インビトロおよびインビボでの鼻自己組織化ナノエマルジョン腫瘍ワクチンの調製、特性、毒性、および有効性評価

新規ナノエマルジョンワクチンは、疾患戦術療法において大きな利点を有する。これらのセット効果は、独特の腫瘍チョピズム、特定の戦術の特定、および低い全身毒性などの特性によって最小限に抑えられます。このプロトコルは、新しいT細胞異型ペプチド粘膜ワクチンの将来の開発のための技術的および理論的な手がかりを提供すると期待しています。

1ミリグラムのモノホスホロールリピッドAを100マイクロリットルのDMSOと混合することから始めます。5分間ボルテックスし、室温で4時間溶解させます。TWEEN 80とI-OVAを定量的に添加します。

成分を混合し、スクアレンを加える。次に、調製した混合物に100マイクロリットルのMPLA溶液を加える。ナノエマルジョンワクチンを調製するには、混合溶液を全体積の約70%の水滴に加え、穏やかに攪拌して、透明で流動性のある混合物を得る。

インビトロアッセイでは、BEAS2B上皮細胞の復活から始めます。ウォーターバスをオンにして、温度を摂氏37度に調整します。凍結した細胞バイアルを水浴中で素早く解凍し、摂氏37度で焼き戻した。

解凍後、細胞を15ミリリットルの滅菌遠心チューブに素早くピペットで入れ、2ミリリットルの完全増殖培地を加えます。チューブを129 Gで5分間遠心分離します。スピネタントを除去し、細胞を2ミリリットルの完全増殖培地に再懸濁する。

細胞をもう一度遠心分離した後、スピネタントを除去し、6ミリリットルの完全増殖培地を加えて細胞を再懸濁します。次に、細胞をT25培養フラスコに移し、5%二酸化炭素インキュベーター内で摂氏37度でインキュベートします。細胞密度が80%から90%に達したら培養液を廃棄し、2ミリリットルのPBSで細胞を2回洗浄します。

1ミリリットルの0.25%トリプシンを加えて、細胞を1〜2分間消化します。細胞の丸みが観察されたら、直ちにトリプシンを中和するために4ミリリットルの完全増殖培地を加える。15ミリリットルの滅菌遠心チューブでサンプルを混合し、吸引します。

サンプルを129 Gで5分間遠心分離します。スピナタントを除去し、細胞を1ミリリットルのRPMI 1640完全培地に再懸濁します。細胞計数に20マイクロリットルの細胞懸濁液を使用し、細胞を1ミリリットルあたり10〜5分の1細胞に希釈します。

次いで、BEAS2B細胞を100マイクロリットルのRPMI 1640完全培地中の96ウェルプレート中の96ウェルプレート中のウェル当たり10倍10の密度でプレートし、プレートを24時間プレインキュベートする。インキュベーションの最後に、スピネタントを廃棄し、96ウェルプレートの各ウェルに100マイクロリットルのRPMI 1640を加える。対照としてBNEを用いて様々な最終濃度で完全な増殖培地で予め希釈したI-OVAナノエマルジョン、BNEと混合したI-OVAおよびI-OVAをそれぞれ100マイクロリットル加え、摂氏37度で24時間インキュベートする。

インキュベーションが完了したら、培地を取り除き、プレートを暗い場所に移します。90マイクロリットルの完全増殖培地と10マイクロリットルのCCK8溶液をプレートの各ウェルに加えます。プレートを摂氏37度、5%二酸化炭素で2時間インキュベートします。

酵素標識プレートリーダーを用いて450ナノメートルで各ウェルの吸光度を測定します。10マイクロリットルのピペットチップを使用して、I-OVA、I-OVA plus BNE、およびI-OVA NEでマウスの鼻免疫を3日間行います。実験対照としてBNEおよびPBAを使用する。

その後、鼻組織のサンプルをハサミで約3ミリメートルの厚さに切り取り、4%パラホルムアルデヒドに入れます。肺組織を取り除き、鼻と肺組織全体を4%パラホルムアルデヒドで24時間固定します。TEMおよびAFMは、表面ゼータ電位およびナノワクチンの粒子サイズの基本特性の評価に使用される。

ムシン安定性分析におけるI-OVA NEの粒子径、多分散指数、ゼータ電位、および電気泳動移動度を示します。BEAS2B細胞の相対生存率は、異なるペプチド濃度のI-OVA、BNE+I-OVA、およびI-OVA NEに24時間曝露した培養物で80%以上です。I-OVA EN群には、明らかな粘膜毒性、組織損傷、出血、または炎症性細胞浸潤は見られませんでした。

上皮BEAS2B細胞は、その水溶液よりも多くのFITC標識I-OVA NEを捕捉した。I-OVA NEのインビトロでの徐放効果をIV-ISシステムを用いて解析した。I-OVA NEワクチンは、I-OVAの水溶液と比較して徐放効果を示した。

I-OVA NE群では、他の群に比べて生存率が高く、腫瘍体積が有意に小さかったことから、他の群よりも予防防御効果が高いことが示唆された。治療モデルでは、生存期間の中央値は異なる群間で有意に異なっていた。I-OVA NE群の腫瘍体積はI-OVA群よりも有意に小さかった。

この手順では、混合物を均一に攪拌することが重要です。そうしないと、ナノワクチンの効率が低下します。