このプロトコルは、さまざまな骨格筋にわたる幹細胞機能の研究を可能にし、それらが恒常性、再生、および疾患の進行にどのように寄与するかについての理解を深めるのに役立つため、重要です。このプロトコルを使用して、特定の筋肉から生きた幹細胞の2つの集団を分離し、それらがどのように機能するかを研究することができます。筋肉の分離を開始するには、安楽死させたマウスにエタノールをスプレーし、腹部を上に向けて置きます。
はさみを使用して、腹部の皮膚に0.5センチメートルの長さの水平切開を行います。両手を使って皮膚を引っ張り、胴体と下肢を後肢まで露出させます。グラシリスまたは太ももの内側の筋肉を見つけ、湾曲した鉗子のペアを使用してそれをつかみ、筋肉をわずかに持ち上げます。
ハサミを使用して、0.5センチメートルの切開を行い、グラシリスの筋肉を切り取ります。もう一方の脚で手順を繰り返します。メスを使用して、脛骨の外側に沿って0.5センチメートルの切開を行うことによって筋膜を切断します。
次に、湾曲した鉗子を使用して筋膜をつかみ、引っ張って取り外し、後肢の遠位端にある腱を露出させます。次に、TAの遠位腱とEDL筋の間に超微細な先端を持つ一対のまっすぐな鉗子を挿入します。鉗子を筋肉の近位端に向かってスライドさせて、筋肉を分離します。
鉗子を遠位端に戻し、遠位腱を切断します。湾曲した鉗子でTAの遠位腱をそっとつかみ、筋肉をその近位アタッチメントの上に持ち上げます。近位腱を慎重に切断するには、もう一方の端をそのアタッチメントにできるだけ近いところで切断し、TAをペトリ皿に移します。
次に、超微細な先端を持つまっすぐな鉗子を使用してEDLの遠位腱の下に入り、鉗子を筋肉の近位端に向かってスライドさせて、筋肉を互いに分離します。鉗子を遠位端に戻し、筋肉を傷つけずに遠位腱を切断します。湾曲した鉗子でEDLの遠位腱をそっとつかむことにより、筋肉を持ち上げて近位の付着部の上に持ち上げ、近位腱をできるだけ付着に近づけます。
もう一方の端を切り取り、EDL筋肉をペトリ皿に移します。もう一方の後肢についても手順を繰り返します。先端が極細のまっすぐな鉗子を使用して、アキレス腱と下肢の骨の間に届きます。
鉗子を筋肉の近位端に向かってスライドさせて、筋肉を骨から分離します。鉗子を遠位端に戻し、遠位腱を切断します。腓腹筋またはGA筋を腓骨の上に引き上げます。
近位ヒラメ筋腱の位置を特定する。まっすぐな鉗子をヒラメ筋とGA筋肉の間に挿入し、鉗子を筋肉の遠位端に向かって動かして、ヒラメ筋をGAから分離します。次に、近位ヒラメ筋腱を切断します。湾曲した鉗子でそれをつかみ、慎重にスーを持ち上げて遠位腱にアクセスします。
遠位腱を切断してヒラメ筋をGAから分離し、洗浄媒体を含むペトリ皿にヒラメ筋を入れます。次に、GAを切り取り、ペトリ皿に入れます。上腕三頭筋を隔離するには、上腕三頭筋と上腕骨の間に届くように先端が超微細なまっすぐな鉗子を使用し、鉗子を筋肉の近位端に向かってスライドさせて筋肉を骨から分離します。
次に、上腕三頭筋の遠位端を切断し、湾曲した鉗子を使用してそれを肘の上に引き上げて近位腱にアクセスします。上腕三頭筋の近位腱を切断し、筋肉をペトリ皿に移します。他の4本の手足についても手順を繰り返します。
顎から毛皮と皮膚を取り除くには、はさみを使用して目の下を0.5センチメートルの切開を行い、尾方向に切ります。次に、両手の親指と人差し指を使用して、切開の両側をつまみ、上下に引っ張って皮膚を取り除きます。目の下の尾側に咬筋の主要な腱を見つけ、骨と筋肉の間に平らなメスの刃を挿入して腱を切断します。
湾曲した鉗子で大咬筋腱をつかみ、メスの刃やハサミで吻側に切り、咬筋を顎骨から分離します。分離した咬筋をペトリ皿に入れ、2番目の咬筋に対して手順を繰り返します。はさみを使用して胸骨の真ん中に開胸を行い、胸骨を切り裂きます。
胸郭を通して360度切断してダイヤフラムを露出させます。次に、上半身を腹部から分離するために、ハサミを使用して気管、食道、大静脈、および腹部大動脈を切り裂きます。次に、ハサミを使用して、胸骨の1センチ下に開腹術を行い、約360度に切り込みを入れます。
閉じたはさみを胸郭と腹部臓器の間に置き、押し下げます。胸郭をそっと引っ張って腹部の臓器から分離します。横隔膜を胸郭から分離するには、横隔膜を2本の指でゆるく持ち、ハサミで胸郭を切ります。
ダイヤフラムをリブのできるだけ近くで360度カットし、隔離されたダイヤフラムをペトリ皿に入れます。孤立した筋肉を約1ミリメートルの断片に切断して1つずつ細かく刻みます。ミンチした筋肉を5リットルの解離バッファーを含む15リットルの円錐管に移し、毎分60回転の速度で振とう水浴中で37°Cで35分間チューブをインキュベートします。
ミンチ筋肉を酵素消化した後、懸濁液を15ミリリットルチューブから50ミリリットルチューブに移します。20ゲージの針を取り付けた10ミリリットルのシリンジを使用して、針を通してサンプルを上下に5回引っ張って再懸濁します。細胞懸濁液をシリンジに引き込み、上部に細胞ストレーナーを取り付けた新しい50ミリリットルの円錐管にサンプルを濾します。
すべての単核細胞を回収するには、空の円錐管を20ミリリットルの洗浄媒体で洗浄し、それをストレーナーに注ぎ、濾したサンプルと結合させます。P1000ピペットでセルストレーナーの下の残りの容量を取り出します。組織解離および抗体染色に続いて、個々の筋肉由来の骨格筋幹細胞またはMuSCsおよび線維脂肪生成前駆細胞またはFAPを、蛍光活性化細胞選別によって精製した。
細胞を同定し、一重項をダブレットから分離するための最初のゲーティングの後、染色閾値を特定するためにFMOコントロールを使用して後続のゲートを設定しました。染色サンプルをゲートし、FAPに対応するSCA1陽性CD31陰性およびCD45陰性集団を別の収集チューブに分類した。二重陰性集団は、MuSCに対応するVCA陽性集団をソートするためにさらにゲートされた。
横隔膜および上腕三頭筋の単一細胞懸濁液は、他のものとは異なり、FAPよりもMuSCの相対的な存在量が多かった。EDU染色は堅牢ではあるが、2つの幹細胞タイプおよび異なる筋肉間でEDU陽性細胞の画分に違いがあることを示した。しかし、すべての組織について、EDU陽性MuSCの平均割合はEDU陽性FAPの平均割合よりも高かった。
EDLおよびGAから分離されたMuSCは、TA、横隔膜、グラシリスまたは上腕三頭筋からのものと比較して、有意に低いEDU取り込みを示しました。同様に、EDU取り込みの有意な変動は、異なる筋肉から分離されたFAPでも観察されました。最後に、免疫蛍光染色で細胞純度を確認し、幹細胞分離プロトコルの特異性を示した。
最も重要なステップは、組織の機械的消化です。組織を切断しすぎると、生存率が低下します。組織の切断が少なすぎると、ウナギは低下します。
このプロトコルは、移植後の生着などの細胞の挙動を測定するアッセイと組み合わせて、in vivoでの幹細胞機能をよりよく理解することができます。この技術は、個々の筋肉内の幹細胞の挙動の違いが、病気の表現型や影響を受けた筋肉の独特のパターンを特徴とする疾患に寄与する可能性があるかどうかに答える可能性があります。
