Nonarteritic 전방 허혈성 시신경 병증의 설치류 모델 (rNAION)

The following report describes how to replicate the rodent model of nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (rNAION), using the appropriate dye, contact lens and laser parameters. We also reveal the appropriate steps for evaluating the rNAION lesion in vivo.

Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION) is a focal ischemic lesion of the optic nerve that affects 1/700 individuals throughout their lifetime. NAION results in optic nerve edema, selective loss of the retinal ganglion cell neurons (RGCs) and atrophy of the optic nerve. A rodent model of NAION that expresses most NAION features and sequelae has been developed, which is applicable to both rats and mice. This model utilizes a focal laser application of 532 nm wavelength to illuminate a photoactive dye, Rose Bengal (RB), to cause capillary damage and leakage at the targeted anterior optic nerve (the laminar region). After rNAION induction, there is an early optic nerve ischemia, optic nerve edema, and intraneural inflammation, followed by selective RGC and axonal loss. Since the optic nerve is a CNS white matter tract, the rNAION model is applicable to mechanistic studies of selective white matter ischemia, as well as neuroprotective analyses and short and long-term mechanisms of glial and neuronal response to ischemia.

Nonarteritic 전방 허혈성 시신경 병증 (NAION)은 시신경 (ON) ^(1)의 전방 부의 국소 허혈성 병소이다. NAION는기구 intraneural 부종을 초래 구획 증후군으로 생각된다. ^(50)이 세 이상의 사람들이 갑자기 시신경 관련 실명의 가장 흔한 원인이고, 시신경에서 축삭을 공급하는 모세 혈관의 압축을 야기 ^3.

온 실제로는 중추 신경계 (CNS) 계통이므로, 설치류 NAION (rNAION) 모델 절연 CNS 백질 스트로크에 응답 메커니즘을 연구하는데 사용될 수있다. rNAION 모델은 따라서 흰색 문제에 뇌졸중 관련 손상과 관련된 많은 문제를 해부에 유용 할 수있다. 백질 행정에서 다른 신경 전략과 제제를 평가하는데 사용될 수있다.

모델의 가장 매력적인 기능 중 하나가 있다는고통, 비 침습적 인 방법. 레이저 파워는 허혈성 손상의 다양한 정도를 생산하도록 조정될 수있다. 또 다른 특징은 누진 모세관 부전 제조 모세관 내피 세포를 손상하는 레이저 수퍼 옥사이드 라디칼에 의존한다는 것이다. 그것은 NAION 발생기구 현저 유사한 것으로 생각된다 부전이 진보적 종이다. 조사는 직접 모세관 응고가 발생하지 않는 것을 도시하지만, 적어도 두 가지 메커니즘을 작동되었다 : 과산화물 유도 된 죽음과 모세관의 일부 박리 내피 세포 ⁽⁴⁾ 및 활성화 된 B 세포의 NFkB (핵 인자 카파 경쇄 - 인핸서 간질 ^(5)로 세포막에 걸쳐 유체 수송 증가와 함께), 내피 나머지에 염증 규제 관련. 시신경 허혈에서 간질 유체의 축적 결과로 인한 시신경 모세관 및 압축 폐쇄. 개략적 픽처에 도시도 2. rNAION 모델은 모두 랫트 및 마우스 종 ^-6,7-에서 사용될 수 있고, 시신경의 완료되지만, 무통 파괴 망막 등을 온화한 병소에서 심각성 수준에서 변화 될 수있다 망막 중심 동맥 폐쇄 (CRAO) 등.

(, 볼티모어, MD, USA IACUC)이 프로토콜은 메릴랜드 기관 동물 관리 및 이용위원회의 대학에 의해 승인

1. 실험 셋업

1. 3mm 두께의 직경 플렉시 글라스의 명확한 광학 학년 원형 7mm에서 사용자 정의 설계 콘택트 렌즈를 확인합니다. 드릴 프레스와 원형 렌즈를 잘라. 내부 곡선을 만들기 위해 표준 드릴 비트를 사용하여, 최종적으로 초 미세 그릿 (3,000분의 1,000)의 콘택트 렌즈 용 광택제를 사용하여 외측 곡선 연마.
2. 사전에 pH 7.4의 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)에 2.5 mM의 장미 벵골 (RB)를 준비, 필터는 최대 6 개월 동안 빛을 꽉 컨테이너에 0.45 미크론 주사기 필터 및 매장 -20 ° C에서 1 ml의 분취 량을 소독.
   참고 : 같은 스프 라그 돌리 같은 흰둥이 이계 남성 동물의 사용은, 변형 따라 응답의 차이를 최소화 유도의 증가 용이성을 가능하게하고 발정 cycli 발생할 수있는 변동성을 감소NG 여성.
3. 설정 주파수는 네오디뮴 - 이트륨 알루미늄 가넷 532 nm의 레이저 광을 발생 (FD-YAG) 안과 의료 레이저를 두 배로. 표준 안과 레이저 어댑터를 사용하여 겐 - 스트 라이트 안과 슬릿 램프 레이저를 탑재합니다. 이 상업적으로 이용 가능한 장치는 동물의 눈과 레이저 스팟 응용 프로그램의 동시 시각화 할 수 있습니다. 의료 레이저는 적절한 레이저 유도로 같은 자리 크기를 사용하여 초점을 맞추고 자기 중심을위한 목표로 빔을 보유하고 있습니다. 다음과 같이 레이저 출력 매개 변수는 다음과 같습니다
   1. 쥐 rNAION 유도의 경우 : 500 μm의 스폿 사이즈 / 50 mW의 레이저 파워 / 1,000 밀리 초 지속 시간 / 1,000 밀리 초 간격을 사용합니다.
   2. 마우스 rNAION의 유도 : 작은 시신경 300 μm의 스폿 크기를 변경하고 래트 설정으로 다른 매개 변수는 동일하게 떠난다.
   3. 일상적으로 레이저 출력을 보장하기 위해, 레이저 파워 미터를 사용한다.

2. 실험 절차

1. 레이저 전원을 켭니다적절한 레이저 매개 변수를 설정합니다. 사용 전에 적어도 5 분 동안 레이저 따뜻한.
2. 케타민 / 자일 라진 및 RB 염료에 대한 적절한 투여 량을 결정하기 위해 동물을 단다. 80 ㎎ / ㎖ 케타민 4 ㎎ / ㎖의 자일 라진 1 ㎖ / kg의 혼합물을 복강 내 주사하여 동물을 마취.
3. 완전히 마취 될 때까지 가열 새장에 동물을 둡니다. 혐오 자극 (꼬리 또는 발가락 핀치)에 대한 응답을 확인합니다. 마취의 깊이 매 10 분 동안 동물을 확인합니다.
4. 1 % tropicamide과 동물의 동공을 팽창 및 0.5 % proparacaine와 눈 표면 마취. 이러한 긴 에반스와 같은 색소 동물을 사용하는 경우, 2.5 % neosynephrine 눈 방울 동공 팽창을 증가시킬 것이다.
5. 측면의 총구에 가까운 수염이보기를 막지 않도록 유도 할 잘라 가위를 사용합니다.
6. 1 % 메틸 셀룰로스 또는 맞춤형 콘택트 렌즈의 내부에 다른 안과 결합 방울 방울을 넣은 후 t에 렌즈를 적용쥐의 눈을 그가.
7. 슬릿 램프의 높이로 조정 플랫폼에서 동물을 놓습니다. 눈 슬릿 램프 및 레이저 광과 수직이되도록 45 ° 각도에서 동물의 머리를 설정한다.
8. 안과 세극등 통해 눈 시각화. 집중과 시각 시신경에 직접 중심으로 확인 조준 빔이 적당한 크기뿐만 아니라 확인하십시오. 맞춤 제작 어댑터 슬릿 램프의 눈 조각 중 하나에 장착 된 속도 - 고 ASA (2000 1200)와 디지털 카메라를 사용하여 망막 안저 사진.
   주 : 맥락막 혈관을 볼 수있는 능력은 망막의 투명성을 보여준다. 이는 발생하면 해석을 혼동 할 수있는 이상, 망막 허혈을 검출 할 수 있기 위해서는 중요한 표시이다. rNAION 망막 손상에서 망막 허혈 결과가 망막 내층의 모든 셀에 영향을주는 반면, 절연 RGC 손실 결과 시신경 허혈이다.
9. 선택적으로, 상기 이미지 망막과유엔에 의한 눈을 평가하기 위해 스펙트럼 도메인 빛 간섭 단층 촬영기 (SD 간섭 단층 ^8)를 사용하여 시신경. 망막 (도 3c)를 통해 표면 (도 3b)과 (7)의 단면 검사 도중에 스캔. 는 SD 간섭 단층 촬영은 레이저 유도에 사용 된 것과 같은 콘택트 렌즈를 사용한다.
10. 1 ㎖ / 정맥 꼬리 정맥을 통해 kg RB를 주입하고, 30 초 후 레이저 파워를 활성화 기다린다. 이 시간 지연은 순환에 걸쳐 고르게 분포되도록 RB 수있다. 우리는 하나의 초 / 펄스에서 50 mW의 레이저 펄스를 사용합니다. 큰 에너지 (≥ 60 Mw)은 망막을 손상 시키거나 망막 혈관 허혈의 원인이 될 수 있습니다.
    주의 : 있는지 확인하십시오 모든 사람이 길잃은 레이저 광이 조사의 눈에 들어가는 것을 방지하기 위해 적절한 차단 파장의 레이저 안전 필터링 안경을 보유하고 있습니다.
    참고 : 염료를 순환에서 신속하게 제거되기 때문에 레이저 행정부가 IV RB 주입 후 신속하게 제공해야합니다. 긴 레이저 유도 더 심한 시신경 허혈. 빠른 연속 12 초 펄스 - 일반적으로, 동물은 7이 제공됩니다. 순환 염료 레이저 광의 접촉은 시신경 혈관 께 세극등 (도 4b)를 통해 볼 수있는 다운 황금 광선을 제공한다. 이는 염료를 주입 전신 혈류에 분배 하였다 증명한다. 글로우 모든 (그림 4A)에서 희미한 또는 없음 경우, 염료를 정맥 주입되지 않았습니다. 동물이 재 주입하기 전에 적어도 이틀 동안 복구해야하기 때문에이 경우, 즉시 두 번째 주사를주지 않는다.
11. 즉시 유도 후, 콘택트 렌즈를 제거한다. 덱사메타손과 안과 트리플 항생제 (Neosporin / 폴리 믹신 / 바시 트라 신) 연고와 두 눈을 커버하고, 전체 복구까지 가까운 관찰에서 하나의 수용 장에 37 ° C 온난화 패드에 동물을 배치합니다.
    1. 승 증류수로 콘택트 렌즈를 청소ater에는 나중에 사용하기 위해 비 마모성 청소 천으로 물기를 닦아.
    2. 유도 후 2 일 안저 컬러 사진과 SD 간섭 단층 분석 ⁽⁸⁾ 모두에 의해 시신경 부종을 평가합니다.
       주 : 시신경 부종의 정도를 비교하는 시신경 허혈의 심각도의 추정치를 제공한다. 이일에서, 시신경 디스크 이익률은 흐리게하고, 망막 정맥은 약간 반대측 (해제 유도) 눈에 비해 넓혀된다. 이 4 주에서 전위도 (ERG) 및 유발 전위 (VEP ¹¹⁾ 시각적 플래시를 수행 전기 생리학 분석을위한 유도을 게시 할 수 있습니다.

콘택트 렌즈 사용 가능 중앙 망막 시각화 (그림 1). 초점 레이저 스폿은 망막의 뒤쪽에있는 광학 디스크 (그림 2)를 조명한다. 정상적인 비 - 유도 망막 슬릿 램프 생체 현미경 (도 3a)에 의해 SD 간섭 단층 (도 3b 및도 3c)에 의해 촬상 나타낸다. 어떠한 염료 순환에 존재하지 않을 때, 레이저 유도시, 레이저 광 용기 디스크 형광 (도 4a)에 포함되지 않는다. 정맥 RB 및 시신경 (도 4b)의 황금 컬러 형광 광학 디스크 결과에 레이저 광 조명. rNAION 유도 다음과 같은 두 가지 일, 시신경 (그림 5A). 욕실 얼굴과 단면 SD 간섭 단층 (그림 5B)를 팽창 디스크를 공개하고 시신경 (그림 5C)의 확장 팽창된다.

도 2. rNAION 모델의 개략도. 눈 뒤쪽을 통한 횡단면도. 레이저 스폿은 광 디스크 (초록색 화살표)에 집중된다. 녹색 세포와 축삭은 망막 신경절 세포의 신경 세포를 나타냅니다. 즉시 정맥 RB의 ADMI에 따라nistration는 RB는 눈과 시신경의 뒷면에있는 혈관을 통해 순환. 12 초 원하는 정도에 따라 허혈 - 레이저 빔 (7)가 디스크를 조명하는데 사용된다. 온 머리에서 나오는 큰 망막 혈관을 살려주는 동안 (작은 빨간 라인의 손실과 같은 신경의 왼쪽에 보이는 축삭 허혈) 레이저는 머리 앞쪽에 모세 혈관 폐쇄의 원인 슈퍼 옥사이드 라디칼을 생성하는 광 증감 RB를 활성화 눈에. 초점 허혈은 현지화 된 축삭 장애 (분리 된 녹색 선)를 생성한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

컬러 사진과 SD-OCT를 사용하여 그림 3. 기준 정상 망막 (RET)과 시신경 (ON) 분석. A. 그림입니다. 망막 혈관이 망막의 내부 층을 제공하기 위해 광학 디스크로부터 나온다. 디스크가 명확한 경계와 붉은 주위의 색조 (맥락막 플러시)가 있습니다. 망막 혈관이 가늘고 고르게 분포입니다. 시신경 디스크 이익률은 일반적으로 잘 rNAION 유도하기 전에 경계가된다. 정상 안저의 B. 사진을 얼굴 SD 간섭 단층 영상 엔으로. 패널 C에 도시 된 망막의 개별 단면 사진 녹색 상자 내에서 생성된다. 스캔 방향은 녹색 화살표로 표시됩니다. 망막 층을 나타내는 정상 망막과 시신경 유두의 C. 단일 SD 간섭 단층 단면 스캔을. 망막 신경 섬유층 (RNFL, 작은 흰색 화살표)는 회색 모양을 가지고 있지만, 기본 외부 핵 층 (ONL, 작은 흰색 화살표)보다 가볍다. 망막 신경 섬유층은 시신경에 평평하다. 시신경 그림자 (표시 좁다 )이 화살표로 거라고. ON : 시신경. 망막 신경 섬유층 : 망막 신경절 세포 / 신경 섬유 층. ONL : 외부 핵 층. 스케일 바 :. 200 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4. rNAION 유도 외관. A. 532 nm의 / 전신 RB 주입없이 시신경 디스크와 망막의 500 μm의 자리 레이저 조명. 시신경 디스크 및 망막은 어둡다. B. 532 nm의 레이저 조명 전신 RB 주입 후 30 초. 온 녹색 레이저 광에 의해 조명 된 혈류 전신 RB를 나타내는, 레이저 스폿의 위치에 디스크로부터 나오는 용기 내의 황금 광선을 나타낸다.g "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5. rNAION 유도. A. 색상 안저 사진 주변의 맥락막 높이의 손실, 붓기와 시신경 유두 창백를 보여줍니다 이일 후 망막 및 시신경 분석. 정맥은 보통 박스 (중단 흐름) 정맥에 때때로 확대 및 곡선있다. B. 욕실 얼굴 SD 간섭 단층 사진 포스트 유도 디스크 부종과 정맥 팽창을 보여줍니다. 개인 단면은 녹색 상자 내에서 생성된다. 스캔 방향은 녹색 화살표로 표시됩니다. 망막 신경 섬유층의 증가 두께 (높은 수분 함량과 더 흰색, 일관성) 감소 회색 강도에 의해 입증 C. 크로스 섹션, 디스크 부종를 보여줍니다. BL 사이 인트라 망막 ON의 직경 ()이 증가 ACK 화살표입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

시신경 손상 (시신경의 호감 ^(12), 시신경 절개 ^(13), 및 PION ^14)의 모델 번호가 있지만, rNAION 모델은 쥐 모두에 적용 할 인간이다. 그것은 더 밀접하게 NAION의 인간의 임상 상태를 닮았다. 이 조건은 장시간의 과정을 통해 점진적 전방 시신경 부종, 전방 시신경 구획 증후군, 초점 축삭 허혈, 고립 된 망막 신경절 세포 축삭 손상과 손실을 포함한다. 현재보고는 rNAION 유도하기위한 적절한 조치를 제공 유도시 잠재적 인 문제를 설명하고 설명 이른 후 유도 전에 데이터 개재물에 의한 병변의 품질을 평가하는데 사용될 수있는 분석한다. rNAION 모델의 장점은 실제와 손상의 비교적 일관된 레벨을 달성 할 수 있다는 것이다. 일반적으로 10 - 65 % RGC 손실 - 40에서 11 초 노출 결과. 성공률은 각각의 개별 드 다를 수 있습니다경험과 지식을 보류하지만, 숙련 된 연구자가 거의 100 %를 유도 율을 달성 할 수있다.

유도의 용이성뿐만 아니라, 병변의 정도 및 시간 과정을 쉽게 모니터링 할 수있다. 장점 모델에 추가 할 수 rNAION 모델의 품질 관리의 중요한 초기 부분 이른 후 유도 분석이다. 시신경 부종이 최대 일 때 우리는 보통 이틀 유도 후 동물을 평가합니다. rNAION은 시신경 창백 고립 된 망막 신경절 세포의 손실로 이어 (약 5 배 빠른 인간에서 발생하는 것보다) 5 일의 기간 동안 해결 시신경 부종을 특징으로한다. 하나는 망막의 투명성과 망막의 미백의 손실에 의해 (시신경 허혈에서와 같은 별개의) 망막 허혈을 식별 할 수 있습니다. 망막 허혈은 기능적으로 전위도 (ERG)와 내부 망막 신호의 손실에 의해 확인된다. 망막 투명성과 흰색의 대폭적인 손실이있는 경우망막의 닝, 그것은 망막 중심 정맥 폐쇄와 일치, 혼자 rNAION하지 확산 망막 허혈을 시사한다. 동물의 수 (또는 단면 전체 망막 미백 특징)에서 중증 망막 허혈의 유도 결과, 유도 파라미터들은 하나 또는 두 개의 초의 노출 시간을 감소시킬 수있는 경우. 하나는 시신경 손상의 정도 양을 최적화하며, 동물에서 유도의 일관성을 얻을 수있는이 방법. ERG 신호의 상당한 손실과 동물 연구에서 제거해야합니다. 시신경 기능의 고립 된 손실은 플래시 시각 유발 전위 측정 (VEP)에서 확인할 수있다.

rNAION 모델을 사용할 때 염두에 두어야하는 많은 변수가있다. 개별 동물은 병변의 전체적인 정도 다를 수 있고, 그래서 다수의 동물 신경 분석에 사용되어야하고, 전력 분석은 STA를 달성하는 데 필요한 동물의 최소 수를 결정하기 위해 수행되어야보다 소규모의 보호 효과를 보이거나 예상된다 특히 tistically 유효한 결과. 15 동물 래트에서 25 % RGC 보호 효과를 결정하기 위해 필요하며, (15) - - 우리는 (10)가 있음을 발견 하였다 생쥐 20 동물을 사용하는 경우. 유도에 사용되는 RB의 염료를 신속하게 제거되기 때문에 동물 주입되면, 변화는 유도를 수행하는데 필요한 시간의 속도에 의존 할 수있다. 약간의 광학 디스크의 초점 차이, 레이저 조사 각도의 차이, 유도의 속도 차이는 결과에 영향을 미칠 수있다. 하나의 전용 개별 더 변동을 줄이기 위해, 각 실험에서의 기술을 수행하기 위해 선택되어야한다. 대략 10 - 유도 된 동물의 15 %로 인해 유도 (중앙 또는 망막 분지 정맥 폐쇄)의 정도에 이른 후 유도 평가 한 후 제거해야 할 수 있습니다. 이 보고서는, 같은 성별의 차이에서 같은 결과에 영향을 미칠 수있는 수많은 다른 고유 변수를 설명하지 않습니다활동 일주기, 연령 또는 변형의 차이. 이러한 질문은 개별 연구자에 의해 만족해야합니다. 이러한 80 mW의 레이저 파워 ¹⁵ 최근에보고 된 다른 수정 된 매개 변수 설정이 있습니다. 이러한 변형은 다른 콘택트 렌즈 또는 레이저 파장을 사용하지만, 유사한 결과 결과.

이는 임상 NAION의 여러 측면에 rNAION의 유사성에도 불구 rNAION이 모델임을 인식하는 것이 중요하며, NAION의 실제 원인 인자를 알 수 있기 때문에 더 모델은 인간 질병의 완전 중복되지 않고, 혈관 및 염증성 설치류의 망막 및 시신경의 생리 학적 제어는 인간과 비인간 영장류로부터 여러 가지면에서 다르다. 모델에 의해 생성 된 결과는 이러한 차이의 관점에서 해석되어야한다. 이에 상관없이 상기 rNAION 모델 빠르게 시력 상실 및 방법에 대한 책임이있는 잠재적 인 병태 생리 학적 메카니즘 많은 해부의 유용한 방법은살아있는 포유류 시스템에 신경을.

저자는 공개 아무것도 없어.

우리는이 모델에 작업 한 많은 학생들과 동료가 효율성을 개선하기 위해, 그 메커니즘을 이해 부탁드립니다. 특별 감사는 박사의에 기인한다. 메리 존슨 (메릴랜드 볼티모어 대학), Nitza 골덴 - 코헨 (Schneiderman 어린이 병원, Petah-티크, 이스라엘), 찰스 장 (아인슈타인 의과 대학, 브롱스, NY), 그리고 발레리 Touitou (원무 Salpetrie, 파리, 프랑스). 이 연구는 SLB에 RO1의 EY015304에 의해 부분적으로 투자되었다.