私たちの研究は、バイオエンジニアリングされた金属ナノ粒子の創傷治癒の可能性を明らかにすることに焦点を当てています。私たちは、これらのナノ粒子が治癒過程とその作用機序にどのように影響するかを理解し、組織修復におけるナノ粒子の治療応用に関する重要な問題に対処することを目指しています。私たちは、天然ポリマーを用いた様々なナノベースの創傷被覆材の開発に成功し、多様な創傷治癒への応用の可能性を実証し、組織修復における革新的なアプローチを進めてきました。
本研究は、in vivoモデルにおける潜在的なメカニズムの同定を促進し、生体適合性を有する創傷治癒材料の開発に貢献し、その有効性と安全性を高め、様々な医療応用に応用できると期待されます。まず、Eucommia ulmoidesの木から集めた樹皮をはさみを使って細かく切ります。刻んだ樹皮材料を二重蒸留水で2回洗います。
その後、樹皮片を37°Cで日陰の状態で24時間乾燥させます。20グラムの日陰乾燥樹皮を、220ミリリットルの滅菌二重蒸留水を含む円錐形のフラスコに移します。次に、フラスコを摂氏130度で20分間加熱します。
10分後に溶液の色が淡黄色に変わることに注意してください。その後、ポリイソプレンを含む粗抽出物を摂氏4度で保存して、さらに使用します。糸状構造の形成は、抽出物中のポリイソプレンの存在を示しています。
500ミリリットルの円錐形フラスコに50ミリリットルの脱イオン水に1モルの硝酸亜鉛二水和物を加えます。硝酸亜鉛二水和物が完全に溶解するまで、マグネチックスターラーを使用して溶液を60RPMで連続的に攪拌します。次に、15ミリリットルのEucommia ulmoides樹皮抽出物を、20ミリリットルの1モル硝酸亜鉛二水和物溶液に滴下します。
蓋をした反応混合物をマグネチックスターラーに置きます。スイッチを入れて、3時間回転するように設定します。次に、反応混合物に1つの正常水酸化ナトリウム溶液を滴下して、pHを9に調整します。
溶液が乳白色に変わるまで水酸化ナトリウムを加え、pHを9未満に保ち、酸化亜鉛ナノ粒子の形成を示します。次に、合成したEucommia ulmoides酸化亜鉛ナノ粒子を50ミリリットルの遠心分離管に移し、100Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。洗浄したEucommia ulmoides酸化亜鉛ナノ粒子をガラス板に集め、45〜50°Cで熱風オーブンで1時間乾燥させます。
まず、96ウェルプレートの各ウェルに4つのヒト臍帯静脈内皮細胞の1×10の累乗で播種します。プレートを5%二酸化炭素と摂氏37度に設定されたインキュベーターに入れます。細胞毒性評価のために、10マイクロリットルの様々な濃度のEucommia ulmoides酸化亜鉛ナノ粒子を90%コンフルエントセルに加えます。
プレートを5%二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で24時間インキュベートします。インキュベーション後、細胞を乱さないように古い培地を慎重に取り出します。90マイクロリットルの新鮮なDMEM培地を含む各ウェルに10マイクロリットルのCCK-8溶液を加え、前に示すようにプレートをインキュベートします。
次に、CCK-8溶液で処理した細胞の吸光度を450ナノメートルで分光光度計で測定します。DMEMを含む12ウェル培養プレートに5人のヒト臍帯静脈内皮細胞の累乗で1×10を播種し、10%FBSおよび1%ペニシリンストレプトマイシンを添加します。プレートを二酸化炭素5%、摂氏37度に設定されたインキュベーターに入れます。
滅菌済みの200マイクロリットルピペットチップを使用して、細胞単層を静かに引っ掻き、幅200マイクロメートルの代表的な創傷を作成します。ウェルから完全な培地を取り除いた後、1ミリリットルのPBSを使用して単層を優しく洗浄し、分離した細胞を取り除きます。次に、ミリリットルあたり0、10、および20マイクログラムのEucommia ulmoides酸化亜鉛ナノ粒子溶液を、10%FBSを含む完全な培地と組み合わせてウェルに加えます。
プレートを摂氏37度で5%二酸化炭素インキュベーターでインキュベートします。倒立顕微鏡を使用して、0時間後と24時間後に引っかき傷の顕微鏡写真を取得します。ここに示す式を使用して、創傷閉鎖の割合を計算します。
Eucommia ulmoides酸化亜鉛ナノ粒子は、24時間後にミリリットルあたり50マイクログラムまでの濃度で、ヒト臍帯静脈内皮細胞に細胞毒性を示さなかった。創傷閉鎖は、1ミリリットルあたり20マイクログラムのEucommia ulmoides酸化亜鉛ナノ粒子で処理された細胞で有意に強化され、対照群の16%と比較して、24時間後に81.5%の閉鎖が示されました。顕微鏡画像は、24時間後の対照と比較して、20マイクログラム/ミリリットルの治療群で創傷ギャップ幅が減少したことを示しました。
