ダイヤモンド光源のXChem施設における効率的なフラグメントスクリーニングの実現

Diamond Light SourceのXChem施設は、日常的に大規模な結晶グラフィックフラグメントスクリーニングを提供し、結晶から堆積プロセス全体をサポートします。X線結晶構造解析は、FBDDツールキットに不可欠な要素です。弱い結合体を同定するのに十分な感度を持ち、分子レベルでの相互作用に関する構造情報を直接得ます。

フラグメントベースの創薬は、リード創薬に広く使用されている戦略です。これまでに6つの医薬品を臨床用に供給し、50以上の分子が臨床試験に進んでいます。XChemプラットフォームがもたらす進歩と効率性が、従来の浸漬方法、データ収集、分析方法に及ぼす影響は、視覚的に最もよく実証されています。

まず、結晶と化合物の位置を選択します。PCからTextRankを開き、右下のリストから、または左上のボックスにバーコードを入力して、クリスタルトレイを選択します。正しい画像形式とシングルウェルビューを選択します。

結晶に当たらずに溶媒や化合物を液滴に添加するには、液滴内を右クリックしますが、液滴画像内を移動しながら実験に適した結晶が見つかった場合は、結晶から離れます。Echoソフトウェアを開き、[新規]を選択して、アコースティックディスペンサーを使用して溶液をディスペンスします。正しいソースウェルプレートと液体クラスを選択してください。

正しいプレート タイプがデスティネーション プレートとして選択されていることを確認します。次に、カスタムボックスをオンにして続行します。[インポート] を選択し、関連するバッチ ファイルを選択します。

次に、ソフトウェアの指示に従ってインポート手順を完了します。プレートマップを使用して、分注する溶液と供給先を確認します。次に、表示されるプロンプトに従ってプロトコルを実行します。

ソースプレートからの溶液は、選択した結晶滴に分配されます。プレートをインキュベーターに必要時間保管します。半自動結晶採取装置を使用して結晶を採取するには、ワークフロー開始ボタンを押して、最初に選択したウェル位置に移動します。

結晶が残っている場合は、ループに取り付けて液体窒素に突入し、リストの最初のパックの1番目の位置に配置します。インターフェイスから水晶振動子の適切な説明を選択します。滴がコンパウンドソークの場合は、コンパウンドの状態の説明を記録します。

水晶振動子が正常にマウントされた場合は「マウント済み」を選択し、そうでない場合は「失敗」を選択します。結晶が収穫されたら、パックをバーコードスキャナーに持って行き、一度に1つずつホルダーに入れてパックをスキャンし、バーコードをピンで留めます。スキャンが完了したら、パックに蓋をして液体窒素貯蔵デュワーに保管します。

中心がずれたサンプルを回収するには、ISPyBのサンプルチェンジャービューで[rank by AP resolution]を選択し、緑から赤への色目盛りで自動処理された解像度でサンプルをグレーディングします。サンプルをクリックして、赤または黄色のサンプルを確認します。次に、結晶のスナップショットをチェックして、水晶が中央に配置されているかどうかを確認します。

XChem Explorer または XCE を使用して Diamond の自動処理結果を取得および分析するには、ターミナルでサブフォルダー processing に移動し、エイリアス XCE を使用して XChem Explorer を開きます。[概要] タブの [データ ソースからテーブルを更新] ボタンを選択して、実験データの概要を更新します。[設定] タブで、データ収集ディレクトリを選択し、[データセット] タブを開きます。

[ターゲットの選択] ドロップダウンメニューからターゲットを選択し、[データセット] ドロップダウンメニューから [自動処理から新しい結果を取得] を選択して、[実行] をクリックします。ディンプルを使用して初期マップを計算するには、マップタブを開き、ドロップダウンメニューから参照モデルを選択して目的のデータセットを選択し、選択したMTZファイルに対してDimpleを実行します。リガンド拘束を生成するには、目的のデータセットを選択し、マップと拘束ドロップダウンから選択した化合物のSCF、PDB、またはPNGファイルを作成します。

Panda を使用してヒットを識別するには、 [Pandas] タブを選択し、出力ディレクトリが正しく定義されていることを確認して、panda を実行します。[ヒット識別]ドロップダウンメニューから分析します。Panda によって識別されたヒットを分析するには、panda を実行します。

[Hit Identification] ドロップダウンメニューから inspect を実行します。PandaコントロールパネルでCootを開きます。イベントマップおよびモデルと比較するためのディンプルからのロード平均および2mFo-DFcマップ。

リガンドがフィットしたら、バインドされた状態モデルへの変更が失われないように、別のイベントに移動する前に、リガンドをモデルとマージしてモデルを保存をクリックします。イベント・コメント・フィールドを使用してバインディング・イベントに注釈を付け、レコード・サイト情報を使用してバインディング・サイトに注釈を付けます。すべての実行可能なリガンドがモデル化され、マージされ、イベントマップに基づいて保存されたら、panda.inspectを閉じます。

Panda inspectモデルをプロジェクトディレクトリにエクスポートし直し、選択したデータセットのリファインメントの最初のラウンドを開始すると、リファインメントがリファインメントタブに表示されます。X線結晶構造解析によるフラグメントスクリーニング用のXChemパイプラインは大幅に合理化され、科学界による採用が可能になりました。このチャートは、2015年から2019年にかけてのユーザープログラムの取り込みと統合を示しており、2019年のブロック割り当てグループの作成と、2020年のCOVID-19パンデミックによるプラットフォームの回復力を示しています。

キャンペーンが成功すると、標的タンパク質上の潜在的な相互作用部位の3次元マップが得られます。典型的な結果は、SARS-CoV-2の主要なプロテアーゼのXChemスクリーニングです。酵素活性部位やサブポケットなどの既知の関心部位は黄色で示されています。

タンパク質間相互作用に関与するものなどの推定アロステリック部位はマゼンタで示され、一般に偽陽性と見なされる結晶パッキング界面は緑色で示されています。歴史的に、結晶構造解析を主要なフラグメントスクリーニングとして使用することは困難でした。この研究では、サンプル調製から最終構造までのXChemパイプラインプロトコルを文書化しました。

結晶学的フラグメントスクリーニングは、他の生物物理学的手法を補完するものであり、通常、フラグメントヒットをリード化合物に進行させるために不可欠です。あらゆる創薬ターゲットクラスに適用できます。