病原性真菌の分離方法は、微生物防除剤の開発に重要である。このプロトコルは、土壌サンプルから高い病原性病原性真菌分離株を分離し、選択するために使用することができる。この技術は、病原性スクリーニングの3つのプロングを含み、効果的なコニディア数ランキングを行うために、耐熱性とコニディア生産アッセイを組み合わせた。
この方法は、商業化のための高病原性および有望な病原性新真菌分離株を選択するのに役立つ。このプロトコルは、生物学的制御に焦点を当て、病害虫と病原性真菌との相互作用を研究するために、病原性真菌分離株を発見するためにも使用することができる。この手順のデモンストレーションは、私の研究室のマスター学生であるヤオ・チア・リュウとニアントンニです。
表面の土の1センチメートルを取り除き、シャベルを使用して各サンプリング部位から5〜10センチメートルの深さの中の土壌を収集することによって、土壌サンプルの収集から始めます。各サンプリング部位の詳細を記録した後、100グラムの土壌サンプルを収集し、室温でビニール袋に保持し、3時間以内に真菌分離プロトコルを実行します。潜在的な病原性真菌(EPF)を分離するには、プラスチックカップに土壌サンプル100グラムを加え、幼虫の死亡率と真菌症を毎日観察し記録して、暗闇の中で室温で土壌の表面に5つのテネブリオモリターワームを2週間置きます。
真菌の分離のために2週間までカップに死んだ幼虫を保ちます。2週間後、死んだ昆虫をきれいなベンチに移し、生殖不能の爪楊枝を使ってコニディアを集める。真菌の一次培養を得るために、収集したコニジアを55ミリメートルプレートに4分の1の強さのサボローデキストロース寒天培地またはSDAにストリークし、摂氏25度で7日間インキュベートする。
8日目には、各一次培養真菌を積層フローフードの55ミリメートルの4分の1のSDAプレートに付け直してから、培養物を25°Cで7日間インキュベートし、真菌の単一コロニーを得る。最初の病原性スクリーニングでは、テネブリオモリター幼虫を各純粋な真菌培養プレートの表面に摂氏25度で直接配置します。真菌症と死亡率を10日間観察して記録した後、さらに分析するために真菌分離株を選択します。
第2の毒性試験を行うために、各真菌のコニディアを1分間渦化して単離して収穫し、ヘモサイトメーターを用いてコニディアの数を数える。完了したら、10マイクロリットル当たり10倍の濃度に10倍の濃度に調整し、0.03%界面活性剤溶液で1ミリリットル当たり10倍のコニディアを1ミリに調整してから、10マイクロリットルの真菌懸濁液を55ミリメートルの4分の1の強さのSDAプレートに広げ、暗闇の中で摂氏25度で7日間成長させます。8日目には、各純粋な真菌培養プレートの表面に直接5匹のテネブリオモリター幼虫を置き、前に述べたように真菌症と死亡率を観察しながらインキュベートするためにパラフィルムフィルムでプレートを密封します。
各真菌分離物に対して三重化で第2の毒性試験を繰り返した後、スポドプテラリトゥラのような標的害虫に対して第3の毒性試験を行う分離株を選択する。7日間の四分の一の強さのSDAプレートから1平方ミリメートルのEPFを集めて、真菌ゲノムDNA抽出キットを使用して真菌ゲノムDNAを抽出します。次に、テキスト原稿に記載されたPCRプログラムに続くDNAサンプルのPCRにより、真菌内部転写スペーサーまたはITS領域を増幅する。
市販のシーケンシングサービスによってPCR増幅産物をシーケンシングした後、NCBI BLASTを使用してNCBIデータベース内の同様の真菌を検索し、系統分析のための相対的な真菌種を選択します。複数の配列を整列させ、保存された配列領域をGeneDocで手動でトリムします。最小進化、近隣結合、および最尤法に基づいて系統解析を行います。
真菌の形態を研究するには、カメラで7日間の真菌培養コロニーの成長をキャプチャし、成長、形態:ふわふわまたはしっかりした、コロニーの色を記録します。コニジオフォアでコニディアを観察するには、接種ループを有する純粋な培養真菌コロニーからコニディアを削り取り、0.1%Tween 80溶液を含むガラススライドに胞子を移す。メスを使用して真菌コロニーの寒天ブロックを切断し、寒天ブロックをガラススライドに移し、0.1%Tween 80溶液を追加して寒天上の余分なコニディアのほとんどを洗い流します。
次に、コニディアの軽い顕微鏡観察のためのカバースリップでスライドを覆う。異なる真菌分離株の差を比較するために、コニディアとコニディオフォアの幅と長さを測定し、記録します。選択した真菌分離物を暗闇の中で摂氏約25度で10日間培養して、円錐状の産生アッセイを手配します。
次に、真菌分離液の1ミリリットルの心間懸濁液を0.03%界面活性剤溶液に調製し、続いて、前述のように1ミリリットル当たり10回のコニディアに10回濃度を調整する。4分の1の強さのSDAプレートに10マイクロリットルのコンディアル懸濁液の3つの液滴を加えた後、7、10、および14日間暗闇の中で摂氏25度で培養液を培養し、真菌の胞子を数えます。各時点で、コルクボーラーでコロニーの中心から5ミリメートル寒天ブロックを取り外し、0.03%界面活性剤溶液の1ミリリットルを含む1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブにブロックを移します。
室温で毎分3,000回転で15分間回転した後、ヘモサイトメーターを使用してコニディアの数を数えます。耐熱性アッセイのために、先に示したように、選択した真菌を単離し、1ミリリットルの懸濁液当たり1/7コニジアに10回調製して培養する。ボルテックス後、乾式浴場で経状サスペンションを45°Cで異なる時間間隔で加熱します。
熱暴露後、55ミリメートルの4分の1の強さのSDAプレートに5マイクロリットルの対等懸濁液の3つの液滴を各時点で加え、18時間摂氏約25度でプレートをインキュベートします。発芽率を決定するには、200倍倍倍の倍率で、光顕微鏡下で5つのランダムに選択されたフィールドを有する発芽したコニジア胞子の数を数える。式を用いて有効なコニディア数またはECNの合計を計算し、原稿に記載されているように、真菌株の原理成分分析またはPCAを計算する。
ECNまたはPCAに基づいて最も優れた菌株を選択し、標的害虫の毒性試験を行います。第2の病原性試験では、テネブリオモリターミミズに対する26の真菌分離株の病原性を評価した。12の真菌分離株は、高病原性を有し、スポドプテラリチュラに対する毒性試験のために選択された。
真菌分類体の位置をよりよく理解するために、最初の病原性スクリーニングから26個の分離株をITS領域に基づく分子解析を行った。真菌形態観察の洗浄方法を通じて、コニジオフォアの構造は0.1%Tween 80溶液ではっきりと見ることができました。コニディアの色、形状、配置は、コニディアコロニーの顕微鏡観察を通じて研究された。
ECNは各EPFのコニディア生産および耐熱性データを結合する。ECN値が高い場合に真菌株の高い生存率が観察された。また、PCAとECNの間の優れた調整が明らかになっており、ECNを使用して生存率関連パラメータの階層を評価できることが示唆された。
真菌DNAを抽出し、真菌分離物を培養する病原性スクリーニングは、手順において重要である。ECN計算式を用いることで、理想的な内部病原性真菌を選択することができる。土壌サンプルから昆虫菌を餌にする大きなワックスガとミミズなどの異なる昆虫種の組み合わせは、エント病原性真菌の多様性を増加させる可能性があります。
土壌の微生物の多様性は、このプロトコルの操作中に非常に興味深いトピックです。また、このプロトコルを介して将来的にさらに調査される可能性があります。
