 한계 인식 완료 되어야 합니다. 이 분석 결과 체 외 실험에서 얻은 세포 마이그레이션 결과 vivo에서 결과. 을 직접 번역 것입니다 보장 하지 않습니다. 복잡 한 생활 시스템에서 상처 치료 및 세포 마이그레이션 포함 다양 한 세포 유형 및 분자 신호; 각각의 치료 응답에 영향을 미칠 가능성이 있다.

요약 하자면, 스크래치 분석 결과 환경^6,25변화 하는 응답에 세포질 이동의 높은 처리량 검열 제공 발견 되었습니다. 우리는 특히 성공적으로 다양 한 환경 관련 복용량에서 비소 노출의 결과로 세포 마이그레이션에 변화를 감지 하이 프로토콜 활용. 이러한 데이터를 사용 하 여 스크래치 분석 결과 연구를 추가 하 고이 분석 결과에 이러한 경로 비소 노출에 의해 변경 되는 방법을 세포 이동의 기계적 경로 평가 정당화 제공.

저자는 공개 없다.

이 간행물에서 보고 된 연구는 소수 보건 및 보건 불균형의 보너스 번호 U54MD012388에서 건강의 국가 학회에 국가 학회에 의해 지원 되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다.