このプロトコルは、脳転移性腫瘍細胞の形成および既成腫瘍に対する薬物有効性および放射線の迅速な試験を可能にするex vivo脳スライスの生成を可能にする。この技術の主な利点は、脳-腫瘍-宿主相互作用を維持する生理学的に関連する環境で複数の薬物または治療法を迅速に試験できることである。この方法は、脳転移細胞がどのように成長し、生存し、脳実質に侵入するかを理解し、癌の成長および広がりにおける脳腫瘍微小環境の役割を理解するのに役立つ可能性がある。
この手順を実演するのは、私の研究室の博士候補であるLorela CirakとEmily Esqueaです。まず、麻酔をかけたマウスを定位フレームに入れ、標準的なイヤーバーを使用して頭を固定します。切開前にヨウ素綿棒と70%エタノールを交互に繰り返し塗布することによって、頭部の表面を3回滅菌する。
外科用メスを使用して、マウスの脳を2つの対称的な半分に分割し、頭蓋骨を露出させるために、虚数軸に対して対角線角度で1センチメートルの正中線切開を行う。綿棒で血液を拭いた後、皮膚を横にそらして注射部位を露出させます。0.73ミリメートルのバリビットを使用して頭蓋骨を貫通し、わずかな圧力とねじれ運動を使用して穴を開けます。
GFPルシフェラーゼを安定に発現する細胞5マイクロリットルを注入するには、高精度シリンジを脳内の深さ3.5ミリメートルに挿入する。それが2分間落ち着くのを許してから、シリンジを約1ミリメートル引き上げます。2分後、最初の半分のボリュームをゆっくりと注入し、さらに2分間待ってから残りのボリュームを注入します。
3分後、ゆっくりとシリンジを引く。頭蓋骨の注射部位に骨ワックスを塗布し、ポリプロピレン縫合糸で組織を縫合する。手術直後のマウスの行動を定期的に監視して、生理食塩水注射やソフトフードなどの特別な治療が迅速な回復に役立つかどうかを判断する。
生物発光イメージングを介して腫瘍の成長を監視するには、まずイメージングシステム上の酸素とイソフルランをオンにし、両方をイメージングボックスの外側の別々のチャンバに分配できるようにします。次に、ソフトウェアをオンにして機器を初期化した後、マウス本体全体を視覚化してキャプチャするための適切なオプションを選択します。次に、酸素とイソフルランを供給した撮像箱の外側のチャンバーにマウスを移す。
マウスが麻酔効果を受けたら、マウスに200マイクロリットルのルシフェリン1ミリリットルあたり30ミリグラムを腹腔内に注射する。マウスを、胃が鼻唇を撮像室に下に向けて画像化室内に置く。チャンバーをロックし、露光時間 2 分を選択してイメージングを開始し、イメージングを完了します。
組織スライサーを滅菌層流フードに入れた後、すべてのツールと器具を70%エタノールで洗浄します。マウスを安楽死させた後、脳を取り出し、氷冷スクロースACSF溶液に素早く入れます。ヘラを使用して、60ミリメートルの皿蓋の上のACSF濡れろ紙に脳を移す。
鋭利で滅菌されたカミソリの刃を使用して、脳の底部を含む腫瘍を含まない脳の余分な部分を切断し、脳の形状を非完全な立方体にする。ACSFで濡らしたろ紙を数枚切断プラットフォーム上に置いた後、ブロックされた組織をろ紙の上に置きます。組織を厚さ 200 ~ 250 マイクロメートルのセクションにスライスするには、プロバイダ定規で切断サイズを 2 または 2.5 単位に設定し、切断を開始します。
ペイントブラシを使用して脳スライスをスクロース-ACSFを含む皿に移し、27ゲージの針を使用して光学顕微鏡下でスライスを分離します。蛍光顕微鏡下でGFP陽性スライスを同定する。次いで、広い開口部を有する滅菌1ミリリットルの壊れたピペットを用いて、同定されたスライスを、2〜3ミリリットルの成人スライス培地を含む新しい60ミリシャーレに移す。
次いで、6ウェルプレートの各ウェル内の各組織培養インサート上に3〜5枚のスライスを安全な距離で移す。インサートの表面から余分な培地を除去した後、各インサートの下に平衡化した成体マウススライス培地を1ミリリットル加える。イメージングする前に、組織を摂氏37度、二酸化炭素5%、湿度95%で24時間インキュベートします。
1ミリリットル当たり30ミリグラムのルシフェリン溶液5マイクロリットルを滅菌フード内のインサートの下の培地にピペットする。固定カメラの下の機器の撮像チャンバ内に蓋付きの6ウェルプレートを置き、チャンバドアをロックします。ソフトウェアを開き、計測器を初期化します。
画像ごとに 1 つのウェルのみの視覚化とキャプチャを可能にするカメラ設定を選択したら、イメージするウェルをカメラの真下に配置します。ROIツールを使用して、腫瘍の形状と大きさの周りにそれを合わせ、ROIを測定し、総測定値を報告して、スライス上の各腫瘍の生物発光シグナルを定量化します。プレートを滅菌層流フードに戻した後、鉗子を使用してインサートをウェルからわずかに持ち上げます。
培地を吸引した後、培地を1ミリリットルの新鮮な培地と交換し、差し込み口をウェルに戻します。スライスを阻害剤や代謝産物などの各種化合物で処理する実験では、1.5ミリリットルのチューブで1.2ミリリットルの脳スライス培地に適切な試薬濃度を調製し、スライスを含むウェルに1ミリリットルの試薬を移します。MDA-MB-231 BR-GFPルシフェラーゼ細胞をヌードマウスに注射し、腫瘍を増殖させ、腫瘍を有する脳を解剖し、スライスし、エクスビボで増殖させ、腫瘍増殖を生物発光イメージングによってモニターした。
H&E染色およびGFP陽性蛍光は、脳スライスにおける腫瘍の存在を確認した。Ki−67染色の増加は、増殖性の高い癌細胞の存在を確認した。照射に曝されなかった脳スライス中の腫瘍は、エクスビボで増殖し続けたが、放射線照射に曝露された腫瘍は、持続的な成長を示した。
腫瘍を含む脳スライスもライブイメージングを介してモニターし、照射処理後の腫瘍増殖を可視化した。生物発光イメージングと一致して、対照癌細胞はGFP強度が増加し、細胞が脳実質に侵入し始めるにつれて急速に成長した。対照的に、照射で処理した脳スライス中の癌細胞は細胞増殖抑制され、GFP強度は維持されていた。
大きな多核癌細胞およびIR処理癌細胞におけるDNA損傷マーカーの染色の増加が検出された。また、反応性アストロサイトの増加も検出された。IR処置誘発性アポトーシスは、腫瘍のないマウス脳スライスでは検出されなかった。
腫瘍を含む脳スライスを、化学療法薬であるパクリタキセルの異なる濃度で処理した。治療は、治療の10日目に腫瘍のサイズを有意に減少させた。アポトーシスの増加は、パクリタキセル処理腫瘍細胞において検出された。
インヒビター治療は脳組織の生存率を変化させなかった。アポトーシスの増加は、パクリタキセル処理された腫瘍のないマウス脳スライスにおける切断されたカスパーゼ−3染色によって測定されなかった。目的の薬物による治療が終了したら、スライスを免疫細胞化学、オミック研究を通じてタンパク質発現について分析するか、フローサイトメトリーに適した単一細胞懸濁液を達成することができます。
