ほとんどの健康状態は、早期に発見すればより適切に管理できます。アクセス可能な体液中で利用可能なバイオマーカーは、健康状態を早期に発見するための最も有望な方法です。私たちは、ヒトの脳から小さな細胞外小胞を介して放出されるマイクロRNAバイオマーカーの探索方法の改善を報告しています。
この方法により、認知症などの疾患の異なる遺伝的サブタイプ間での小さな細胞外膀胱カーゴの変動を特定し、末梢液中に検出できるカーゴバイオマーカー候補を特定し、疾患の早期診断を強化することができました。したがって、このプロトコルは、効率、アクセシビリティ、および製品の純度のバランスが取れているため、さまざまなラボ環境で簡単に再現できます。特別な機器は必要なく、事前にパッケージ化されたカラムが一貫性を提供します。
したがって、バイオマーカーの所見は、望ましい臨床結果に簡単に変換できます。新しい疾患修飾薬が承認される中、患者の利益を最大化するためには、診断が現在よりもはるかに早期にこれらの疾患を治療する必要があります。このような方法は、新しい疾患関連のマイクロRNAバイオマーカーの特定につながり、特定の治療とケアオプションを使用したより良い健康管理につながる可能性があります。
私たちは、既存の能力を活かして、体液中の不均一な混合物の中から特定の細胞種から放出されるマイクロRNAバイオマーカーを検出できる組織および細胞型特異的マーカーを同定する方法を開発します。まず、滅菌したメスを使用して、冷たいプレートで250ミリグラムの凍結脳組織を薄くスライスします。冬眠液中の3ミリリットルあたり75単位を組織に加えます。.
各サンプルを摂氏37度の水浴に20分間入れます。5分が経過したら、サンプルを2回反転させて混合します。10分経過したら、10ミリリットルのプラスチック製ディスポーザブルストリペットを使用して、サンプルを3回静かにピペットで移します。
次に、各サンプルを氷上に配置し、各サンプルにプロテアーゼ阻害剤カクテルとホスファターゼ阻害剤を加えます。各脳組織サンプルを300Gで4°Cで10分間遠心分離します。上清を集めます。
その後、2000Gで摂氏4度で15分間遠心分離します。次に、上清を収集し、0.22マイクロメートルのフィルターでろ過します。次に、濾液を10, 000Gで摂氏4度で48分間遠心分離します。
上清を採取した後、各サンプルに2対1の比率で沈殿バッファーを添加します。そして、サンプルを摂氏4度で一晩インキュベートします。次に、各サンプルを10, 000Gで摂氏4度で96分間遠心分離します。
そして、ペレットを100マイクロリットルの細胞外小胞を含まないPBSに再懸濁します。あらかじめ調製したサイズ排除クロマトグラフィーまたはSECカラムを室温で15分間平衡化します。平衡化後、カラムの上部から保存剤バッファーを取り出し、250マイクロリットルの細胞外小胞を含まないPBSを使用してカラムを2回洗浄します。
次に、再懸濁したペレットをカラムに加え、50Gで30秒間遠心分離します。フロースルーを廃棄した後、180マイクロリットルのEVフリーPBSを追加し、カラムを50Gで1分間遠心分離して、脳由来の小さな細胞外小胞を溶出させます。小さな細胞外小胞をシラミにするには、単離された小さな細胞外小胞サンプルを溶解および抽出バッファーと等しい比率で希釈します。
希釈したサンプルを摂氏4度で30分間撹拌します。次に、サンプルを14, 000Gで15分間遠心分離します。タンパク質上清を採取し、タンパク質アッセイキットを使用してタンパク質濃度を測定します。
ナノ粒子追跡分析を行うには、各サンプルをPBSで1〜1000の希釈係数で希釈します。サンプルをNTA装置に注入します。そして、550ナノメートルの波長でサンプルを読み取るように装置を設定します。
粒子量を使用して、MISEVガイドラインに従ってフェムトグラムで表される粒子あたりのタンパク質の量を測定します。次に、PBS中のセルマスクオレンジまたはCMO色素を1〜1000の希釈係数で希釈します。次に、1〜10の希釈係数を使用して、CMO色素を小さな細胞外小胞サンプルで希釈します。
そして、混合物を暗所で摂氏4度で30分間インキュベートします。次に、CMO色素の小さな細胞外小胞混合物をPBSを使用して、1〜1000の希釈係数でさらに希釈します。NTA装置を使用して、各小さな細胞外小胞サンプルのCMO色素を550ナノメートルの波長で読み取ります。
蛍光抗体の追跡では、各テトラスパンと蛍光抗体を1〜10の希釈係数を使用してPBSで希釈します。次に、1〜10の希釈係数を使用して、各抗体色素を小さな細胞外小胞サンプルで希釈します。そして、混合物を暗所で摂氏4度で2時間インキュベートします。
次に、PBSを用いて2番目の抗体混合物を1〜1000の希釈係数で希釈します。NTA装置を使用して、550ナノメートルの波長で小さな細胞外小胞サンプルの蛍光抗体シグナルを読み取ります。ウェスタンブロット解析により、脳由来の小さな細胞外小胞に陽性マーカーCD9、CD63、CD81、Flotilla One、およびTSG101が存在することが確認されましたが、カルネキシンは存在せず、細胞汚染がないことを示しました。
ナノ粒子追跡分析により、単離された粒子のサイズは50〜200ナノメートルの範囲であり、ピーク濃度は約100ナノメートルであることが明らかになりました。CMO染色データによると、粒子の52.35%が脂質二重膜を持ち、そのうち34.66%がCD9、15.49%がCD63、12.01%がCD81を含んでいました。
