ガングリオシドは、すべての脊椎動物の細胞表面に発現しており、神経細胞に特に豊富に存在する。それらは細胞シグナル伝達および細胞 - 細胞認識を調節する。このプロトコルは、ガングリオシドの単離および分析を導入する。
この技術は、精製を合理化しながら、大小のスケールでガングリオシド収率を最大化するために選択された。また、ガングリオシド分析を比較的迅速に行う方法も説明します。脂質、特にガングリオシドのような極性脂質に関する研究は、タンパク質や核酸を扱うのとは異なるツールや技術を必要とします。
このビデオでは、これらの分子を操作する方法に慣れ親しんでいます。クロロホルムやテトラヒドロフランなどの溶媒は一般的なプラスチックを溶解するため、これらの手順では、テフロン(登録商標)ライニングキャップ、ガラスピペット、ガラス、ステンレス製マイクロシリンジ、テフロン(登録商標)ガラスホモジナイザーを備えたガラス瓶およびバイアルを使用する。これを怠ると、製品中のプラスチックポリマーが分析を妨げる可能性があります。
まず、組織湿重量1グラムあたり4.1ミリリットルの水を加え、10ストロークで均質化します。組織1グラムあたり13ミリリットルのメタノールを加える。それを摂氏22度の周囲温度に移し、混合する。
PTFEライニングスクリューキャップを備えた厚肉のガラス製スクリューキャップ付きチューブに組織を移し、徹底的に混合します。組織1グラムあたり6.5ミリリットルのクロロホルムを加え、蓋をし、徹底的に混ぜる。450倍gで15分間遠心分離する。
次いで、透明な上清を新鮮なスクリューキャップ付きチューブに移し、その体積を回収抽出量として測定する。分配のために、回収された抽出量の水の0.173倍を透明な上清に加える。それからそれをキャップします。
渦が勢いよく。450倍gで15分間遠心分離する。ガングリオシドを含む上部相を、PTFEライニングスクリューキャップを備えた新鮮なガラス管に移す。
逆相カートリッジクロマトグラフィーを行うには、5 ミリリットルのガラスシリンジを使用して、tC18 固相抽出カートリッジを 3 ミリリットルのメタノールで洗浄します。次に、クロロホルム - メタノール - 水を2対43〜55の割合で3ミリリットル加える。前のステップの上相を同じガラスシリンジを通してtC18カートリッジにロードします。
フロースルーを収集し、カラムにリロードして吸着を最適化します。カートリッジを3ミリリットルのクロロホルム - メタノール - 水で洗浄し、次に3ミリリットルのメタノール - 水で洗浄する。ガングリオシドを3ミリリットルのメタノールで溶かし、新鮮なスクリューキャップ付きチューブに入れます。
摂氏45度以下の温度で窒素の穏やかな流れの下で蒸発乾固させる。元の組織湿重量のグラムあたり1ミリリットルでメタノールに溶解する。100グラムの脳灰白質をブレンダーに入れ、pH6.8の冷却された10ミリモルのリン酸カリウム緩衝液の脳湿重量あたり1ミリリットルを加える。
その後、ローで20秒間均質化します。脳湿重量1グラムあたり8ミリリットルのテトラヒドロフランを加え、10秒間ローで均質化する。ガラス製遠心分離機ボトルにデカントし、5,000倍gで15分間遠心分離した。
上清を集め、その体積を測定し、ガラスの分液漏斗に移します。上清1ミリリットル当たり0.3ミリリットルのエチルエーテルを加える。激しく振る。
その後、30分間邪魔されずに座らせ、その間に2つの相、上部エーテル相および下部水相が分離する。ガングリオシドを含む下相をPTFEライニングキャップ付きのガラス瓶に集める。分液ロートに残っている上部エーテル相に、前のステップからの元の上清1ミリリットルあたり0.1ミリリットルの水を加える。
激しく振る。フェーズの分離を許可します。次に、下部水相を収集し、以前に収集した下部相と組み合わせる。
結合された下部相を乾燥粉末に蒸発させ、それを計量する。逆相クロマトグラフィーを行うには、真空または圧力を使用してカラムに 50 ミリリットルの溶媒を通し、洗浄につき 1 分未満で 50 ミリリットルの溶媒を通過させることにより、大規模な tC18 固相抽出カートリッジを予備洗浄します。ケン化後の相分離から上相を真空または圧力でカラムにロードします。
次に、フロースルーを収集してリロードし、後続の解析のためにフロースルーを再度収集します。カラムをクロロホルム - メタノール - 水の各30ミリリットルで洗浄し、続いてメタノール - 水で洗浄する。次いで、ガングリオシドを50ミリリットルのメタノールで溶出し、次いで再び10ミリリットルのメタノールで溶出する。
各洗浄液と溶出液を別々に集める。薄層クロマトグラフィー(TLC)を使用して、ガングリオシドがフロースルーおよび洗浄から存在せず、メタノールの最初の溶出で溶出することを確認します。溶出したガングリオシドを乾燥粉末に蒸発させ、それらを計量する。
TLCを実行するには、溶剤の深さが0.5センチメートルになるように、ステンレス製のカバーを備えた10×10センチメートルのガラスTLCチャンバーに、ランニング溶剤を注ぎます。チャンバーを覆い、約10分間平衡化させます。10マイクロリットルのハミルトンシリンジをメタノールを使用して斜めの針で洗う。
1マイクロリットルのメタノールをガラスシリンジに引き込んで針のデッドボリュームを満たし、次に1マイクロリットルのサンプルまたは標準液を満たします。シリンジにメタノール溶媒が1マイクロリットル未満になるまで、サンプルを5ミリメートルの所定のマークされた線に均等に配置します。すべてのサンプルが見つかったら、プレートを摂氏 22 度で乾燥させます。
点着および乾燥プレートを、底端をランニング溶媒に浸漬した予め平衡化されたTLCチャンバー上に置く。溶媒前部がプレートの上部から1センチメートル以内に達するまで、実行中の溶媒が毛細管現象によってプレートを上方に前進させる。プレートの端にある溶剤の前面を取り除き、鉛筆で印を付けます。
溶媒が邪魔されずに、または穏やかな空気の流れの下で完全に蒸発するのを許してください。化学ヒュームフードに、分解されたガングリオシドの起源を持つTLCプレートを逆さまにして、フードの壁を酸スプレーから保護するために、切り取られた段ボール箱に入れます。レゾルシノールスプレー試薬をガラスTLC噴霧器に入れる。
加圧窒素源に取り付け、プレートを縦横方向に斜めに軽くスプレーします。すぐに同じ寸法の清潔で乾燥したガラスカバープレートでプレートを覆い、バインダークリップでカバープレートを所定の位置に固定します。蓋をしたプレートを摂氏125度で20分間加熱します。
ガングリオシドは白い背景に対して濃い紫色に見えます。脂質染色を行うには、分解されたガングリオシド起源のTLCプレートをアニスアルデヒド染色を含むビーカーに浸漬する。ランニングフロントに2秒強沈めます。
それからそれを排水するのを許しなさい。ホットプレート上のTLCプレートを低温で加熱し、現像する。このプロトコルは、定性的および定量的測定に十分な量および純度でガングリオシドを提供する。
1マイクロリットルのTLC分解能は、レゾルシノール検出のための十分な材料を提供し、野生型および遺伝子改変マウスの主要な脳ガングリオシドをすべて解決する。調製された混合ガングリオシドは他の主要な脂質を含まないが、それらは、陰性モードでの天然精製ガングリオシドとして、または陽性様式におけるプレメチル化後のいずれかの質量分析決定に十分な純度を有する。大規模な精製には、抽出、ケン化、およびHPLC分解能が含まれ、生物学的実験およびさらなる化学的および酵素的修飾に適した精製された主要な脳ガングリオシドを提供する。
例示的なHPLCプロファイルおよびその後のTLC分析が示されている。アルカリ処理、またはケン化は、汚染リン脂質を加水分解および除去するために必要であるが、O-アセチル化シアル酸などのガングリオシドの天然修飾も加水分解するものであり、これはいくつかの文脈において重要であり得る。抽出、溶媒分配、TLC 分解能の正確な溶媒比は、回収率、純度、および分析を強化するために不可欠です。
がんから代謝、脳機能まで、ガングリオシドは生理学的調節剤および治療標的である。ガングリオシドの単離、精製、および分析は、生物医学的発見および治療開発の礎石です。
