このプロトコルは、広範囲の疎水性生理活性分子を安定して組み込んだナノスケールの粒子、すなわちナノディスクを処方するのに役立つ実用的な知識を提供します。この方法は多くの実用的な用途があります。
他の方法では不溶性の生理活性化合物に水溶性を付与する能力は、薬物送達アプリケーションにおけるナノディスクの使用を可能にする。説明されている方法は簡単です。ナノディスクの形成が目視検査によって容易にモニターされるように、記載されたスケール、5ミリグラムのリン脂質、2ミリグラムの足場タンパク質で研究を行うことが好ましい。
手順を実演するのは、ライアン研究室の学部生研究者であるマイケル・カロとマシュー・スワックハマーです。リン脂質アリコートを調製するには、5ミリグラムのDMPCを計量し、ガラス試験管に移します。300マイクロリットルのクロロホルムと100マイクロリットルのメタノールを3対1の比率で添加することにより、リン脂質を溶解します。
ガラス試験管を窒素ガスの穏やかな流れの下に10〜15分間置き、乾燥したリン脂質の薄膜が管の底部の壁に沿って形成されるようにして、有機溶媒を蒸発させます。アムホテリシンBまたはAmpB-ナノディスクを製剤化するには、450マイクロリットルのPBSを凍結乾燥リン脂質アリコートにピペットで送り、30秒間ボルテックスして脂質を分散させます。50マイクロリットルの20ミリグラムあたり20ミリグラムのストックAmpB溶液を分散したリン脂質試料およびボルテックスにピペットする。
分散したリン脂質とAmpBを含むガラス試験管に500マイクロリットルの4ミリグラムあたり4ミリグラムのApoE4 NT足場タンパク質を追加します。溶液が明確になるまで、摂氏24度でサンプルを超音波処理します。AmpB-Nanodisk透析の場合は、透析チューブを蒸留脱イオン水に10分間十分に浸して、透析チューブのセクションを準備します。
透析チューブクランプを使用して、浸した透析チューブの一端をクランプし、液体が逃げないようにします。細いネック漏斗を透析チューブの開放端に挿入し、AmpB-Nanodiskサンプルを透析チューブに移します。漏斗を取り外し、クランプします 透析チューブの端を別の透析チューブクランプで。
透析チューブの密閉された端の1つにフォーム透析フロートを置き、組み立てた透析チューブを新しく準備した1リットルのPBSバッファーを含むビーカーに入れます。ビーカーの底に磁気攪拌子を置き、攪拌制御を低く調整して、渦が発生しないようにします。透析を摂氏4度で一晩継続させます。
電源スイッチを切り替えて分光光度計の電源を入れ、PCコントロールを押して対応するサポートコンピューターに接続します。サポートコンピューターで、UVProbe 2.61というラベルの付いたソフトウェアを開き、左下隅にある[接続]をクリックして分光光度計に接続します。スペクトルをクリックしてから、上部のツールバーの「方法」をクリックします。
測定タブをクリックし、波長範囲の下にある「開始」テキストボックスに500を入力し、終了テキストボックスに300を入力します。[スキャン速度]というラベルの付いたタブの横にあるドロップダウンメニューをクリックし、中に設定します。1ミリリットルのDMSOを2つの石英キュベットに移してサンプルブランクを準備します。
両方のキュベットを分光光度計のそれぞれのサンプルポートにロードします。クリック自動ブランク」をクリックし、左下隅にある[開始]をクリックして300〜500ナノメートルのスペクトルを記録します。AmpB標準スペクトル分析の場合は、前面サンプルポートからキュベットを取り出し、1ミリリットルあたり1ミリグラムのAmpBストック溶液を20マイクロリットル加えます。
キュベットをサンプルボードに戻し、「開始」をクリックしてサンプルの吸光度を記録します。サンプルの吸光度を記録した後、キュベットを取り出し、液体内容物を廃棄物容器にデカントします。キュベットを脱イオン水で3回洗浄した後、70%エタノールで3回洗浄します。
破壊されたAmpB-ナノディスクのスペクトル分析では、1ミリリットルのAmpB-ナノディスクストックあたり20マイクロリットルを1ミリリットルのDMSOにピペッティングしてサンプルを調製し、スペクトルを記録する前に1分間インキュベートします。キュベットを前面のサンプルポートにロードし、[開始]をクリックしてサンプルの吸光度を記録します。PBSバッファーブランクのスペクトル分析では、1ミリリットルのPBSを2つの石英キュベットに移してブランクを調製します。
キュベットをサンプルポートにロードします。自動ブランク」をクリックし、300〜500ナノメートルのスペクトルを記録します。破壊されていないAmpBナノディスクサンプルのスペクトル分析では、前面のサンプルポートからキュベットを取り出し、1ミリリットルあたり1ミリグラムのAmpBナノディスクサンプルを20マイクロリットルPBSバッファーに追加します。
キュベットをサンプルボードに戻します。クリック開始」サンプルスペクトルを記録します。AmpB-Nanodisk製剤反応は、サンプルの外観が濁った状態から透明な状態に移行すると完了したと見なされます。
DMSOおよびPBS中のAmpBサンプルの紫外可視吸収分光法が示されています。DMSOでは、AmpBを示すピークである372、392、および415ナノメートルに3つの特徴的な吸光度の極大が観察されました。PBS中のAmpBナノディスクの吸光度スペクトルは、より短い波長で単一の主要な吸光度ピークを示しました。
比較すると、DMSO中のAmpBナノディスクの吸光度スペクトルは、ストックAmpBのスペクトルと類似しているように見えました。AmpB-ナノディスクの生物学的活性は、酵母増殖阻害アッセイを評価することによって行われた。PBS、DMSO、再構成高密度リポタンパク質などの対照サンプルは、AmpB以外のナノディスク成分が酵母の成長に識別可能な影響を与えないことを示しました。
ポジティブコントロールは、AmpBが酵母増殖の効率的な阻害剤であることを確認しました。AmpB-Nanodisksの場合、濃度依存的な増殖阻害活性が認められた。すべてのナノディスク製剤が同じというわけではありません。
いくつかは、より多くの時間、異なる脂質、または異なる足場タンパク質を必要とするかもしれません。それらは不明瞭なだけです}ナノディスクサンプルの清澄化です。この技術は、ドキソルビシン誘発性心毒性、アポトーシス、リガンド相互作用の研究に使用される新しいナノ粒子をもたらし、ルテインやクルクミンを含む多数の水性不溶性生理活性分子を送達しました。
