פרוטוקול זה מספק ידע מעשי, שימושי לניסוח חלקיקים ננומטריים, כלומר ננו-דיסקים, המשלבים ביציבות מגוון רחב של מולקולות ביו-אקטיביות הידרופוביות. לשיטה זו יישומים מעשיים רבים.
היכולת להעניק מסיסות מימית לתרכובות ביו-אקטיביות בלתי מסיסות אחרת מאפשרת שימוש בננו-דיסקים ביישומי העברת תרופות. השיטה המתוארת היא פשוטה. עדיף לערוך מחקרים בקנה מידה המתואר, חמישה מיליגרם פוספוליפיד, שני מיליגרם חלבון פיגום, כך היווצרות של ננודיסקים מנוטר בקלות על ידי בדיקה חזותית.
מי שידגימו את ההליך יהיו מייקל קארו ומתיו סוואקהמר, סטודנטים לתואר ראשון חוקרים במעבדת ריאן. כדי להכין aliquot פוספוליפיד, לשקול חמישה מיליגרם של DMPC ולהעביר אותו למבחנה זכוכית. להמיס את הפוספוליפידים על ידי הוספת 300 מיקרוליטר כלורופורם ו -100 מיקרוליטר מתנול ביחס של שלושה לאחד.
אידוי הממס האורגני על ידי הנחת מבחנה זכוכית תחת זרם עדין של גז חנקן למשך 10 עד 15 דקות, כך שנוצר סרט דק של פוספוליפידים מיובשים לאורך דפנות החלק התחתון של הצינור. כדי לנסח אמפוטריצין B או AmpB-Nanodisks, פיפטה 450 מיקרוליטר של PBS לאליקוט פוספוליפידים lyophilized, ומערבולת במשך 30 שניות כדי לפזר את השומנים. פיפטה 50 מיקרוליטר של 20 מיליגרם למיליליטר מלאי תמיסת AmpB לתוך דגימת פוספוליפידים מפוזרים ומערבולת.
הוסף 500 מיקרוליטר של ארבעה מיליגרם למיליליטר חלבון פיגום ApoE4 NT למבחנה זכוכית המכילה את הפוספוליפידים המפוזרים ואת AmpB. יש להסוות את הדגימה בטמפרטורה של 24 מעלות צלזיוס עד להתבהרות התמיסה. לדיאליזה AmpB-Nanodisk, הכינו קטע של צינורות דיאליזה על ידי השרייתו ביסודיות במים מזוקקים שעברו דה-יוניזציה למשך 10 דקות.
באמצעות מהדק צינורות דיאליזה, הדקו קצה אחד של צינור הדיאליזה הספוג, כדי להבטיח שאף נוזל לא יוכל לברוח. הכנס משפך צוואר צר לקצה הפתוח של צינור הדיאליזה והעבר את דגימת AmpB-Nanodisk לצינורות הדיאליזה. הסר את המשפך, ומהדק את קצה צינור הדיאליזה עם מהדק צינור דיאליזה נוסף.
הניחו צף דיאליזה מוקצף על אחד הקצוות האטומים של צינור הדיאליזה, והכניסו את צינור הדיאליזה המורכב לתוך הכד המכיל חיץ PBS טרי של ליטר אחד. הניחו מוט ערבוב מגנטי בתחתית הכד וכווננו את בקרת הערבוב לנמוכה, כדי להבטיח שלא תיווצר מערבולת. אפשר להמשיך את הדיאליזה במשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.
הפעל את הספקטרופוטומטר על-ידי היפוך מתג ההפעלה והתחבר למחשב תמיכה מתאים על-ידי הקשה על PC Control. במחשב התמיכה, פתח את התוכנה שכותרתה UVProbe 2.61, והתחבר לספקטרופוטומטר על ידי לחיצה על התחבר"בפינה השמאלית התחתונה. לחץ על הספקטרום ולאחר מכן לחץ על שיטה"בסרגל הכלים העליון.
לחץ על כרטיסיית המדידה והזן 500 לתיבת הטקסט התחלה הממוקמת בטווח אורכי הגל, ו- 300 לתיבת הטקסט "הסופית". לחץ על התפריט הנפתח לצד הכרטיסייה שכותרתה מהירות סריקה"והגדר אותה לבינונית. הכינו דגימה ריקה על ידי העברת מיליליטר אחד של DMSO לשתי קוביות קוורץ.
טען את שתי הקוביות לתוך יציאות הדגימה המתאימות של הספקטרופוטומטר. לחץ על ריק אוטומטי"והקלט ספקטרום מ 300 עד 500 ננומטר על ידי לחיצה על התחל"בפינה השמאלית התחתונה. לניתוח ספקטרלי סטנדרטי של AmpB, הסר את הקובט מיציאת הדגימה הקדמית והוסף 20 מיקרוליטר של מיליגרם אחד למיליליטר תמיסת מלאי AmpB.
טען את הקובט בחזרה ללוח הדגימה ולחץ על "התחל" כדי להקליט את ספיגת הדגימה. לאחר רישום ספיגת הדגימה, מוציאים את הקובט ומרוקנים את תכולת הנוזל למיכל פסולת. שטפו היטב את הקובטה עם שלוש שטיפות של מים נטולי יונים, ולאחר מכן שלוש שטיפות עם 70% אתנול.
לניתוח ספקטרלי של AmpB-Nanodisk משובש, הכינו את הדגימה על ידי פיפטציה של 20 מיקרוליטר של מיליגרם אחד למיליליטר מלאי AmpB-Nanodisk למיליליטר אחד של DMSO, ודגרו במשך דקה אחת לפני הקלטת הספקטרום. טען את הקובט ליציאת הדגימה הקדמית ולחץ על "התחל" כדי להקליט את ספיגת הדגימה. לניתוח ספקטרלי של חיץ PBS ריק, הכינו ריק על ידי העברת מיליליטר אחד של PBS לשתי קוביות קוורץ.
טען את הקוביטות ליציאת הדגימה. לחץ על אוטומטי ריק" והקלט את הספקטרום מ 300 עד 500 ננומטר. לניתוח ספקטרלי של דגימת AmpB-Nanodisk ללא הפרעה, הסר את הקובט מיציאת הדגימה הקדמית והוסף 20 מיקרוליטר של מיליגרם אחד למיליליטר דגימת AmpB-Nanodisk למאגר PBS.
טען את הקובט בחזרה ללוח הדגימה. לחץ על התחל" והקלט את ספקטרום הדגימות. תגובת ניסוח AmpB-Nanodisk נחשבת לשלמה כאשר מראה הדגימה משתנה מעכיר לברור.
ספקטרוסקופיית בליעה נראית UV של דגימות AmpB ב- DMSO ו- PBS מוצגת. ב-DMSO נצפו שלושה מקסימום ספיגה ייחודי ב-372, 392 ו-415 ננומטר, פסגות המעידות על AmpB. ספקטרום הבליעה של AmpB-Nanodisks ב-PBS הראה שיא בליעה עיקרי יחיד באורך גל קצר יותר.
לשם השוואה, ספקטרום הספיגה של AmpB-Nanodisks ב-DMSO נראה דומה לספקטרום של מלאי AmpB. הפעילות הביולוגית של AmpB-Nanodisks בוצעה על ידי הערכת מבחני עיכוב צמיחת שמרים. דגימות בקרה כמו PBS, DMSO וליפופרוטאינים בצפיפות גבוהה שהוכיחו כי לרכיבי ננו-דיסקים שאינם AmpB אין השפעה ניכרת על גדילת שמרים.
הבקרה החיובית אישרה כי AmpB הוא מעכב יעיל של צמיחת שמרים. במקרה של AmpB-Nanodisks, נצפתה פעילות עיכוב גדילה תלוית ריכוז. לא כל תכשירי הננו-דיסק זהים.
חלקם עשויים לדרוש זמן רב יותר, שומנים שונים, או חלבוני פיגומים שונים. הם רק לא ברורים} הוא הבהרה של דגימת ננודיסק. טכניקה זו הובילה לננו-חלקיקים חדשניים המשמשים לחקר רעילות לב הנגרמת על ידי דוקסורוביצין, אפופטוזיס, אינטראקציות ליגנד, וסיפקה מולקולות ביו-אקטיביות מימיות בלתי מסיסות רבות, כולל לוטאין וכורכומין.
