この研究のプロトコルは、低酸素症で損傷したPC12細胞を治療するための2つのハーブの組み合わせ戦略と、ハーブの最良の組み合わせモードを最適化するためのリファレンスを提供します。この技術は、低酸素細胞に対して、ハーブからの有効な成分の組み合わせをスクリーニングするための、簡単で信頼性が高く、効率的なin vitro実験方法を提供できます。この戦略は、他のハーブ調製物の組み合わせからの低酸素細胞に対する成分の組み合わせをスクリーニングし、それらの保護メカニズムを説明するためにも適用できます。
まず、PC12細胞を5%二酸化炭素を添加したインキュベーターで摂氏37度で2〜3日ごとに継代培養し、その後のすべての実験で4〜8の継代を取得します。70〜80%コンフルエントなPC12細胞を1ミリリットルの0.25%トリプシンで処理し、細胞剥離について顕微鏡下で観察します。次に、3ミリリットルの完全培地を加えてトリプシン消化を停止します。
移した細胞を15ミリリットルの遠沈管で840 x gで5分間スピンダウンします。上清を廃棄した後、細胞ペレットを完全培地で再懸濁し、細胞懸濁液を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。細胞をカウントするには、フローサイトメトリーソフトウェアを起動し、カウント設定で細胞溶液の対応する希釈倍数を選択します。
細胞サンプルをロードした後、密度チャートをクリックします。細胞集団を x 軸と y 軸から離して丸で囲みます。図の下のデータ テーブルを右クリックし、[X]、[Y]、[カウント]、および [腹筋] を選択します。
カウント: Abs.Count のデータ テーブルの下にあるセル カウント結果を取得します。完全培地で細胞濃度を1ミリリットルあたり10〜5細胞分の約1倍に調整した後、1ウェルあたり100マイクロリットルの細胞懸濁液を96ウェルプレートに加え、摂氏37度、5%二酸化炭素で24時間インキュベートします。翌日、上清廃棄プレートに1ミリリットル当たり1ミリグラムのMTT溶液を各ウェルに120マイクロリットル加え、摂氏37度で4時間インキュベートする。
インキュベーション後、上清が廃棄されたら、各ウェルに150マイクロリットルのDMSOを追加します。プレートをボルテックスオシレーターで10分間、毎分240回の速度で振とうしたままにします。次に、マイクロプレートリーダーで490ナノメートルの吸光度を測定します。
均質な設計法によって薬物の最適な組み合わせをスクリーニングするには、前述のように細胞を培養し、損傷したPC12細胞を6つの異なる比率濃度のレンゲ注射とブレビスカプスカプセルで処理します。2つの最適な組み合わせの保護効果を評価するには、損傷したPC12細胞を2種類の薬物の組み合わせで治療します。細胞を24時間インキュベートし、前に示したように細胞生存率を計算します。
PC12細胞を12ウェルプレートに播種し、摂氏37度で24時間インキュベートします。薬物処理後、細胞をウェルあたり250マイクロリットルのトリプシンで処理し、細胞を840 x gで室温で5分間遠心分離します。次いで、細胞ペレットを500マイクロリットルの結合緩衝液で再懸濁する。
各グループのアネキシンV-FITC5マイクロリットル、ヨウ化プロピジウム10マイクロリットルをトリプリケートで加え、暗所で室温で15分間インキュベートして、フローサイトメトリーを使用してアポトーシスを確認します。フローサイトメーターソフトウェアで、[スタート]メニューの[自動補正]をクリックし、[チャンネルの選択]で[FITC]、[PE]、[PERCP]、および[APC]を選択し、[高さでの補正]を選択します。次に、統計項目:中央値でOKをクリックします。
[密度マップ] をクリックし、前に示した細胞カウント方法で有効細胞集団を丸で囲みます。FITC蛍光をx軸パラメータとして、その他の蛍光をy軸パラメータとして使用して、密度マップを作成します。[スタート]メニューの[補正マトリックス]をクリックし、オーバーフローマトリックスの[係数]をクリックします。
PC12細胞を24ウェルプレートウェルに置かれたカバーガラスに三重に播種し、摂氏37度で24時間インキュベートします。薬物処理後、カバーガラスをPBSでそれぞれ5分間2回すすぎ、4%パラホルムアルデヒドで15分間固定し、0.5%Triton X-100で室温で20分間透過処理します。細胞をすすいだ後、室温で1時間10%ヤギ血清でそれらをブロックします。
200マイクロリットルの希釈一次抗体カスパーゼ-3を各カバーガラスに加え、摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、TBSTバッファーでそれぞれ3分間3回洗浄し、200マイクロリットルの二次抗体とともに室温、暗所で1時間インキュベートします。インキュベーション後、カバーガラスをDAPI1ミリリットルあたり0.5マイクログラムの300マイクロリットルで10分間インキュベートし、細胞をTBSTでそれぞれ5分間3回洗浄します。
カバーガラス画像を蛍光顕微鏡で撮影し、イメージングソフトウェアで蛍光強度を統計的に解析します。薬物処理したPC12細胞カバーガラスをPBSでそれぞれ3分間3回洗浄し、400マイクロリットルの10マイクロモルジクロロ-ジヒドロ-フルオレセインジアセテートを摂氏37度で20分間インキュベートします。無血清DMEMで細胞を2回、それぞれ3分間再度洗浄します。
蛍光消光剤を添加し、すぐに蛍光顕微鏡でカバーガラス画像をキャプチャして、イメージングソフトウェアで相対蛍光強度を計算します。薬物処理したPC12細胞を6ウェルプレートでPBSでそれぞれ5分間3回洗浄し、ウェルあたり100マイクロリットルの調製溶解バッファー中で氷上で30分間インキュベートします。溶解後、細胞を摂氏4度で20分間16, 000 x gで遠心分離し、上清を回収します。
ブラッドフォードアッセイでタンパク質濃度を検出した後、各レーンに25マイクログラムのタンパク質を含む12%SDS-PAGE電気泳動を実行し、ゲルをPVDFメンブレンに移します。メンブレンを5%無脂肪乳で室温で1.5時間ブロックし、5ミリリットルの対応する一次抗体とともに摂氏4度で24時間インキュベートします。メンブレンをTBSTで3回、それぞれ10分間インキュベートおよび洗浄した後、5ミリリットルの二次HRP結合抗体とともに室温で2時間インキュベートします。
最後に、TBST洗浄メンブレンに、製造元の指示に従ってタンパク質バンド検出用の化学発光HRP基質を追加します。次に、化学発光イメージングシステムを使用して画像をキャプチャし、ベータアクチンを内部コントロールとしてタンパク質のグレー値を定量します。正常なPC12細胞の細胞生存率は、レンゲを12マイクロモルを超える濃度で注射すると95%未満であり、ブレビスカプスカプセルでは5マイクロモルを超えました。.
レンゲ注射は、6〜12マイクロモルの濃度範囲で損傷したPC12細胞の生存率を改善し、2〜5マイクロモルでブレビスカプスカプセルを改善する可能性があります。一方、6〜1.8マイクロモルの比率での薬物の組み合わせは、最も高い細胞生存率を示した。損傷したPC12細胞に対する2つの組み合わせの細胞生存率は有意に促進され、成分の組み合わせは調製の組み合わせよりも優れていました。
アポトーシス率は、初期、後期、および総アポトーシス細胞の割合が正常群よりもモデル群で有意に高いことを示しました。モデル群と比較して、各段階のアポトーシス細胞の割合は、治療群で有意に低かった。カスパーゼ-3の蛍光強度は、モデル群と比較して各処理群で有意に低く、成分併用群では比較的低かった。
Akt遺伝子、Bcl-2遺伝子、Bax遺伝子の相対発現により、細胞生存の促進において成分の組み合わせが製剤の組み合わせよりも優れていることが明らかになり、より強い抗アポトーシス効果に関連しています。成分併用は、製剤併用よりも優れた抗酸化損傷効果を示し、Nrf2タンパク質の発現が有意に高かった。この方法は、抗炎症、抗菌など、ハーブの組み合わせから他の潜在的な薬理学的活性との成分の組み合わせをスクリーニングおよび評価するために使用できます。
