このプロトコルは、コヒーレント抗ストークスラマン散乱と刺激ラマン散乱プロセスを含む、最も広く使用されている2つのハイパースペクトルコヒーレントラマン散乱技術を比較し、生物学者が生物学的用途に最適なイメージングモダリティを選択することを可能にします。固有の振動シグネチャを使用して、コヒーレントラマン分光法は、外因性標識を必要とせずに化学情報と生物学的サンプルをマッピングすることができます。コヒーレントラマン顕微鏡は、細胞代謝、マッピング、薬物分布、疾患診断、および化学変化の定量化に関する私たちの理解を広げました。
これは、光学と分光法の両方で十分な訓練を必要とする技術です。このテクニックを使用する前に、いくつかのレビュー記事を読んで、専門家の訓練を受けることをお勧めします。まず、カバースリップに両面テープを貼ってイメージングスライドを準備し、テープの中央から小さな長方形のテープを切り取り、サンプルを配置するためのオープンエリアを作成します。
ピペット1〜2マイクロリットルの純粋なDMSOを、空孔の中心に液滴を分配する。トップカバースリップを慎重に置き、カバースリップの端をそっと置き、DMSOサンプルがテープの端に接触しないようにしながらチャンバを密封します。感度実験のために、DMSOの段階希釈物を酸化重水素中に調製し、50〜0%の濃度範囲を与えるために各溶液の1〜2マイクロリットルを取り、前述のようにプレスサンプルを調製する。
サンプルを顕微鏡ステージに置き、必要に応じて対物レンズまたはコンデンサーに水または浸漬油を加えます。DMSO液滴の端を視野内で適切に動かし、対物レンズを調整して最適な焦点を合わせ、ケーラー照明法を使用してコンデンサーを中央に配置し、コンデンサーの絞りを完全に開きます。次に、ポンプビーム波長を800ナノメートルに調整して2913波数CH3ピークをターゲットとし、1/2波長板を調整してポンプとストークスビームの両方のパワーを顕微鏡の前に約30ミリワットに設定します。
SRS の場合は、時定数が 7 マイクロ秒でロックイン アンプのゲインを約 10 に設定し、時定数がピクセルの滞留時間よりも小さくなるようにします。約100×100平方メートルのスキャンサイズで200×200のピクセル数を使用して画像取得パラメータと取得ソフトウェアを設定し、画像にDMSO液滴と空き領域の両方が含まれていることを確認し、サンプルをスキャンしてコンピュータ画面で画像を確認します。次に、リアルタイム画像を監視しながらストークスポンプビーム内の電動遅延画像をスキャンし、信号が最大になるまで遅延をスキャンする。
DMSO液滴を視野全体をカバーするように動かし、信号がポンプビームに依存するため、DC信号の最大値が画像の中央にあるかどうかを確認します。ミラーを介してポンプビームの位置またはイメージングソフトウェアで電圧オフセットを調整します。DC最適化後、飽和度が画像の中心にあることを確認しながら、約50%の彩度を表示するようにしきい値を調整して、AC信号が最大になるまでストークスビームミラーを調整します。
そうでない場合は、ストークスビームでのみミラーを微調整し、アライメントの品質に関するリアルタイムフィードバックとしてアライメント中の信号を監視します。SNR 分析の場合は、ImageJ ソフトウェアを開き、[ファイル]、[インポート]、[ドロップダウン メニューの [テキスト イメージ] および [開く] オプションをクリックして、保存した DMSO サンプル テキスト ファイルをインポートします。画像が読み込まれたら、Control Shift Cを押して明るさとコントラスト機能を表示し、DMSOサンプルの領域が飽和状態になるまで自動ボタンを押して最大サンプル信号を見つけます。
次に、ImageJ インターフェイスの楕円形選択ツールをクリックし、飽和 DMSO 領域の小さな領域を強調表示します。強調表示後、M キーを押して、選択した領域の平均と標準偏差を測定します。背景を測定するには、空の領域の信号が観測できるまで明るさとコントラスト機能のバーを調整し、楕円形の選択をクリックして背景の領域を強調表示し、選択した領域にDMSOが含まれていないことを確認します。
その後、M キーを押して、選択した領域の統計を測定します。次に、標準偏差とともにノイズ平均値と信号平均値を測定して、先に示したようにSNRを計算します。ハイパースペクトルCRSイメージを処理するには、[ファイル]、[インポート]、[テキストイメージ]、および[開く]オプションをドロップダウンメニューからクリックしてテキストファイルをインポートします。
インポートしたら、[画像]、[スタック]の順にクリックし、[ツール]と[モンタージュをスタックする]オプションをクリックしてファイルを画像スタックに変換し、最初のDMSOピークが表示されるまでモンタージュをスクロールします。DMSOで領域を選択し、[画像]をクリックし、続いて[スタック]および[Z軸プロファイルのプロット]オプションをクリックして、強度対フレーム番号スペクトルをプロットします。次に、[リスト]をクリックし、プロファイルデータをコピーして生のスペクトルデータを抽出します。
回復したスペクトルを周波数単位に変換するには、DMSOからの対称および非対称CHストレッチとそれに対応するフレーム番号を使用して線形回帰を実行します。DMSOのスペクトル分解能は、ハイパースペクトルSRSおよびCARS顕微鏡を用いて測定され、それぞれ14.6および17.1波数の分解能を示し、SRSがより良いスペクトル分解能を有することを示している。DMSO SRSスペクトルは、0.1%および0.01%濃度で得られ、前者では2913波数のピークが分解できるが、後者では分解できず、検出限界が0.1〜0.01%DMSOであることを示している。
位相検索されたCARSスペクトルは、DMSO 2913波数ピークが0.1%DMSOに対して明確に分解できることを示していますが、これら2つの濃度間の検出限界を示す0.01%では解決できません。MIA PaCA-2セルのSRSおよびCARS強度プロファイルは、SRS信号が398.6ナノメートルの分解能を与え、CARS信号が330.3ナノメートルの1.2倍の分解能を示したことを実証した。異なる光学遅延位置にあるMIA PaCa-2細胞からのSRSおよびCARS画像は、SRSの明るいドットとして脂肪滴を有する最も強いシグナルを示すが、CARSはコントラストをはるかに低下させる。
しかし、スペクトル集束における37波数の赤方偏移は、SRSとCASの両方の脂質コントラストを改善した。SRSスペクトルは、脂肪滴の2850波数で他の細胞小器官よりもはるかに強いシグナルを示すが、CARSスペクトルは小さな赤方偏移を示す。コヒーレントラマン散乱信号を最適化するには、まずサンプルフォーカスを見つけ、次に光遅延を調整し、最後に最大に達するまでミラーを微調整します。
過渡吸収などの他のポンププローブ技術は、本質的にCRSプラットフォームに統合されています。この技術は、強い光吸収性非蛍光分子の吸収動態を測定するのに非常に強力です。この技術により、研究者は、高い化学細胞活性を有する標識のない方法で小分子を見ることができる。
また、研究者は脂質代謝、細胞内動態、薬物分布の変化を見ることができます。
