シャペロンとコカペロンの相互作用を研究するために、均質なビーズベースのアッセイを構築しました。この技術を用いて、Hsp90とFKDP51またはFKBP52間の相互作用を阻害する小分子をスクリーニングし、強力で選択的な阻害剤を同定する。この高スループットのスクリーニング技術は、堅牢で信頼性が高いものです。
結果は1時間以内に得ることができ、少量のビーズタンパク質と化合物しか必要としなくていい。このコカペロンとのHsp90相互作用は、アルツハイマー病、癌、自己免疫疾患などのヒト障害に関与していた。この技術は、高い医学的重要性を持つシャペロンコカペロン阻害剤をスクリーニングする機会を提供します。
このアッセイの基本原則はここにあります。コカペロンのHsp90C-末端ペプチドとTPRドメインの相互作用がドナービーズとアクセプタービーズを近接させると、高度に増幅されたシグナルが生成されます。インタラクション阻害剤を添加すると、ドナービーズとアクセクタービーズは近接に達することができず、検出可能なシグナルは生成されません。
まず、1ミリリットル当たり1ミリグラムでPBS中のHsp90ペプチドを希釈します。PBSで非コンジュゲートアクシータービーズを希釈し、1.5ミリリットルのチューブにビーズを移します。希釈したビーズを洗浄用に遠心分離し、上清を慎重に取り除きます。
結合する場合は、ペプチド中のアクセプタービーズを10~1の比率で設定します。PBS希釈ペプチドにおける淡酸ビーズに、Tween 20およびシアナバラ水素化ナトリウム溶液、および回転シェーカー上の終末撹拌でインキュベートする。未反応部位をブロックするには、pH 8.0の1モルトリス塩酸塩溶液の20マイクロリットルをビーズに加え、摂氏37度で1時間インキュベートして反応を焼き付けます。
インキュベーションの終わりに、遠心分離によってビーズを洗浄し、トリス塩酸塩溶液の1ミリリットルでビーズペレットを再懸濁します。洗濯をもう2回繰り返します。最後の洗浄後、貯蔵バッファー内の1ミリリットル当たり1ミリグラムでビーズを再中断し、共役したアクサクサビーズ溶液を光から保護して摂氏4度で保存します。
PBSで1ミリリットル当たり10マイクログラムでグルタチオンドナービーズを追加します。1ミリリットル当たり10マイクログラムの最終濃度にGSTFKBP51を加え、暗闇の中で摂氏25度で10分間反応をインキュベートします。DMSOでテスト化合物のシリアル希釈を行います。
384ウェルプレートの各ウェルの隅に0.25マイクロリットルの試験化合物希釈液と三重を加えます。陰性コントロールの場合は、DMSOを0.25マイクロリットル加え、正のコントロールのために、ウェルにHsp90 C末端ペプチドの0.25マイクロリットルを加えます。各ウェルにGSTタグ付きタンパク質を含むグルタチオンドナービーズを含む溶液の22.5マイクロリットルを追加します。
手でプレートを十分に振り、摂氏25度で暗闇の中で15分間インキュベートします。取り付けられたHsp90C-末端ペプチドでアクセプタービーズをPBSの0.5倍の1ミリリットル濃度に100マイクログラムに希釈します。各ウェルに希釈アクセクタービーズ2.25マイクロリットルを加えます。
デモンストレーションしたように、暗闇の中でプレートを15分間振ってインキュベートします。プレートリーダーの楽器をオンにし、プレートの信号を測定し、テキスト原稿に記載されているようにデータを分析します。ようこそダイアログで X-Y データテーブルを作成し、X 番号、Y を選択し、3 つの反復値を並べて列に入力します。
濃度値を X 列に読み込み、信号値を Y 列にインポートします。[解析]をクリックし、変換濃度 X を選択して、対数に変換を選択します。[分析]をクリックし、[X-Y分析]で非線形回帰を選択します。
線量応答阻害オプションを開き、対応答変数勾配方程式対対を選択します。[大丈夫]をクリックして、IC50値とグラフを含む結果を表示します。このアッセイは、小分子のスクリーニングに用いられ、Hsp90とFKBP51またはFKBP52との相互作用を阻害する。
Zスコアは0.8以上、バックグラウンド比は13.35で、高スループットスクリーニングの堅牢性と信頼性を発揮します。シャペロンコカペロン相互作用の阻害に対する小分子量試験化合物D10の効果を評価し、IC50値を計算し、そこでD10は用量依存性阻害を示した。Hsp90 GSTFKBP51相互作用のIC50値は65ナノモルであった。
一方、Hsp90、GSTFKBP52相互作用については、化合物濃度が最も高い状態では完全な阻害が達成されなかったので、小分子とのタンパク質とタンパク質相互作用の選択的阻害が達成されることを示している。重要なステップは、追加の順序です。まず、小分子とTPRターゲットとの間に複合体を形成します。
それ以外の場合は、より長いインキュベーションおよび高い化合物濃度が必要です。この技術を使用して、Hsp90とFKB51またはHsp90とFKB52の相互作用を破壊する小分子をスクリーニングすることができます。また、Hsp90、Hsp70およびコカペロンスクリーニング選択的阻害剤を含むTPRモチーフとの間の任意の相互作用に拡張することができる。
