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이 문서는 기준점과 플라스 미드 라이브러리를 사용 하 여 신진 효 모에 overexpression 심사를 용이 하 게 하 짝짓기 기반 메서드를 제공 합니다.
싹 트는 효 모 단백질 인간의 질병와 관련 된 공부에 모델로 널리 사용 되었습니다. 게놈 전체 유전자 검사는 일반적으로 효 모 연구에 사용 되는 강력한 도구입니다. 다양 한 효 모에 신경 퇴행 성 질환 관련 단백질의 식이 세포 독성 및 집계 형성, 업과 연구 결과 이러한 장애를 가진 환자에서 발생 합니다. 여기, 그 독성의 한정자 루 경화 증 관련 단백질 FUS의 효 모 모델을 검사 하는 방법을 설명 합니다. 변환을 사용 하 여, 대신이 새로운 심사 플랫폼 효 모 모델에 플라스 미드의 기준점과 라이브러리를 소개 하는 효의 짝짓기에 의존 합니다. 짝짓기 방법에는 두 명확한 이점이 있다: 첫째로, 그것은 매우 효율적인; 둘째, 플라스 미드의 사전 변환 된 기준점과 라이브러리 저장할 수 있습니다 글리세롤 주식으로 장기적이 고 신속 하 게 효 모 모델에 변환의 노동 집약 단계 없이 다른 스크린에 적용에 대 한 각 시간. 어떻게이 방법은 성공적으로 사용할 수 있습니다 설명 수정 FUS의 독성 유전자에 대 한 화면으로.
싹 트는 효 모 Saccharomyces cerevisiae 널리 사용 되었습니다 기본 과학 연구1 에 직접 인간의 질병에 관련 된 세포 프로세스를 이해 하. 또한, 그것은 사용 되는 모델 생물으로 가장 흔한 신경 퇴행 성 질환, 알 츠 하이 머 병, 파 킨 슨 병, 헌팅턴 병, 그리고 루를 포함 하 여에 연결 등 인간의 질병 관련 단백질, 공부에 대 한 옆 경화 증 (ALS)2. 효 모 모델의 장점은는 게놈 넓은 스크린 따라서 그들의 독성의 메커니즘에 대 한 통찰력을 주는 질병 관련 단백질의 독성에 관련 된 세포 경로 식별 하기 위해 수행할 수 있는 용이성입니다. 이러한 한 화면은 기준점과 라이브러리에 5500 효 모 유전자 각각의 어떤 유전자 독성 overexpressed 때 수정할 수 있습니다 식별 하는 효 모 모델로 변환 됩니다 overexpression 라이브러리 화면을 이라고 합니다. 이 검사 방법은 여러 신경 퇴행 성 질환 관련 단백질의 Huntington의 질병3, 파 킨 슨 병4,5 α-synuclein huntingtin 포함 효 모 모델에 성공적으로 적용 된 , 알 츠 하이 머 병6, FUS 및 TDP-43 ALS7,,89Aβ. 일반적으로는 높은 처리량 방법10에서 이루어집니다, 하는 동안 화면의 가장 노동 집약적인 단계는 개별적으로 기준점과 라이브러리에서 5500 효 모 유전자 변형 시키는. 심사, 반복 때마다가이 단계를 수행 해야 합니다 그리고 때마다 새로 설립된 된 효 모 모델 공부 될 필요가 있다. 그것은이 작업을 수행 하는 더 효율적인 방법을 찾을 수 해야 합니다.
효 모 세포는 단일과 2 중 형태로 안정적으로 존재할 수 있습니다. 두 유형의 단일 셀, 짝짓기 형식 짝짓기 반대는 각 짝짓기의 α. 단일 셀 생산을 입력 하 고 짝짓기 형식 셀 반대만 응답 하는 그들의 자신의 특정 짝짓기 페로몬을 분 비 하는 고. 이로써 간의 짝짓기는 생산 안정 된 2 중 세포, / α α 세포. 이 과정은 자발적이 고 매우 효율적인11. 우리 플라스 미드 도서관 소개 S. cerevisiae 의이 독특한 라이프 사이클의 활용할 수 있습니다. 좀 더 구체적으로, 기준점과 플라스 미드 도서관에서 각 유전자 한 짝짓기 종류, 즉, α 셀의 단일 세포로 변형 됩니다. 라이브러리 유전자를 포함 하는 이러한 셀 다음 글리세롤 주식 기준점과 96 잘 형식에서에 저장 됩니다. 상영 하는 각 효 모 모델, 라이브러리 유전자를 포함 하는 효 모 세포 글리세롤 주식에서 재개 수 있습니다 되 고 반대 짝짓기 종류, 즉, 짝짓기 종류의 효 모 모델 짝짓기를 통해 심사를 할 수 있는 한. 효 모에 두 개의 유전자를 함께가지고 짝짓기를 사용의이 아이디어를 새로운 되지 않습니다. 2 하이브리드 심사, 있는 미끼 생성 한 짝짓기 형식에 (즉, Gal4 DNA 바인딩 도메인 융해) 소집 짝짓기 기준점과 라이브러리에서 먹이 구조를 통해 높은 처리량 효 모에 성공적으로 적용 된 그러나 12.,이 전략 적 overexpression 라이브러리 검 진, 항상 전통적인 변환 방법 사용에 적용 되었습니다.
우리의 실험실 이전 ALS 관련 단백질 FUS7의 효 모 모델을 설립. 변환 메서드를 사용 하 여 overexpression 라이브러리 심사를 통해 우리 FUS overexpressed 때의 독성을 구출 하는 5 개의 효 모 유전자를 (ECM32, NAM8, SBP1, SKO1, 및 VHR1)을 발견 했다. 이들이 발견 했다 독립적으로 확인 하지 비슷한 연구와 다른 그룹8. hUPF1, ECM32의 인간 상 동 기관 나중 기본 신경 세포13 와 ALS14 도의 동물 모델에서 독성을 억제 하기 위해 표시 했다. 이 5 개의 유전자를 사용 하 여 원리의 증거로, 그들은 짝짓기에 의해 FUS 효 모 모델에 소개 될 때 모든 5 개의 유전자 마찬가지로 FUS 독성을 구조 설명 합니다. 라이브러리 유전자를 포함 하는 효 모 세포 글리세롤 주식에 영구적으로 저장 하 고 필요할 때마다 부활 수 있습니다, 이후이 짝짓기 기반 메서드 변환 라이브러리에 대 한 검사를 해야 할 때마다 시간이 많이 걸리는 단계를 제거 합니다. 짝짓기 하는 것이 없는 플라스 변환 관련 고효율 이후이 전략 또한 크게 정화 및 큰 플라스 미드 도서관의 변화와 관련 된 비용을 줄입니다. 우리 도서관 FUS의 효 모 모델에 대 한 심사를 성공적으로이 메서드를 적용 됩니다.
짝짓기 기반 검사 절차 그림 1에 간략하게 설명 되어 있습니다. 처음, 기준점과 플라스 미드 도서관 종류 α 96 잘 접시의 각 잘 포함 효 모 특정 라이브러리 플라스 미드로 변형 되어 있는 높은 처리량 효 모 전이 프로토콜을 사용 하 여 짝짓기의 단일 효 모 긴장으로 변화 됩니다. 이 컬렉션 변환 효 해 동 하 고 나중에 사용 하기 위해 부활 수 있는 글리세롤 주식으로 저장 됩니다. 이 경우 FUS 독성에 관심사의 효 모 모델 반대 짝짓기 형식과 단일 효 모 스트레인에 생성 해야 합니다 (유형 짝짓기는). 살 균 96 핀 복제기를 사용 하 여 높은 처리량으로, FUS 긴장과 플라스 미드 도서관을 포함 하는 효 모 종자는 96 잘 접시 포함 된 리치 미디어를 전송 하며 수 친구. 짝짓기, 각 작은 볼륨 다음 짝짓기 문화의 잘 96 잘 접시 합성 강하 미디어 모두 FUS를 포함 하는 2 중 효 모에 포함 된 전송 및 라이브러리 유전자 성장할 수 있다. 로봇 탐지 기계는 FUS 및 라이브러리 유전자의 표정을 유도 된 한 천 배지 위에 각 우물에서 효 모 문화를 전송에 사용 됩니다. 또한, 효 모 문화는 어디 FUS 및 라이브러리 유전자 표현 되지 않는다 하는 한 천 배지를 제어 하 발견 됩니다. 한 천 배지에서 성장, 다음 구조 또는 악화 FUS 독성 유전자 식별 합니다.
참고: 여기에 설명 된 프로토콜 10 96 잘 접시에 포함 된 라이브러리 플라스 미드를 상영을 위해 설계 되었습니다 하지만 확장 될 수 있습니다 또는 그에 따라 아래로. 프로토콜은 라이브러리 전체 심사를 완료 하는 데 반복 될 필요가 있다. 일반적으로, 라이브러리 유전자의 10 판에 대 한 심사 때마다 1 사람이 편안 하 게 처리할 수 있습니다.
1. 96 잘 누 룩 변환에 대 한 준비
참고:이 단계는 수행 이전 설명된7,10.
2. 누 룩 변환
3. 쿼리 효 모 라이브러리 유전자를 포함 하는 셀 간의 짝짓기
4. 분석 결과 보 이나
ALS 관련 단백질 FUS, RNA/DNA 의무적인 단백질, 단일 효 모7,8이전 연구 했다. 유전자 검사를 사용 하 여 변환 기반 방법 FUS 독성을 억제 하는 여러 효 모 유전자 발견. 효 모 유전자의 인간 상 동 기관 나중 기본 신경 세포 및 ALS13의 쥐 모델에서 독성 억제에 효과적인 것으로 입증 되었다. 여기, 우리는 사용 하 여 동일한 효 모 모델 overexpression 라이브러리 심사 효과적으로 결합 하 여 수행할 수 있습니다 보여로 변환 하 여.
FUS는 모두 단일과 2 중 효 모 세포에 독성
FUS 및 후속 overexpression 라이브러리 심사의 이전 효 모 모델은 단일 셀 배경에서 수행 되었다. 작동 하도록 짝짓기-기반 방법, FUS 독성 2 중 효 모에 설명 될 필요가 있다. 이렇게 하려면, 우리 w303a에서 FUS 효 모 모델 성관계 (유형 짝짓기는) w303α (짝짓기 종류 α)는 빈 벡터와 변형으로. 비록 아니라 단일 효 모와 같이 강한 그림 2에 표시 된, FUS 독성 2 중 효 모에 분명 하다.
억제 유전자는 이전 2 중 효 모에는 작업을 식별
증거로 서의 짝짓기-기반 방법에 대 한 원리, 이전 변환 기반 방법에서 확인 된 5 개의 유전자 테스트. FUS (W303a)에서 단일 효 모 모델에는 5 개의 유전자의 각을 소개 하는 데 사용 했다 짝짓기와 후속 2 중 효 모에는 FUS의 독성을 구출 하기 위해 그들의 능력 테스트 (W303a/α). 그림 3에서 보듯이, 모든 5 개의 유전자 구조 짝짓기 방법 효과적 이었습니다 나타내는 2 중 효 모에는 FUS의 독성.
940 유전자 (10 96 잘 접시에 배열)의 파일럿 심사
위에서 설명한 프로토콜에 따라 우리 940 유전자의 overexpression 라이브러리 심사 짝짓기-기반 방법 적용. 그림 4 는 하나의 대표적인 접시의 그림을 표시합니다. 그림 (FUS 및 라이브러리 유전자 표현)의 오른쪽에 표시 된 대로 FUS 2 중 효 모에 유해 했다. 빨간색 사각형으로 표시 하는 독성을 강화 하는 동안 녹색 사각형으로 표시 된 라이브러리 유전자 FUS 독성을 구출.
그림 1 : 짝짓기를 사용 하 여 단백질 독성의 효 모 모델을 심사에 대 한 다이어그램. (갈 락 토스의 높은 유도 GAL1 발기인 통제) 플라스 미드 도서관 높은 처리량 변환 프로토콜을 사용 하 여 단일 효 모 스트레인 (MATα)으로 변환 됩니다. 효 모, 라이브러리 플라스 미드와 변환의이 컬렉션-80 ° c, 글리세롤 주식으로 저장 되 고 단일 효 모 모델 (우리의 경우, FUS HIS3 로커 스, GAL1 발기인에 통합의 복사본 하나에 단백질 독성의 짝 필요할 때 부활은 마 타). 2 중 효 모 라이브러리 플라스 미드 및 독성 단백질 (FUS)을 포함 하는 선택 하 고 ('끄기' FUS 및 라이브러리 유전자) 포도 당과 갈 락 토스 (FUS 및 라이브러리 유전자 '에') 한 천 배지를 발견. 누 룩의 성장 구조 또는 악화 FUS의 독성 유전자를 식별 하기 위해 뒤를 이었다. 녹색 사각형 FUS 독성, 구출 하는 억압 유전자의 예를 나타내고 빨간색 사각형 FUS 독성 overexpressed 때 악화 하는 증강 인자 유전자의 예를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : FUS는 모두 단일과 2 중 효 모 세포에 독성이. 단일 효 모 (w303 타) pRS303Gal1-FUS로 변형 중 하나는 빈 플라스 미드와 변형 또는 2 중 효 모 긴장을 생성 하는 동일한 빈 플라스 미드와 변형 반대 짝짓기 형식 (w303 MATα)의 효 모와 성관계. 컨트롤 스트레인 함께 이러한 효 모 종자 다음 5 직렬로 희석 (왼쪽에서 오른쪽)와 우 라 그의 포도 당 중간 (왼쪽된, FUS 식 억압)과 우 라 그의 갈 락 토스 중간 (오른쪽, FUS 식 유도)을 발견 했다. 그림 30 ° c.에 성장의 2 일 후에 찍은 단일과 2 중 제어 긴장의 거의 동일한 성장만 단일 컨트롤 변형을 표시 했다 관찰 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 5 효 모 유전자 (ECM32, NAM8, SBP1, SKO1, 및 VHR1) 짝짓기 기반 방법을 통해 FUS 독성 구조. FUS 독성 억제 이전 확인 된 효 모 유전자를 포함 하는 플라스 미드는 단일 효 모 스트레인 (w303 MATα)으로 변모 했다. 이러한 효 모 FUS 식 플라스 미드와 변형 반대 짝짓기 형식 (w303 마 타)의 단일 효 모와 성관계 후 했다. FUS 빈 벡터 및 5 억제 유전자 중 하나를 포함 하는 2 중 효 모 포도 '오프' (유전자)를 포함 하는 한 천 배지와 갈 락 토스 ('에' 유전자)에 선택 되 고 발견에 복제 했다. (1) 두 개의 빈 벡터를 변형 제어 효 모 스트레인을 보여줍니다. (2)는 빈 벡터 FUS의 표정은 매우 독성로 2 중 FUS 효 모 스트레인을 보여줍니다. (3-7) 표시 FUS 독성을 구조 할 수 있는 억제 유전자로 서 FUS 표현 2 중 효 모. 각 번호 (1-7) 쇼 동일한 12의 두 행을 복제 합니다. 그림을 대표 하는 3 개의 독립적인 실험, 30 ° c.에 성장의 3 일 후에 찍은 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 유전자 구조 또는 악화 FUS 독성에 대 한 라이브러리 심사. FUS를 포함 하는 단일 효 모 라이브러리 유전자를 포함 하는 단일 효 모와 성관계를 했다. 짝짓기 후 FUS 및 라이브러리 유전자를 모두 포함 하는 2 중 셀 선택 하 고 quadruplicate에서 한 천 배지 (FUS 및 라이브러리 유전자 '에') ('끄기' FUS 및 라이브러리 유전자) 포도 당과 갈 락 토스를 발견 했다. FUS 및 라이브러리 유전자 표현 되었다, 갈 락 토스 접시에 누 룩의 대부분 잘 성장할 수 있었다. 이 FUS 독성은 대부분 라이브러리 유전자 독성을 구출 하지 못했습니다 나타냅니다. 녹색 사각형 FUS 독성 억제 및 식민지를 형성 하는 효 모 라이브러리 유전자의 예를 보여 줍니다. 붉은 광장 FUS 독성 악화 라이브러리 유전자의 예를 나타냅니다. 여기에 표시 된 번호판에 대 한 상영 했다 도서관 유전자의 10 접시의 대표 있습니다. 그림 30 ° c.에 성장의 3 일 후에 찍은 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
여기, 우리는 짝짓기 사용 하 여 효 모 모델에 플라스 미드 도서관을 소개 하는 효 모에 플라스 미드 overexpression 화면 수행 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이 방법을 사용 하 여, 신경 퇴행 성 질병 단백질 독성의 여러 효 모 모델 수 상영 플라스 미드 도서관으로 변형 하는 효 모의 동일한 컬렉션을 사용 하 여. 변화의 힘 드는 과정만는 고효율 효 모 후 쿼리 스트레인에 플라스 미드 도서관을 소개 하는 짝짓기 한 번 수행 해야 합니다. 이 프로토콜은 미디어와 한 천 배지 위에 자리 효 모 문화 분배를 로봇 장비의 사용에 의존지 않습니다. 프로토콜의 로봇 장비를 사용 하지 않고 수행할 수 있습니다, 하는 동안 그것은 더 많은 시간이 소요 됩니다. 이 메서드는 성공적으로 FUS의 독성을 수정할 수 있는 유전자에 대 한 화면을 사용.
FUS 2 중 효 모 배경에서 약간 덜 독성은 관찰 합니다. 이 대부분 유전자 사본 수와 2 중 효의 성장 율에 차이. 하지 않는 한 공부 되는 표현 형은 짝짓기 형식 또는 ploidy 종속, 독성의 성장 형 단일과 2 중 효 모에 일치 하는. 이 때문에, 짝짓기-기반 방법 다양 한 성장 고기의 많은 효 모 모델에서 널리 일 예정 이다. 그럼에도 불구 하 고, 효 모 모델의 표현 형이 심사 메서드를 수행 하기 전에 그것은 여전히 2 중 배경에서 존재는 되도록 확인 되어야 한다. 이 방법은 효 모에 많은 다른 고기를 공부 하는 데 사용할 수 있습니다 그리고 신경 단백질 독성의 연구에 국한 되지 않습니다. 또한, 모든 플라스 미드 도서관 포함 효 모 식 벡터를 사용할 수 있습니다.
화면을 수행한 후 상영 되 고 효 모 모델에 특정 식별된 안타를 확인 하는 데 도움이 됩니다 확인 분석 실험의 여러 가지가 있습니다. 독성의 강화 공동 관심사의 질병 단백질을 표현 하지 않고 효 모에 테스트 되어야 합니다. 독립적인 관심사의 질병 단백질의 독성을 일으키는 강화 추가 연구에서 제거 되어야 합니다. 그것은 독성의 진압 Gal1 발기인에 영향을 미치는 여 식 질병 단백질의 영향 여부를 고려 하는 것이 중요입니다. 모든 진압 Gal1 발기인에서 식에 영향을 미치는 추가 연구에서 제거 되어야 합니다.
라이브러리 플라스 미드를 포함 하는 효 모 종자 글리세롤 주식에 영구적으로 저장 하 고 짝짓기 기반 메서드는 동일한 라이브러리 유전자에 대 한 상영 될 필요가 다른 효 모 모델에 쉽게 적용할 수 있도록 필요할 때 신속 하 게 부활 될 수 있습니다. 짝짓기-기반 방법의 효율성 심사의 동일한 종류는 가양성을 사용 하거나 여러 다른 효 모 모델 공부 될 필요가 있을 때 분명 한 된다. 우리가 성공적으로 TDP-43, 효 모 모델에이 방법을 사용 하는 다른 단백질은 ALS에 연결.
저자는 공개 없다.
우리는 주 실험실 및 종 실험실, 라이트 주립 대학에서 재정 지원의 구성원과 사려깊은 토론에 대 한 감사.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
salmon Sperm DNA (SS-DNA) | Sigma-Aldrich | D1626 | |
YPD broth | Research Products International (RPI) | Y20090 | |
Granulated Agar | Fisher Sci | BP97445 | |
D-(+)-Glucose | Research Products International (RPI) | G32040 | |
D-(+)-Galactose | Research Products International (RPI) | G33000 | |
D-(+)-Raffinose Pentahydrate | Research Products International (RPI) | R20500 | |
Ammonium Sulfate | Fisher Sci | A702-500 | |
Synthetic Ura- drop out medium | Clontech | 630416 | |
Yeast amino acid drop out supplement -Histidine/-Uracil | Clontech | 630422 | |
Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate | Research Products International (RPI) | Y20060 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Sci | S67496 | |
Lithium acetate, anhydrous | Fisher Sci | AC268640010 | |
Polyethylene Glycol 3350 (PEG-3350) | Spectrum Chemical | PO125-12KG | |
96 Pin Replicator | Scinomix | SCI-5010-OS | |
Nunc OmniTray | Thermo Sci | 140156 | |
Corning Costar 96 well assay plate, round bottom with lid | Fisher Sci | 07-200-760 | non-treated, sterile |
Eppendorf Research plus Multichannel Pipette | Eppendorf | TI13690052 | 30-300ul volume |
Fisherbrand Isotemp Digital Dry Baths/Block Heaters | Fisher Sci | 88-860-023 | |
Eppendorf MixMate | Eppendorf | 21-379-00 | |
Eppendorf 5810R Centrifuge | Fisher Sci | 05-413-112 | |
Avanti J-26 XPI Centrifuge | Beckman | 393127 | |
MultiFlo FX Multi-Mode Dispenser | BioTek | ||
Rotor HDA | Singer Instruments |
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