Strand-Specific Analysis of Proteins at Replicating DNA Strands by Enrichment and Sequencing of Protein-Associated Nascent DNA Method

私たちの研究は、エピジェネティックな遺伝のメカニズムに焦点を当てています。具体的には、DNA複製は親のヒストンリサイクルプロセスを結合し、これはエピジェネティックな遺伝の最初の放出ステップを表しています。DNA複製に関与する複数の親ヒストン沈着が、親ヒストンのリサイクルに重要な役割を果たすことが確認されました。

これには、Dヘリカーゼ複合体、DNAポリメラーゼ、および保護複合体の複製が含まれます。この研究分野では、従来の遺伝的および生化学的アプローチが価値として使用されてきました。従来、親のヒストン転写プロセスを理解するために、ハイスループットシーケンシング法が採用されてきました。

タンパク質関連DNAの濃縮とシーケンシング、つまり実験方法が開発される前は、親のヒストン転写プロセスを研究することは困難でした。この実験方法は、これらの基本的な疑問を解決するための強力なツールを提供しました。まず、酵母細胞ペレットをヤスリで削り、穏やかなボルテックスで再懸濁します。

次に、プロテアーゼ阻害剤と抗生物質混合物を含む0.4ミリリットルのCHIP溶解バッファーで同じものを洗浄し、細菌汚染を防ぎます。混合物を5, 000 Gで1分間遠心分離します。次に、0.1ミリリットルのCHIP溶解バッファーとプロテアーゼ阻害剤および抗生物質混合物をペレットに加えます。

続いて約100マイクロリットルの0.5ミリメートルガラスビーズが続きます。摂氏4度の冷蔵室でビーズビーズを3サイクル使用して細胞を溶解します。16ゲージのホットニードルを使用して、チューブの底に穴を開けます。

穿刺したチューブを1.5ミリリットルの空のDNA低結合チューブに入れ子にしてライセートを収集し、室温で1,600Gで2分間遠心分離します。ペレットを乱さないように上清を慎重に吸引します。細胞破片画分にはクロマチンが含まれます。

0.35 mLのMicrococcalヌクレアーゼまたはMNase消化バッファーをピペッティングして、細胞ペレットを再懸濁します。次に、懸濁液に MNase を 10 ユニット追加します。4〜6回反転させて穏やかに混合し、摂氏37度の水浴中で20分間インキュベートします。

5マイクロリットルの0.5モルEDTAを最終濃度10ミリモルに添加することにより、MNase消化をクエンチします。反転させて穏やかに混合し、チューブを氷の上に少なくとも30分間置きます。1.5ミリリットルのBioruptorマイクロチューブを使用して、反応混合物を高出力で3分間超音波処理し、30秒オンと30秒オフのサイクルで行います。

次に、摂氏4度で5分間、10, 000 Gで遠心分離します。上清を新しいチューブに移し、摂氏4度で10,000Gで10分間再度遠心分離します。次に、約400マイクロリットルの上清を収集します。

DNA抽出用のインプットDNAとして30マイクロリットルを保存し、摂氏マイナス20度で凍結します。残りの370 μLの細胞溶解物をヒストンクロマチン免疫沈降に使用します。まず、以前に取得したインプットサンプルとH3K4me3チップサンプルの約150マイクロリットルを摂氏100度のヒートブロックで沸騰させます5分間、すぐにサンプルを氷上で5分間冷やします。

次に、上記の成分を必要な量をサンプルに加えます。サンプルをローター上で摂氏4度、10RPMで2時間変異させます。混合物を、20マイクロリットルの洗浄したプロテインGセファロースビーズが入った1.5ミリリットルのチューブに移します。

混合物をローター上で摂氏4度で10RPMで1時間変異させます。チューブを室温で800Gで1分間回転させます。1ミリリットルの冷たいブロモデオキシウリジン、またはBrdU免疫沈降バッファーで3分間回転させて、各洗浄でビーズを3回洗浄します。

チューブを再度遠心分離し、1ミリリットルのTEバッファーで3分間洗浄します。チューブを再び800Gで室温で1分間回転させ、上清を注意深く吸引します。100マイクロリットルのTEバッファーと1%SDSをビーズに加えます。

混合物を摂氏65度で5分間インキュベートし、次いで室温で800Gで1分間遠心する。DNA精製カラムを使用して上清を18マイクロリットルの溶出バッファーに精製し、BrdU免疫沈降およびH3K4me3 eSPANサンプルを取得します。ssDNAおよび低インプットDNAライブラリ調製キットのマニュアルに従って、上記のサンプルで一本鎖DNAライブラリを調製します。

ライゲーション生成物を20マイクロリットルの低EDTA溶出バッファーに精製します。一本鎖DNAライブラリー調製キットの50マイクロリットルの反応ミックスを使用して、DNAライブラリーを増幅します。表示されたサイクルに従って、PCRミックスを増幅します。

PCR産物を摂氏30度に予熱した60マイクロリットルのビーズと混合して精製します。PCR産物とビーズを十分に混合します。混合物を室温で5分間放置します。

ビーズを磁気スタンドに3分間結合し、新たに調製した80%エタノールの200マイクロリットルで2回洗浄します。ビーズを2分間風乾し、DNAライブラリー調製キットに含まれている20マイクロリットルの低EDTAバッファーにDNAを希釈します。高分解能電気泳動システムを使用して、ライブラリの濃度とフラグメントサイズ分布を測定します。

インプットH3K4me3クロマチン免疫沈降、BrdU免疫沈降、eSPANサンプルなど、個々のライブラリを同量プールして、並列ペアエンドシーケンシングを実行します。H3K4me3 eSPANのDNAシーケンシングライブラリーの典型的なゲル解析により、クロマチンヌクレオソームラダーパターンが明らかになりました。主要なモノヌクレオソームバンドは、消化から得られたDNAフラグメントにアダプターが追加された270塩基対に現れました。

異なるサンプルマッピングにより、野生型細胞とmcm2-3A細胞の起源であるシーケンス607を自律的に複製する起源を囲む個々のヌクレオソームにピークが明らかになりました。平均鎖バイアスは、野生型酵母細胞では、親のヒストン沈着が遅れている鎖に対してわずかなバイアスを示すことを明らかにしました。しかし、突然変異体では親ヒストンH3H4がリーディングストランドに移された。