このプロトコルの重要性は、早期上皮のin vitroモデルでエンテロイドの総確率をテストすることです。この技術の主な利点は、腸管腔環境を模倣する密閉された内腔からの透過性を測定することです。このプロトコルは、リーキーガット疾患を誘発または軽減する要因を研究するために使用できます。
また、血管漏出を誘発する可能性のある状態を研究するために、内皮系または血管系に適用することもできます。このプロトコルにはある程度の練習が必要です。手順全体をまとめる前に、各セクションを個別に練習することをお勧めします。
まず、腸のセグメントを、アムホテラシンを含む氷のように冷たいダルベッコのPBSを入れた60 x15平方ミリメートルのペトリ皿に移し、氷に20分間浸します。はさみ付きのメスを使用して、腸の部分を3〜5ミリメートルの小片に切り、氷上に0.5〜1ミリリットルのオルガノイド増殖培地を含む35 x 15平方ミリメートルのペトリ皿に1〜2個入れます。解剖マイクロハサミと鉗子を使用して腸管を縦方向に切断します。
次に、鉗子を使用して筋膜から上皮細胞をこすり落とします。筋膜を取り除き、皿を回転させて細胞の塊を壊します。次に、20マイクロリットルのピペットカットチップを使用して、細胞と培地を5〜10マイクロリットルの増分で基底膜マトリックスミックスに移し、285マイクロリットルの溶液を作ります。
200マイクロリットルのカットチップを使用して、氷上の基底膜マトリックスにピペッティングして細胞を混合します。混合後、細胞基底膜マトリックスミックスの50マイクロリットルのストリップを、温かいフォームレンガ上に保持した予熱した6ウェルプレートの1ウェルに入れる。プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%で10分間インキュベートし、基底膜マトリックスの重合と硬化を可能にします。
マトリックスストリップが固まったら、プレートをインキュベーターに戻す前に、2ミリリットルの腸内増殖培地をウェルに追加します。エンテロイドを6ウェルまたは12ウェルプレートのウェルに移した後、隔日で、古い培地を新しい培地と交換する。そして、エンテロイドが繁栄し始めたので、5〜7日ごとに細胞を通過させます。
免疫蛍光染色では、ブロッキングバッファー中の一次抗体500マイクロリットルをエンテロイドの各ウェルに加え、摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、抗体溶液を取り出し、エンテロイドをPBSで3回洗浄する。1〜400希釈した二次抗体溶液中でインキュベートした後、DAPI中でインキュベートした後、エンテロイドをPBSで3回洗浄する。
エンテロイドの立体構造を保つには、薄いシリコンゴムシートまたはガラスカバースリップの切り欠きを使用して、下部スライドガラスとカバースリップの間に0.5〜1ミリメートルのスペースを作成します。取り付けには、染色したエンテロイドを70%グリセロールで洗浄します。次に、1マイクロリットルの接種ループまたはカットされた200マイクロリットルのチップを使用して、エンテロイドをプレートから持ち上げ、グリセロールとともにガラス顕微鏡スライドにマウントします。
透明なフィルムカバーで覆われたペトリ皿を準備し、フィルム上に2〜4滴の1マイクロリットルのデキストランFITCを追加します。マイクロマニピュレーターを使用して、実体顕微鏡下でマイクロピペットチップを液体の内側とフィルムの上に押し込み、シリンジを静かに引いてデキストランFITCをマイクロピペットに引き出します。マイクロピペットに2〜4マイクロリットルのデキストランFITCを充填した後、シリンジを押してピペットチップから空気を取り除きます。
また、マイクロピペットの注入された材料カラムを検査してエアポケットがないことを確認し、マイクロピペット内のデキストランFITCの容量を記録します。次に、空気圧ポンプに接続されている空気源をオンにしてから、ポンプをオンにしてポンプの持続時間を10〜15ミリ秒に設定します。次に、シリンジの活栓を回して、ポンプからマイクロピペットまでのラインを開きます。
インキュベーターからエンテロイドを取り出し、マイクロ注入後の光への露出を最小限に抑えるために、蓋付きの容器内の温かいフォームレンガの上に皿を置きます。エンテロイドの入ったペトリ皿を実体顕微鏡下に置き、マイクロマニピュレーターノブを動かして、マイクロピペットチップを水平面に対して35〜45度の角度で配置します。1皿あたり3〜5個のエンテロイドを注入することを目標に、球状のエンテロイドを視覚化して識別します。
次に、顕微鏡の接眼レンズを通して見て、先端を標的腸筋に進めます。次に、Z軸ノブを正確にゆっくりと動かして進め、マイクロピペットチップで腸管を穿刺します。先端が腸管表面を通過すると、前進は停止し、腸側表面は押し下げられて飛び出します。
片足でポンプペダルをタップし、膨張するまで緑がかったデキストラン-FITC溶液で腸管を満たします。ポンプの数を記録して、ポンプ容量とデキストラン濃度を計算します。このプロトコルは、腸上皮に特異的なさまざまなバイオマーカーを免疫蛍光抗体で染色することにより、胎児組織由来のエンテロイドの特性評価を示し、それらの小腸上皮起源を確認しました。
さまざまな段階のエンテロイドがここに示されています。生後7〜10日の腸管は小さくて厚いです。一方、マイクロインジェクションの準備ができている腸管は大きく、内腔と薄い壁がありました。
マイクロインジェクションの2日後には、まだかなりの量のデキストランFITCが含まれています。マイクロインジェクション後のエンテロイドの透過性は、培地中のデキストラン濃度を測定することにより評価した。タイトジャンクションでの膜透過性を高めることが知られているEGTAをポジティブコントロールとして使用しました。
デキストラン測定アッセイはさらに、LPSが透過性の増加を誘導し、LPS濃度が高いほど透過性が高いことを示しています。固定と染色で最も重要なことは、エンテロイドの形状を乱したり、プロセス中に失ったりしないことです。マイクロインジェクションに続いて、サイトカインアッセイのために培地を回収し、RNAシーケンシングのためにエンテロイドを回収することができます。
