In Vitro Cultivation Techniques for Modeling Liver Organogenesis, Building Assembloids, and Designing Synthetic Tissues using Human Cell Lines

私たちの研究範囲は、この肝臓器官形成の領域にあります。私たちが答えようとしている問題は、肝臓がどのようにしてこれほど大きくなり、幹細胞から肝臓組織を構築するためのリバースエンジニアリングアプローチで肝臓を使用するのかということです。私たちの肝臓再生医療分野では、最も最近の進展が小型化の分野です。

幹細胞を使って、実際の臓器を再現したミニチュア組織を作っているのですが、それによって臓器形成や臓器生物学の研究ができるんです。当研究室では、肝臓再生医療の分野でいくつかの重要な知見があります。これらの小型化技術のいくつかを使用することで、形態形成や細胞移動など、肝臓の器官形成における重要なステップを特定しました。

これが、この分野での重要な発見の1つです。この出版物における私たちのプロトコルの利点は、小型化中にいくつかの異なるオルガノイド技術を可能にします。つまり、基本的には、他の技術では提供できない小さな肝臓組織での移動の分岐、形態形成、その他の側面などのプロセスを研究できるようになりました。

私たちがこれまで行ってきた研究により、今後私たちが問うことになる研究課題は、細胞の成長と移動がどのように調整されるのか、ということに関係しています。また、組織を肝臓に似たより大きな組織に組み立てることができるメカニズムについてもお尋ねします。まず、ヒト肝芽腫HepG2野生型細胞を、摂氏37度のT75フラスコで5%の二酸化炭素で培養し、培地を毎日交換します。

80%のコンフルエントに達したら、PBSで細胞をすすぎます。PBSを廃棄した後、0.05%のトリプシンEDTAの5ミリリットルで細胞をインキュベートします。次に、同量のcDMEMを添加して、フラスコから細胞を洗い流します。

細胞が剥離したら、混合物を15ミリリットルの滅菌円錐形遠心チューブに移し、細胞懸濁液を室温で5分間300Gで遠心分離します。cDMEMで細胞を再懸濁した後、細胞をカウントして、ミリリットルあたりの細胞数での最終濃度を決定します。細胞を標識するには、15ミリリットルの円錐管内で300 Gで5分間細胞を回転させます。

ペレットを無血清増殖培地に再懸濁して、最終濃度が10の1倍/1ミリリットルあたり6細胞の倍数になるようにし、回転して細胞懸濁液1ミリリットルあたり5マイクロリットルの蛍光細胞標識溶液とインキュベートします。次に、細胞懸濁液を450 Gで5分間遠心分離し、細胞ペレットを新鮮なcDMEMに再懸濁します。スフェロイド形成のためには、細胞懸濁液を混合し、アガロース被覆96ウェルプレートの各ウェルに100マイクロリットルの細胞懸濁液を分注します。

プレートを340Gで10分間遠心分離し、5%二酸化炭素と摂氏37度で5〜9日間インキュベートします。肝臓のスフェロイドは、サイズに関係なく、5日目までに完全に圧縮され、厚くなるにつれて半透明から不透明に変化しました。まず、96ウェルプレートで肝臓スフェロイドと間葉系スフェロイドを入手します。

ピペットを使用して、ヒト包皮線維芽細胞またはHFF MRC-5スフェロイドを個々に採取し、新鮮なcDMEMが入った15ミリリットルの滅菌円錐形遠心チューブに入れます。スフェロイドを氷の上で5分間インキュベートして沈殿させた後、温かいcDMEMで優しくすすいでください。ピペットを使用して、単一のHFF MRC-5スフェロイドをヒト肝芽腫G2野生型スフェロイドを含むウェルに静かに移します。

スフェロイドを氷冷成長因子還元マトリゲルと1:1希釈でインキュベートします。次に、75マイクロリットルの新鮮なcDMEMを各ウェルに加え、5%の二酸化炭素と摂氏37度で2〜3日間インキュベートします。蛍光顕微鏡法と画像解析により、アセンブロイド形成は異なるマトリックスと培地で成功したことが確認されましたが、わずかな形態学的変化が認められました。

さらなる解析により、スフェロイドの近接性が圧縮時間の短縮につながることが明らかになりました。まず、ヒト肝芽腫G2野生型細胞から肝スフェロイドを入手します。スフェロイドを個別に15ミリリットルの滅菌円錐形遠心分離機に集め、チューブを氷の上に置いてスフェロイドを沈殿させます。

次に、チューブから培地を慎重に吸引します。別の15ミリリットルの滅菌チューブに、1ミリリットルの氷冷成長因子還元マトリゲルまたはGFR MGと氷冷コントロール増殖培地を1:1の希釈で混合します。スフェロイドを含むチューブに混合物を加え、スフェロイドが均一に分布するようにします。

200マイクロリットルのピペットを使用して、MG溶液に15マイクロリットルの単一回転楕円体を収集し、60ミリメートルのペトリ皿にゆっくりと播種します。次に、液滴を摂氏37度で5%二酸化炭素と60分間インキュベートし、目的の成長培地5ミリリットルをペトリ皿にゆっくりと加えます。Hepスフェロイドは、9日目までに線維芽細胞クラスターに向かって突き出た太い移動鎖を発達させました。

まず、ヒト包皮線維芽細胞、またはHFF MRC-5細胞を採取し、それらをT75組織培養フラスコに播種し、1平方センチメートルあたり5, 000細胞の密度で処理します。フラスコを摂氏37度で5%二酸化炭素と15ミリリットルのcDMEMで72時間インキュベートします。次に、間葉系馴染培地(M-CM)を15ミリリットルの滅菌円錐管に集め、290Gで5分間遠心分離して破片を取り除きます。

上清を0.2μmのフィルターでろ過して滅菌し、濾液を保持します。次に、目的の実験のために、M-CMを完全な増殖培地で最大1:7の希釈比で希釈します。HFF MRC-5細胞を新鮮なcDMEMに懸濁して、10の6倍の最終濃度を1ミリリットルあたり5細胞の累乗にし、チューブを氷上に置きます。

細胞懸濁液と氷冷した成長因子を還元したマトリゲルまたはラットテールコラーゲンを1:1希釈で混合します。100マイクロリットルのHFF MRC-5とマトリゲル溶液を肝臓スフェロイドを含むウェルに移し、プレートを摂氏37度で5%二酸化炭素と30分間インキュベートします。最後に、75マイクロリットルの新鮮なcDMEMを各ウェルに加え、最大12日間インキュベートします。

集団移動は、M-CMによる肝スフェロイドの液滴形成を使用してin vitroで効果的に誘導されました。M-CMの濃度依存性効果は、細胞鎖の出現とスフェロイドからの分岐を促進しました。11日目までに、スフェロイドからの細胞突起はより顕著になり、相互接続されたシートを形成しました。