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이 비디오 프로토콜은 신경 식민지 - 형성 세포 분석을 사용하여 신경 전구체 세포의 혼합 인구의 타고난 신경 줄기 세포를 차별하고 열거하는 방법을 보여줍니다.
neurosphere 분석 (NSA)은 분리 확장하고 또한 신경 줄기 세포 (NSCs)의 주파수를 계산하기 위해 가장 자주 사용되는 방법 중 하나입니다. 또한,이 혈청이없는 문화 시스템은 또한 줄기 세포를 확장하고 종양과 정상 조직의 다양한 그들의 주파수를 결정하기 위해 채용되었습니다. 이것은 일대일 관계가 neurosphere 형성과 NSCs 사이에 존재하지 않는다는 것을 최근에 표시되었습니다. 이것은 NSA와 같은 현재 적용가 배아와 성인 포유류의 뇌 모두에서 분리된 신경 전구체 세포의 혼합 인구 NSCs의 빈도를 과대 평가하는 것이 좋습니다. 이 비디오는 거의 세미 솔리드 분석을 기반으로 소설 콜라겐을 보여, 신경 식민지 따라서 자신의 장기 proliferative 가능성에 따라 전구 세포에서 줄기를 차별하는 능력을 가지고 있으며, 세포 분석 (N - CFCA)를 형성하는 방법을 제공합니다 NSC 주파수를 열거할 수 있습니다. 식민지가 <2mm가 progenitors에서 파생하는 동안 N - CFCA에서 직경 식민지 ≥ 2mm는 NSC의 모든 기능 기준을 만족하는 세포에서 파생됩니다. N - CFCA 절차는 기본 및 교양 성인이나 배아 마우스 CNS 세포를 포함하여 서로 다른 소스에서 준비 전지에 사용될 수 있습니다. 여기 통로에서 N - CFCA을 수행하기 위해 배아 일 14 쥐 두뇌에서 발생 한 neurospheres을 준비 세포를 사용합니다. 문화는 도금 세포들이 전체 proliferative 잠재력을 전시 있도록하고 신경 시조와 타고난 신경 줄기 세포의 빈도가 <2mm 아르 콜로니의 수를 계산하여 각각 계산 확산 매체로 삼 주 동안 매일 7 일 보충함 아르 그리고 ≥ 2mm 처음 도금되었습니다 세포의 개수에 대한 언급 손님.
1. 전지 도금을하기 전에 준비를해야 항목 :
2. 셀 준비 :
실험에 따라 세포는 성인이나 배아 소스 (주 dissociated 조직 또는 dissociated neurospheres)에서 준비하실 수 있습니다. 성인 / 마우스 배아 중추 신경계 (CNS)에서 조직을 해부하다 또는 다음 1,2 앞에 설명한 배아 - 유래 / 성인 neurospheres을 떼어 놓다 :
3. 세미 솔리드 N - CFCA 매체에 도금 셀 :
4. 보충 매체를 준비하고 문화를 먹이 :
N - CFCA 문화는 시간 (21 일)의 기간 동안 incubated이므로, 문화는 적절한 전체 NeuroCult와 공급한다 보충 매체는 다음과 같이 신선한 준비 :
5. N - CFC 분석 유래 식민지를 채점하고 타고난 NSCs 및 신경 전구 세포의 빈도를 계산 :
6. 대표 결과 :
칠일 도금 후 (그림 1) - neurosphere 분석에서와 마찬가지로, N - CFC 분석에 도금 세포 3 이내에 세포의 작은 식민지를 분아 따위에 의해 번식하고되기 시작한다. 2 주 시간에서 다양한 크기의 식민지가 구별하실 수 있습니다. 식민지의 대부분의 14 일 후에 성장을 중지하는 경향이 있지만, 일부 식민지는 크기가 증가되고 있습니다. 1mm 직경, 3) 1 - - 2mm 직경 4) ≥ 2mm 직경 미만 0.5 mm 직경, 2) 0.5 1) : 일 21에 의해 식민지는 4 가지 범주 중 하나에 분류 될 수 있습니다. 실제로, 시조가 파생된로 2mm 직경보다 작은 식민지가라고합니다 (그림 2)와 NSC는 (그림 3)과 같은 파생 식민지는 직경 ≥ 2mm가라고합니다. 도금 총 세포마다 직경 식민지 ≥ 2mm의 숫자는, 장기적인 자기 갱신과 다중 잠재적인 기능을 갖춘 실제 타고난 신경 줄기 세포의 빈도를 나타냅니다. 병렬 NSA 실험에서 7~8일 후 특정 세포 인구의 주파수를 형성 총 neurosphere은 N - CFCA 실험 21 일 후 같은 세포 인구의 주파수를 형성 전체 식민지와 유사한 것으로 추산되었습니다. N - CFCA 그러나, 각 세포는 전체 proliferative 가능성을 보여 줄 수 있도록 같은 더 허용 조건을 제공합니다.
구성 요소 | 2 복제 | 3 복제 | 4 복제 |
크린 시토킨없이 NeuroCult NCFC 세럼 - 무료 중간 | 1700 | 2550 | 3400 |
NeuroCult NSC 확산 보조 식품 | 330 | 495 | 660 |
EGF (10 μg / ML) | 6.6 | 9.9 | 13.2 |
성인용 전지 bFGF (10 μg / ML) | 3.3 | 4.95 | 6.6 |
성인용 세포에 대한 헤파린 솔루션 (0.2 %), | 3.3 | 4.95 | 6.6 |
페니실린 / 스트렙토 마이신 (1:100) | 32 | 48 | 64 |
:에서 셀 2.2 X 10 5 교양 세포 / ML 또는 6.5 X 10 5 일차 전지 / ML | 25 | 37.5 | 50 |
콜라겐 솔루션 | 1300 | 1950 | 2600 |
표 1. 완벽한 N - CFC 분석 문화의 구성 요소.
1. 통로 하나 E14 마우스 NSCs의 N - CFCA 문화의 대표 식민지 칠일 도금 후 그림. 식민지 다른 형태와 크기를 표시 수도 있습니다. 원본 확대, 4X
그림 2. 통과 N - CFCA 문화에서 다른 크기 21일 도금 후에도 E14 마우스 NSCs 대표 시조 파생 식민지. 그림과 같이, 식민지는 다른 형태가 있지만 모든 크기가 적은 2mm입니다. 원본 확대, 4X
그림 3. 대표 타고난 줄기 세포는 21일 도금 후 통과 한 E14 마우스 NSCs을의 N - CFCA 문화 식민지를 파생. 줄기 세포 유래 식민지는 (보고 서로 다른 형태를 표시할 수 있습니다비디오)하지만, 모두가 직경 ≥ 2mm입니다. 원본 확대, 4X
neurosphere 검정 3,1,2은 성인과 배아 CNS 조직과 같은 다양한 소스로부터 신경 줄기 세포를 분리하고 확장하는 가장 일반적인 방법이지만, 정확하게 신경 전구체 세포의 혼합 인구 NSC 주파수를 측정할 수 없다 (줄기와 progenitors) neurospheres의 수와 타고난 줄기 세포 4의 사이의 숫자 1-1 관계가 아니므로. 이 제한을 해결하려면, 원본 NSA는 신경 줄기와 progenitors은 5-7 삼 주 동안 그들의 전체 확산 용량 성장할 수 있도록처럼 맞게되었습니다. 반 고체 콜라겐 매트릭스가 식민지의 한 도금 세포 및 집계의 마이 그 레이션을 방지 등 액체 NSA 달리, N - CFCA의 식민지 실제로 clonally, 파생됩니다. 이 분석과 일치의 결과를 얻으려면 우리는 좋습니다
이 작품은 오버 재단 기금에 의해 지원되었다.
Name | Company | Catalog Number | Comments | |
NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
NeuroCult NCFC medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05720 | |
0.05% trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
Collagen | Reagent | Stem Cell Technologies | 04902 | |
EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
35 mm culture dishes | Culture ware | Stem Cell Technologies | 27100 | |
Gridded scoring dishes | Culture ware | Stem Cell Technologies | 27500 |
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