ヒト落葉歯および永久歯からの歯髄幹細胞の単離、培養、および特性評価

抜歯した人間の歯を歯科用鉗子で所定の位置に固定することから始めます。次に、歯科用ハンドピースに接続されたダイヤモンドディスクと水冷却剤を使用して歯をカットします。歯科用鋭錬機を使用して、歯から歯髄組織を取り除きます。

次に、滅菌外科用ブレードを使用して、歯髄組織を慎重に細かく刻みます。次に、これらのフラグメントをPBSを使用したミニティッシュグラインダーに入れて、均質な混合物を形成します。細かく刻んだ組織片を15ミリリットルのチューブに移し、コラゲナーゼタイプ1とディスパーゼの混合物を使用して消化します。

酵素混合物中の組織を摂氏37度で2時間インキュベートします。インキュベーション後、酵素を中和します。次に、消化した組織を15ミリリットルのチューブに移し、室温で300Gで5分間遠心します。

次に、上清を慎重に廃棄し、ペレットを新鮮なDMEMに再懸濁し、10〜20%FBSを補充します。細胞培養の場合は、細胞懸濁液を25平方センチメートルの培養フラスコに慎重に移します。細胞を摂氏37度で5%二酸化炭素でインキュベートします。

2〜3日後、滅菌血清ピペットを使用して、培地を慎重に吸引し、新しい培地と交換します。次に、DPSCの特性評価のために、フローサイトメーターをオンにし、単離された細胞の間葉系幹細胞の性質を確認します。DPSCが骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞に分化することが成功したことは、DPSCの多能性を実証しています。

DPSCの倍加時間は、間葉系幹細胞について報告された倍加時間と一致しており、健康で増殖性の細胞集団を示唆しています。フローサイトメトリー解析では、DPSCの大部分がCD-90、CD-73、およびCD-105に陽性であることが示され、間葉系幹細胞としての同一性が確認されました。さらに、CD-34、CD-45、およびHLADRに陽性であった細胞は2%未満であり、造血細胞または内皮細胞の重大な汚染がないことが確認されました。