ヒト神経構築物の埋め込み3D印刷のためのミクロゲル-細胞外マトリックス複合サポート

SHAPEコンポジット内に埋め込まれた3Dプリンティングは、従来のバイオファブリケーションの制限を克服し、天然の細胞外環境に似たヒドロゲル内の機械的に敏感な組織の正確なパターニングを可能にします。SHAPEツールボックスは、モジュール式の生体材料設計に依存しているため、印刷サポートの配合を簡単に変更できます。また、低コストの材料とアクセス可能な機器を活用して、他の研究グループによる簡単な適応を実現します。

このアプローチは、パーキンソン病などの神経変性疾患におけるニューロンの発生とコミュニケーションを調べるための空間的に定義されたヒト神経組織モデルの作成に適用できます。まず、超純水中の炭酸カルシウム溶液を2ミリグラム/ミリリットルの濃度で調製します。アルギン酸塩溶液と等しい比率で混合し、室温で650RPMで1時間磁気攪拌します。

次に、この混合物に酢酸を1対500の比率で加え、一晩再び攪拌します。翌日、ホモジナイザーを使用して、ゼリー状のアルギン酸塩溶液を15, 000 RPMで10分間機械的に微粒子に断片化します。その後遠心分離し、微粒子を得た。

上清を注意深く廃棄し、2ミリモルの水酸化ナトリウムと1%ペニシリンストレプトマイシンを含むDMEMに粒子を再懸濁します。サスペンションの色が赤に戻ります。懸濁液を摂氏4度で一晩インキュベートする。

インキュベーション後、懸濁液を15, 000 RPMで3分間ホモジナイズし、18, 500 Gで10分間遠心分離します。遠心分離後、上清を取り除き、ペレットに密集したアルギン酸微粒子がないか観察します。SHAPEコンポジットを生成するには、アルギン酸微粒子ペレットと希釈および中和コラーゲンを2対1の比率で混合し、氷上で上下にピペットで固定します。

生成した複合材料を冷却した24穴プレートに移す。印刷する前に、0.025%トリプシン溶液を使用して、以前に培養したヒト神経幹細胞またはhNSCを摂氏37度で5分間解離します。次に、増殖培地でトリプシンを中和し、細胞懸濁液を400 Gで室温で5分間遠心分離します。

上清を除去した後、細胞ペレットを2〜3ミリリットルの増殖培地に再懸濁する。21ゲージの鈍い金属針を使用して、100マイクロリットルのしっかりと詰められたアルギン酸塩微粒子をシリンジに入れます。次に、調製した細胞懸濁液を注射器に入れます。

印刷する場合は、ローディングニードルを27ゲージの鈍い金属ニードルと交換します。参照ソフトウェアを使用して、印刷する構造が設計されたら、Gコード生成のために生成をクリックします。細胞装填されたシリンジを押出ベースのバイオプリンターの容積測定ヘッドに挿入し、針の長さ測定プロセスの開始をクリックして針の長さを記録します。

次に、SHAPEコンポジットをロードした24ウェルプレートをプリンターに置き、SHMをクリックして空のウェル表面の高さを測定します。pH2を選択してからレンチ記号を選択します。次に、パラメータセットの下で、体積流量を毎秒3.6マイクロリットルに変更し、[パラメータの適用]、[保存]の順に押します。

Gコードを開くためのアイコンをクリックして、Gコードをプリンタのユーザーインターフェイスにロードします。プログラム実行のアイコンを選択して、印刷手順を開始します。印刷直後に、SHAPEゲルを摂氏37度で30分間インキュベートしてアニーリングします。

次に、アニーリングしたSHAPEゲル支持体に増殖培地を穏やかに加えます。免疫染色のために、ゲルから余分な培地を取り除き、スパチュラを使用して、ゲルをDPBSを含む容器に移します。プレートがヒュームフードに配置されたら、DPBSを取り外します。

ゲルを4%ホルムアルデヒド溶液で覆い、室温で1時間インキュベートする。DPBSで洗浄した後、ブロッキング溶液をゲルに加えます。プレートを穏やかに揺り動かし、不特異的結合を防ぐために室温で6時間インキュベートします。

ブロッキング溶液を除去したら、一次抗体をゲルに加え、穏やかに揺り動かします。プレートを摂氏4度で48時間インキュベートします。DPBS洗浄後、同様にゲルを二次抗体溶液で24時間処理する。

イメージングする前に、スパチュラで染色したゲルを薄いイメージング底部のウェルプレートに入れます。本研究では、hNSCインクは直径約200マイクロメートルの細胞のフィラメントを印刷しました。印刷されたストランドは、周囲の形態を有する生細胞が豊富であった。

印刷の30日後、細胞は小さな細胞体と長く薄い突起を伴う神経形態を示し、hNSCの分化に成功したことを示しています。チューブリンβ3による染色により、生成されたニューラルネットワークを形状を維持したまま可視化することができました。そして分化過程の間、細胞は印刷された鎖から遊走しなかった。

SHAPEコンポジットは、細胞の代わりに犠牲インクを印刷することにより、灌流性チャネルを生成するために使用できます。さらに、支持体は、3Dプリントされた構造の酸素張力を時間と空間にわたって監視するための酸素感受性ビーズを含むことができる。