このプロトコルは、マウス脳および成体ゼブラフィッシュにおいてインビボ深部組織三光子顕微鏡検査を行う方法を示す。生命科学における2つの重要なモデルシステム。長波長3光子顕微鏡は、2光子顕微鏡ではアクセスできない深さの無傷の組織または器官のin vivo高空間分解能イメージングを可能にする。
この技術は、アルツハイマー病や自閉症など、病気が脳にどのように影響するかを完全に理解していない神経学的疾患の根底にあるメカニズムを理解するのに役立ちます。マウスの脳イメージング手順の実演は、当研究室のポスドク研究員であるKibaek Choe氏、ゼブラフィッシュの脳イメージング手順の実演は、フェッチョ研究所の助手であるクリスティン・コルクマン氏です。まず、レーザーの電源を入れ、非共線光パラメトリックアンプのアイドラー出力の中心波長を1、300または1、700ナノメートルに設定し、パルスコンプレッサーを光路に配置してフェムト秒レーザーをプリチャープし、3光子イメージングのパルス持続時間を最適化します。
シリコンプレートとレーザーパスの間の角度をブリュースターの角度に設定してレーザー透過率を最大化し、シリコンプレートを回転させて反射を最小限に抑えてブリュースターの角度を実現します。次に、フリッパーミラーを配置して、1、300、1、700ナノメートルのビームラインを便利に切り替えます。回転ステージに取り付けられた半波長板と偏光ビームスプリッターを配置してレーザーの強度を制御し、ビームスプリッターの反射経路にビームブロッカーを配置します。
0.5センチメートルの2%高融点寒天を含むペトリ皿を準備する。寒天が冷えて固まったら、寒天の長方形の穴を魚よりも長く、わずかに広く切ります。ワックスを使用して、細いチューブを長方形に、より大きな直径のチューブをペトリ皿の端に取り付けます。
次に、魚を1ミリリットルあたり0.2ミリグラムのトリカイン溶液に入れて麻酔をかけ、麻酔をかけた魚を濡れたスポンジの上に置き、次にマイクロシリンジを使用して、3マイクロリットルの臭化パンクロニウムを後眼窩に注入して魚を麻痺させ、ハンクスの溶液に短時間入れて完全に麻痺していることを確認する。次に、魚の背側をペトリ皿に上げて頭をチューブの方に置き、鉗子を使って魚の口を静かに開き、チューブを口の中にスライドさせます。チューブが魚の口の後ろに来るように、魚をチューブに向かって静かにスライドさせます。
素早く、しかし穏やかに、魚の周りの寒天を乾燥させ、魚の上に水を取り除きます。実験組織の小片を実験室の接着剤に浸し、魚の両側と魚の後ろの尾からえらまでの寒天の上に組織を置きます。次に、頭の表面に直接ブピバカインの小さな滴を置いて魚の皮膚を麻酔し、魚の入ったペトリ皿を顕微鏡に持って行きます。
魚の施設の水で皿を満たし、チューブをウォーターポンプに接続して、魚の口にシステム水をポンプで送り込みます。水がバブラーで酸素化され、水槽のヒーターで摂氏30度に温められていることを確認してください。イメージングのために、3光子顕微鏡上に低倍率対物レンズを置き、魚とチューブを含むペトリ皿を顕微鏡下に置き、LED光源を使用してペトリ皿を照らす。
画像取得ソフトウェアから、カメラモードを開き、[ライブ]をクリックし、画面の右側にあるチャンネルAを選択して、ヒストグラム設定を調整して画像が鮮明に表示されます。モーターコントローラーのモーター設定をベースに設定したら、魚が見えるまで目標を下げます。魚の頭の中心を視野の中心に置き、目標を魚の頭から上へ動かします。
低倍率対物レンズを高開口数対物レンズに交換して3光子イメージングを行い、魚の頭に近づけます。すべてのモーターの軸値をゼロに設定します。対物レンズをゆっくりと下げ、対物レンズが頭部に物理的に接触しないようにします。
CCDカメラソフトウェアでは、頭頂部が見えたら対物レンズの動きを止め、X、Y、Zの位置をゼロに設定します。LED光源をオフにしてシステムの周りの暗いカーテンを閉じてから、イメージング取得ソフトウェアを3光子イメージング用のマルチフォトンGGモードに設定し、対物レンズの下のパワーを1ミリワット未満に設定します。画像取得ソフトウェアの[ライブ]ボタンをクリックします。
PMTチャンネルを開き、必要に応じてPMTゲインとバックグラウンドレベルを調整します。対物レンズをゆっくりと上に移動し、大血管と窓ガラス表面からのTHGチャネルを監視して、頭部の表面を見つけます。対物レンズを窓に近づけた後、対物レンズと頭蓋窓の間に水をかけ、すべてのモーターの軸値をゼロに設定します。
画像取得ソフトウェアの[ライブ]ボタンをクリックします。PMTチャンネルを開き、必要に応じてPMTゲインとバックグラウンドレベルを調整し、対物レンズをゆっくりと上に移動して、大血管と窓ガラス表面からTHGチャンネルを監視して、カバースリップの表面を見つけます。必要に応じて窓の向きを調整し、モーターをゼロにして脳の表面を定義します。
イメージングを行い、撮影深度に応じてパワーレベルを調整します。成体ゼブラフィッシュ脳内の遺伝子標識ニューロンの高解像度、非侵襲的、および深いイメージングは、3光子顕微鏡を用いて達成される。視蓋および小脳における細胞層の分布も観察することができる。
顕微鏡のカメラ機能を使用して魚の位置を特定しました。頭蓋骨はTHGチャネルで見られ、脳をナビゲートして上面を見つけるのに役立ちます。ニューロンは、成人の脳の奥深くで高いシグナル対バックグラウンド比で区別可能です。
成体マウス脳におけるGCaMP6s標識ニューロンおよびテキサスレッド標識血管の多色3光子像とTHGシグナルを併せて示す。セットアップの最適化により、CA1海馬領域の脳表面から1.2ミリメートルまでの高コントラスト画像を得ることに成功しました。10分間の記録セッションで750マイクロメートルの深さにあるGCaMP6s標識ニューロンのカルシウム活性痕跡は、高い記録忠実度を示した。
この設定は、脳機能を理解するためにニューロン活動を視覚化するのに役立ちます。また、様々な生物学的システムを理解するために、生物学的組織内の細胞の動きを追跡するために使用することができます.さらに、血流速度を測定して動物の健康状態を監視することもできます。
