לחיסון ננו-תחליב חדשני יש יתרונות גדולים בטיפול טקטי במחלה. השפעות קבועות אלה ממוזערות על ידי תכונות כגון חיתוך גידול ייחודי, זיהוי טקטיקות ספציפיות והרעילות המערכתית הנמוכה. אנו צופים כי הפרוטוקול יספק רמזים טכניים ותיאורטיים לפיתוח עתידי של חיסונים חדשים נגד רירית מסוג תאי T.
התחל על ידי ערבוב מיליגרם אחד של שומנים מונופוספורול A עם 100 מיקרוליטר של DMSO. מערבלים במשך חמש דקות ומשאירים אותו להתמוסס במשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר. הוסיפו כמותית את TWEEN 80 ואת I-OVA.
מערבבים את הרכיבים ומוסיפים סקוואלן. לאחר מכן, להוסיף 100 מיקרוליטר של פתרון MPLA לתערובת מוכנה. להכנת החיסון נגד ננו תחליב, הוסיפו את התמיסה המעורבת לטיפות מים בכ-70% מהנפח הכולל וערבבו בעדינות לקבלת תערובת שקופה וזורמת בקלות.
עבור בדיקות במבחנה, התחל עם החייאת תאי אפיתל BEAS2B. הפעל את אמבט המים והתאם את הטמפרטורה ל -37 מעלות צלזיוס. הפשירו את בקבוקוני התאים הקפואים במהירות באמבט מים, בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
לאחר ההפשרה, במהירות פיפטה את התאים לתוך צינור צנטריפוגה סטרילית 15 מיליליטר, ולהוסיף שני מיליליטר של מדיום הגידול השלם. צנטריפוגה את הצינור ב 129 G במשך חמש דקות. הסר את supinatant ו resuspend את התאים בשני מיליליטר של מדיום הגידול המלא.
לאחר צנטריפוגה של התאים שוב, להסיר את supinatant ולהוסיף שישה מיליליטר של מדיום גידול מלא כדי להשעות מחדש את התאים. לאחר מכן מעבירים את התאים לבקבוק תרבית T25 ודגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5% פחמן דו חמצני. ברגע שצפיפות התא מגיעה ל-80% עד 90%, השליכו את מדיום התרבית ושטפו את התאים פעמיים עם שני מיליליטר PBS.
מוסיפים מיליליטר אחד של 0.25% טריפסין כדי לעכל את התאים למשך דקה עד שתי דקות. כאשר עיגול של התאים הוא ציין, מיד להוסיף ארבעה מיליליטר של מדיום הגידול המלא כדי לנטרל את טריפסין. מערבבים ושואפים את הדגימות בצינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מיליליטר.
צנטריפוגה את הדגימות ב 129 G במשך חמש דקות. הסר את supinatant ו resuspend את התאים במיליליטר אחד של RPMI 1640 מדיום שלם. השתמש 20 מיקרוליטר של תרחיף התא לספירת תאים ודלל את התאים לפעם אחת 10 עד התאים החמישיים למיליליטר.
לאחר מכן לוחצים את תאי BEAS2B בצפיפות של פי 10 עד התאים הרביעיים לכל באר ב-96 צלחות באר ב-100 מיקרוליטר של סל"ד 1640 תווך שלם, ודוגרים מראש על הלוחות למשך 24 שעות כפי שהודגם קודם לכן. בסוף הדגירה, להשליך את supinatant ולהוסיף 100 מיקרוליטר של RPMI 1640 לכל באר של צלחת 96 באר. הוסף 100 מיקרוליטר כל תחליב ננו I-OVA, I-OVA מעורבב עם BNE, ו- I-OVA מדולל מראש עם מדיום גידול מלא בריכוזים סופיים שונים עם BNE כבקרה ודגרה במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
לאחר השלמת הדגירה, מסירים את המדיום, ומעבירים את הצלחת למקום חשוך. הוסף 90 מיקרוליטר של מדיום גידול שלם ו -10 מיקרוליטר של תמיסת CCK8 לכל באר של הצלחת. דוגרים על הצלחת במשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.
מדוד את הספיגה של כל באר ב 450 ננומטר באמצעות אנזים שכותרתו קורא לוחות. השתמש 10 טיפים פיפטה מיקרוליטר לבצע חיסון האף של העכברים עם I-OVA, I-OVA בתוספת BNE, ו- I-OVA NE במשך שלושה ימים. השתמש BNE ו- PBA כבקרה ניסיונית.
לאחר מכן, חתכו במספריים דגימות בעובי של כשלושה מילימטרים של רקמות האף והניחו אותן בפרפורמלדהיד 4%. הסר את רקמות הריאה וקבע את רקמות האף והריאה השלמה ב 4% paraformaldehyde למשך 24 שעות. TEM ו-AFM משמשים להערכת המאפיינים הבסיסיים של פוטנציאל הזטה על פני השטח וגודל החלקיקים של חיסון הנאנו.
גדלים של חלקיקים, אינדקסי פיזור רב-תכליתי, פוטנציאלי זטה וניידות אלקטרופורזה של I-OVA NE בניתוחי יציבות מוסין. הכדאיות היחסית של תאי BEAS2B היא יותר מ-80% בתרביות שנחשפו לריכוזים פפטידים שונים של I-OVA, BNE+I-OVA ו-I-OVA NE במשך 24 שעות. לקבוצת I-OVA EN לא היו רעילות רירית ברורה, נזק לרקמות, דימום או חדירת תאים דלקתיים.
תאי האפיתל BEAS2B לכדו יותר FITC שכותרתו I-OVA NE מאשר זה של תמיסת המים שלו. אפקט השחרור המתמשך של I-OVA NE IN VITRO נותח באמצעות מערכת IV-IS. לחיסון I-OVA NE הייתה השפעת שחרור מתמשכת בהשוואה לתמיסה המימית של I-OVA.
בקבוצת I-OVA NE אחוז ההישרדות גבוה יותר בהשוואה לקבוצות אחרות, ונפח הגידול היה קטן משמעותית, מה שמרמז על כך שיש לו אפקט הגנה מונעת טוב יותר מאשר הקבוצות האחרות. במודל הטיפולי, זמן ההישרדות החציוני היה שונה באופן משמעותי בין קבוצות שונות. נפח הגידול בקבוצת I-OVA NE היה קטן משמעותית מזה שבקבוצת I-OVA.
ערבוב אחיד של התערובת חשוב בהליך זה. אחרת זה יפחית את היעילות של ננו-חיסונים.
