この作業は、5R01NS051305-14および5R01NS076980-08をPJSに付与するNIHによって支援されました。

1. 実験準備
<ol><li>彼らは男性と女性のハエを分離し、バイアルに閉じるようにハエを収集します。 注:睡眠実験は、一般的に雌のハエで行われます。処女女性を収集することが重要です。嵌合雌は、データの分析を複雑にする幼虫に孵化する卵を産む。</li>
	<li><20のグループで単一のセックスの家のハエ。 注:社会的に豊かな環境(>50のグループ)での住宅ハエは、睡眠ドライブ6、13リバウンド睡眠の潜在的に交わる測定値を調節します。さらに、社会的な豊かさに続いて、睡眠は数日で減少します 6.したがって、ベースライン睡眠は、リバウンド睡眠の分析を複雑にする安定ではない。<20のグループでハエを維持することは、この潜在的な混乱を回避します。</li>
	<li>光と湿度制御された環境で3〜5日間バイアルにハエを入れておいてください。 注意:ハエの年齢と成熟度は睡眠に強く影響を与えます。睡眠は1日齢のハエで高く、4歳の3〜5日で安定します。ハエは通常12時間の光で維持されます:湿度50%で12時間の暗いスケジュール。</li>
</ol>2. 睡眠記録用チューブの準備
メモ:睡眠は運動活動モニターを使用して監視されます。モニターは5つのmmの直径の管の個々に収容される32のハエを収容できる。典型的には、遺伝子型は16または32ハエのグループで分析される。
<ol><li>一方の端にフライフードでチューブの適切な数を準備します。 注意:食事と代謝は睡眠33、34に影響することが知られているので、彼らが飼育されたのと同じ食べ物にハエを置くことを特に重要です。</li>
	<li>チューブの端をワックスで密封します。 注:睡眠不足とリバウンドは5日間の実験であり、適切に密封しないと食べ物が乾燥する可能性があります。適切に密閉されたチューブでは、食品を10日以上維持することができる。したがって、チューブの端部がうまく密閉されていることを確認することが重要です。しかし、ハエは濡れた食べ物にこだわることもあります。したがって、実験開始の1〜2日前にチューブを作るのに役立ちます。</li>
	<li>個別にウェイクを配置し、アスピレーターを使用して睡眠記録のための65ミリメートルの長いガラス管にハエを振る舞い、泡ストッパーでチューブの端を差し込みます。 注:ハエを睡眠記録のためにチューブに入れると、ハエはCO2 麻酔に再び曝されることはありません。吸引器は、一端をチーズクロスで覆ったゴムチューブから作られ、1 mLピペットチップに挿入されます。</li>
</ol>3. 睡眠の記録
<ol><li>睡眠を監視するために活動モニターにチューブでハエをロードします。 注意:スナップ岩は-60°から+60°から~10 sごとに前後に監視します。モニターは~5.9sの-60°で保持されています。モニターを保持しているトレイが-60°から+60°に移動し、〜1 sが+60°から-60°に戻るには〜2.9 sかかります。サイクル長は、モータに供給される電圧を調整することで、必要に応じて変更できます。<ol>
<li>チューブが正しい向きのアクティビティモニタに配置されていることを確認するように注意してください。正しい向きで、食べ物とチューブの端は、ハエが食品に押し込まないようにスナップの上部にあります。また、食べ物との終わりは睡眠記録のジャッキとモニターの側にある。これにより、アクティビティモニタをSNAPで正しく向け、同時に活動を監視しながら効率的な睡眠不足を実現できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>活動モニターを記録室に設置し、睡眠を監視します。</li>
	<li>ベースラインスリープを推定するために、少なくとも2日間の睡眠を監視します。 注:ハエがアクティビティモニターにロードされる日は、通常、ハエがチューブに収容されることに適応できるように適応日として除外されます。ベースライン睡眠は、ハエがロードされた日の翌朝から始まる少なくとも2日間(48時間)記録されます。</li>
	<li>アクティビティ記録ソフトウェア(例えば、午前8時から午前8時まで)を使用して、特定の日のライトの時間から前日のライトまでの1分のビンのハエの運動活動数を保存します。</li>
	<li>睡眠の発作のしきい値として5分の非活動を使用してカスタムマクロを使用して運動活動データから睡眠を推定する35. 注: 睡眠メトリックの数は、運動活動カウントから計算されます。これらは、24時間以上のmin /hで睡眠、24時間の合計睡眠時間、平均および最大昼時間と夜間睡眠の長さ36が含まれます。</li>
</ol>4. 睡眠不足と回復
<ol><li>ハエは可変長の時間(例えば、12時間、24時間および36時間)のために睡眠を奪われ得、回復睡眠はまた、様々な間隔(例えば、6時間、12時間、24時間および48時間)で評価することができ、実験的必要性によって回復の持続時間を決定する。睡眠回復は、睡眠の利得/損失プロットを使用して、または所定の間隔(例えば、6時間)にわたって回復した睡眠率を調べることによって視覚化することができます。</li>
	<li>2つのベースライン日にわたって睡眠が安定している場合は、3日目に、活動モニターをSNAPに入れ、一晩の睡眠不足を引き起こします。 注:ハエは睡眠時間8、32、37、38の範囲にわたって堅牢な睡眠リバウンドを示しますが、睡眠は確実にリバウンド睡眠を評価するために安定している必要があります。ベースライン日数間の睡眠の差が100分±場合、睡眠は安定している。</li>
	<li>モニタホルダーピン、モニタコードを接続し、背面にフードを付けて最後に正しく向き、前面にプラスチックバリアを配置して、アクティビティモニタが所定の位置に固定されていることを確認します(図1)。 注:スナップは、カムが10 s(図1)に1回回転するように設計されています。プラスチック製のインサートは、装置が「上」の位置にあるときにチューブを押し戻すことによってチューブをリセットします。チューブをリセットすることは、すべてのチューブが各サイクルの開始時に全範囲の運動を持つことを保証するために重要です。</li>
	<li>アクティビティモニタを抜き、一晩の睡眠不足の後のライトの上にすぐにSNAPからモニターを取り出します。 注:睡眠不足を終了し、ハエは一晩の睡眠不足の12時間後のライトの直後に回復に置かれることが重要です。ハエを回復に入れるのに20〜30分の遅延でさえ、リバウンド睡眠の範囲を妨げる可能性があります。</li>
	<li>ハエを記録室に置き、回復睡眠を監視するために2日間(48時間)邪魔されません。 注:記録室が他の実験に使用されている場合は、ハエの回復を刺激しないように細心の注意を払う必要があります。</li>
	<li>睡眠不足の量を計算します。個々のフライごとに、睡眠不足時に得られた睡眠とベースライン中の対応する時間の間の毎時差を計算します。時間ごとの差を合計して、失われた合計睡眠を計算します。</li>
	<li>回復した睡眠の量を計算します。個々のフライごとに、回復中に得られた睡眠とベースライン中の対応する時間の時間ごとの差を計算します。得られた合計睡眠を計算するために、毎時の差を合計します。 注:ハエが実際に睡眠不足であるかどうかは経験的です。したがって、実験者は睡眠不足率を調べる必要があります。フライが十分な睡眠量を失っていない場合は、分析から除外することができます。これは他の睡眠不足のアプローチに必要な場合がありますが、SNAPに必要なことはほとんどありません。より一般的には、睡眠不足が開始される前に、所定のハエで睡眠が安定しない場合があります。睡眠が安定していない場合、恒常性は計算できません。睡眠不足の開始前 ±に計算された睡眠の最大100分の最大差を包含の候補として受け入れます。時折、個々のハエの睡眠は24時間の日に不均一に分配されます(例えば、一部の個人は日中に睡眠クォータの60〜70%を得ることができ、夜間に12時間奪われたときに24時間の睡眠クォータのごく一部しか失わないかもしれません)。これらのハエは別々に評価することができます。</li>
	<li>各遺伝子型の回復期間の12時間、24時間、48時間にわたって(ベースラインに対して)回復された睡眠の平均割合を計算します。</li>
	<li>睡眠データから、ベースラインの平均および最大の昼間の睡眠の長さと、各遺伝子型の回復日数を計算します。 注:ハエのリバウンド睡眠は、睡眠量の増加と回復日の睡眠深さの増加によって特徴付けられる。睡眠の深さの尺度として睡眠の統合が使用されます。覚醒閾値は、睡眠深さの尺度としても使用できます。</li>
</ol>

<ol>
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Probing arousal to better understand sleep defects in Drosophila.</a> Scientific Reports. 5, 8454 (2015).</li><li>Huber, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+homeostasis+in+Drosophila+melanogaster.">Sleep homeostasis in Drosophila melanogaster.</a> Sleep. 27 (4), 628-639 (2004).</li><li>Klose, M., Shaw, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep-drive+reprograms+clock+neuronal+identity+through+CREB-binding+protein+induced+PDFR+expression.">Sleep-drive reprograms clock neuronal identity through CREB-binding protein induced PDFR expression.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Dissel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+restores+behavioral+plasticity+to+Drosophila+mutants.">Sleep restores behavioral plasticity to Drosophila mutants.</a> Current Biology. 25 (10), 1270-1281 (2015).</li><li>Gerstner, J. R., Vanderheyden, W. M., Shaw, P. J., Landry, C. F., Yin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty-acid+binding+proteins+modulate+sleep+and+enhance+long-term+memory+consolidation+in+Drosophila.">Fatty-acid binding proteins modulate sleep and enhance long-term memory consolidation in Drosophila.</a> PLoS One. 6 (1), 15890 (2011).</li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

ショウジョウバエの睡眠は、2000年に独立して特徴づけられ、2つのグループ4、5によって特徴付けられていた。これらの先駆的な研究では、ハエは穏やかな取り扱い(すなわち、手の剥奪)によって睡眠を奪われ、一晩の睡眠不足に対する堅牢なホメオスタティック応答を示すことが示された。重要なことに、睡眠不足の実験では、動物を目覚めさせるために使用される方法の潜在的な交位効果を制御することが重要です。手の剥奪研究は、ハエを奪う睡眠の最小限の破壊的な手段としてハエホメオスタシスの研究のためのベンチマークを設定します。SNAPは、夜間の睡眠の>98%の睡眠のハエを効率的に奪い、重要なことに、手の剥奪4、7で得られたものと同等の睡眠リバウンドを誘発する。
ハエの睡眠を定義する基礎的研究以来、高スループットの方法でハエの睡眠恒常性を評価するための多くの方法が開発されています7,9,39,40,41.我々は、ハエの睡眠に関する約250の論文を調査し、睡眠調節または機能を評価するために睡眠不足を使用して報告されたこれらの公表された記事の約46%を発見した(表1)。多くの異なる方法が効果的にハエの睡眠リバウンドを誘発した。興味深いことに、睡眠のリバウンドを評価した研究のうち、睡眠不足と睡眠リバウンドに使用されるプロトコルは異なった。具体的には、睡眠不足の持続時間(表2)とリバウンド評価を行った期間(表1)の両方が大きく変動し、異なるプロトコルで得られた結果の比較を複雑にする可能性がある。ハエの睡眠リバウンドは、睡眠不足5後に最大48時間持続することが知られている。したがって、ホメオスタシスに対する睡眠操作の影響を十分に説明することは、48時間の回復期間にわたって恒常性リバウンドが評価される場合に最も良いと考えています。
日中にハエの睡眠を奪うことは、一貫して睡眠ドライブ4を増加させることはできないことに注意することが重要です。したがって、ライトオンで24時間睡眠剥奪プロトコルを開始し、翌日まで続けることは、ライトオフから始まる12時間の睡眠剥奪プロトコルと比較して、回復睡眠をさらに強化しません。実際には, 計算された睡眠のリバウンドは、夜間の睡眠に加えて非恒脈的に調節された昼間の睡眠を含むため、低い可能性があります。.昼間の睡眠不足がホメオスタティックリバウンドを誘発しないという観察は、しかし、睡眠剥奪の方法の潜在的な交和効果を制御するために使用することができる。したがって、SNAPで一晩奪われたハエ睡眠は、昼間7で同等の刺激を受けるハエと比較される。
総睡眠不足に使用されることに加えて、刺激の頻度を変更することによって、SNAPは慢性的に睡眠を制限し、断片化するために使用することができます7,42,したがって、ヒトの慢性的な睡眠喪失の状態を模倣.また、周波数を増加させるステップで刺激を送達することにより、SNAPを用いて覚醒閾値8を測定することもできる。したがって、SNAPは、ハエの睡眠を効果的に奪い、制限し、恒食応答を評価し、他の睡眠特性を測定するための簡単な方法です。
SNAPは標準的な実験室のフライインキュベーターに収まるが、間違いなく実験の一部ではないインキュベーターのハエを邪魔する。幸いなことに、SNAPは、他の進行中の実験を妨げることなく、ハエを奪って眠るために孤立した場所に置くことができます。回復睡眠は壊れやすいので、回復睡眠が静かな場所で行われることを確認するために注意する必要があります。
睡眠不足の補完研究, 遺伝的および薬理学的ツールは、ハエの睡眠を強化するために開発されました8,43,44.したがって、睡眠を双方向に容易に調節する能力は、睡眠調節および機能に関する深い洞察を提供し続けるフライ睡眠研究を可能にする。

睡眠は動物では普遍的に近いが、その機能は不明のままである。睡眠恒常性は、睡眠不足後の睡眠の代償的増加、睡眠の定義性の特性であり、多くの動物1、2、3、4、5の睡眠状態を特徴付けるために使用されてきた。
ハエの睡眠は、睡眠喪失4、5に対する堅牢な恒育応答を含む、人間の睡眠と多くの類似点を有する。ハエの睡眠に関する数多くの研究は、睡眠不足を使用して、延長覚覚から生じる有害な結果を調べることによって睡眠機能を推測し、睡眠の恒食調節を制御する神経生物学的メカニズムを決定することによって睡眠調節を理解してきた。したがって、睡眠不足のハエは、学習と記憶6、7、8、9、10、11、12、構造可塑性13、14、15、視覚注意16、神経損傷17、18、交配および攻撃的な行動19、交配および攻撃的な行動の障害を示すことが示された。20、細胞増殖21、及び酸化ストレス22に対する応答を、23に挙げ、いくつか挙げる。さらに、リバウンド睡眠を制御する神経生物学的メカニズムの調査は、睡眠ホメオスタット8、9、23、24、25、26、27、28、29を構成する神経機構に関する重要な洞察を生み出した。 .最後に、健康な動物の睡眠機能に関する基本的な洞察を明らかにすることに加えて、睡眠不足の研究はまた、病気の状態で睡眠機能に関する洞察を知らせた30、31。
睡眠不足は間違いなく強力なツールですが、睡眠不足実験では、動物を目覚めさせるために使用される刺激によって誘発されるものと、拡張覚醒から生じる表記型を区別することが重要です。手の剥奪または穏やかな取り扱いによる睡眠不足は、一般的に、最小限の破壊的な睡眠剥奪のための標準を設定すると考えられている。ここでは、睡眠無効装置(SNAP)を使用してハエを奪う睡眠プロトコルについて説明します。SNAPは、10年代ごとにハエに機械的刺激を与え、負のジオタキシスを誘発してハエを目覚めさせる装置です(図1)。SNAPは、高い睡眠駆動8、32を持つハエであっても、夜間の睡眠の>98%のハエを効率的に奪う。SNAPは強打敏感なハエで較正されており、SNAP内のハエの攪拌はハエに害を与えません。SNAPによる睡眠不足は、手の剥奪によって得られたものと同等のリバウンドを誘発する7.SNAPは、したがって、覚醒刺激の影響を制御しながら、ハエを奪う睡眠を取る堅牢な方法です。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Locomotor activity tubes&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisher Tissue Prep Wax</td><td>Thermo Fisher</td><td>13404-122</td><td>Wax used for sealing tubes</td></tr><tr><td>Glass tubes</td><td>Wale Apparatus</td><td>244050</td><td>We cut 5mm diameter Pyrex glass&amp;nbsp;tubes into 65mm long tubes&amp;nbsp;to record sleep. Pre-cut tubes&amp;nbsp;can also be purchased.</td></tr><tr><td>Nutri Fly Bloomington Formulation fly food</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-113</td><td>Labs might use their own fly food recipe. It is important that sleep be recorded on the same food that flies were reared in.</td></tr><tr><td>Rotary glass cutting tool</td><td>Dremel Multi Pro</td><td>395</td><td>Used to cut 65mm long glass tubes&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Monitoring Sleep&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAM System and DAMFileScan software</td><td>Trikinetics</td><td></td><td>Software used to acquire data from DAM monitors and save the acquired data in an appropriate format</td></tr><tr><td>Data acquisition computer</td><td>Lenovo</td><td>Idea Centre AIO3</td><td>A equivalent computer from any manufacturer can substitute</td></tr><tr><td>Drosophila Activity Monitors</td><td>Trikinetics</td><td>DAM2</td><td>These monitors are used to record flies&#039; locomotor activity</td></tr><tr><td>Environment Monitor</td><td>Trikinetics</td><td>DEnM</td><td>Not essential, but an easy way to monitor environmental conditions in the chamber where sleep is recorded</td></tr><tr><td>Light Controller</td><td>Trikinetics</td><td>LC4</td><td>A convenient way to control the timing of when the SNAP is turned on and off</td></tr><tr><td>Power Supply Interface Unit for DAM</td><td>Trikinetics</td><td>PSIU-9</td><td>Required for data acquisition computers to record Trikinetics locomotor acitvity data</td></tr><tr><td>RJ11 connector</td><td>7001-64PC</td><td>Multicomp</td><td>DAM monitors accept RJ11 jacks</td></tr><tr><td>Splitters</td><td>Trikinetics</td><td>SPLT5</td><td>Used to connect upto 5 DAM monitors</td></tr><tr><td>Telephone cable wire</td><td>Radioshack</td><td>278-367</td><td>Phone cables to acquire data from DAM monitors</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sleep Deprivation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Power supply</td><td>Gw INSTEK</td><td>GPS-30300</td><td>Power supply for the SNAP</td></tr><tr><td>Sleep Nullifying Apparatus</td><td>Washington University School of Medicine machine shop</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

the sleep nullifying apparatus: a highly efficient method of sleep depriving drosophila

睡眠恒常性は、睡眠喪失後に観察される睡眠の増加であり、動物界全体の睡眠を識別するために使用される定義基準の1つである。その結果、睡眠不足と睡眠制限は、睡眠機能に関する洞察を提供するために一般的に使用される強力なツールです。しかし、睡眠不足の実験は、剥奪刺激自体が生理学と行動の観察された変化の原因である可能性があるという点で本質的に問題です。したがって、成功した睡眠不足技術は、動物を目覚めさせ、理想的には、意図しない結果を多数誘発することなく、堅牢な睡眠リバウンドをもたらすべきである。ここでは、ショ ウジョウバエのメラノガスターの睡眠剥奪技術について説明します。睡眠の無効化装置(SNAP)は否定的なジオタキシスを誘発するために10年代ごとに刺激を与える。刺激は予測可能であるが、SNAPは効果的に高い睡眠駆動を持つハエでも夜間睡眠の>95%を防ぐ。重要なことに、その後の恒恒動応答は、手による剥奪を用いて達成された応答と非常によく似ている。刺激のタイミングと間隔は睡眠喪失を最小限に抑え、刺激が生理学や行動に及ぼす非特異的な影響を調べるために変更することができる。また、睡眠制限や覚醒閾値の評価にも使用できます。SNAPは、睡眠機能をよりよく理解するために使用できる強力な睡眠破壊技術です。

広州S(Cs)は野生型株として使用した。ハエは12時間の光で維持された:12時間暗いスケジュール、そして睡眠は一晩で12時間奪われた。ベースライン日(bs)、睡眠剥奪日(sd)、および2つの回復日(rec1およびrec2)の睡眠プロファイルの検査は、ハエがSNAPで効果的に睡眠を奪われ、文献4、5で観察された報告と一致して日中に睡眠を回復したことを示唆している。ハエを起こしておく際のSNAPの効果は、睡眠不足時にハエが示す高い活動(300〜350カウント/h)にも見られます(図2B)。実際、睡眠不足時のハエの活動数を監視することは、剥奪プロトコルの有効性および/または睡眠ドライブの間接的な尺度の有用なバロメーターとなり得る。睡眠不足が効果がない場合、ハエは剥奪の期間中ほど活発ではありません。高い睡眠駆動下にあるハエは、各刺激の後すぐに眠りに落ち、35ほどチューブを横断しない。装置の傾きの角度と落下速度の両方が、ハエが効果的に目を覚まし続けることを保証するために重要です。各ラボでは、ばね(図1B)、カムのサイズと形状(図1Cと図1D、右)を調整することで、角度と速度を最適化できます。
睡眠不足と回復の有効性を定量的に推定するために、剥奪中に失われた睡眠を回復日に取り戻し、個々のフライごとに計算した(図2C)。重要なのは、欠乏日とベースライン日( 図2Cの0-12時間を参照)の間で、これらのハエでは睡眠が安定していることを示すベースライン睡眠に有意な変化はなかった。この12時間の間に睡眠の大きな違い(例えば、100分±)は、睡眠が安定していなかったことを示唆するであろう。SNAPは事実上、夜間の睡眠の98%>のハエを奪った。ハエは最初の12時間で睡眠の20%を回復し、以前に報告されたように、夜間に追加の睡眠を回復しませんでした。しかし、翌日、ハエは睡眠を回復し始め、48時間の回復を超えて睡眠の36%を回復した(図2D)。48時間を超える30〜40%の回復睡眠は、SNAPを使用して奪われた野生型ハエ睡眠にはかなり典型的です。
睡眠恒常性は、睡眠時間の増加と、剥奪後の回復期間中の睡眠深さの増加の両方によって特徴付けられる。昼間の睡眠の統合は、一般的に睡眠の深さの読み取りとして使用されます。睡眠の統合は、1 日の平均睡眠時間として評価できます (図 2E)。しかし、回復中に睡眠圧が消散するにつれて、日が進むにつれて平均睡眠時間が短縮されます。したがって、より機密性の高いメトリックを提供できる最大睡眠時間の変化も調べることもしばしば役に立ちます(図 2F)。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>睡眠剥奪の方法</td>
			<td>論文の総数</td>
			<td>% 論文 /テクニック</td>
			<td>平均回復評価</td>
		</tr>
<tr>
<td>スナップ</td>
			<td>52</td>
			<td>37.14%</td>
			<td>33 ± 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>ボルテクサー/ランダム揺れ</td>
			<td>49</td>
			<td>35.00%</td>
			<td>18 ± 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>手の剥奪</td>
			<td>9</td>
			<td>6.43%</td>
			<td>36 ± 11</td>
		</tr>
<tr>
<td>熱遺伝学SD</td>
			<td>15</td>
			<td>10.71%</td>
			<td>36 ± 12</td>
		</tr>
<tr>
<td>未指定</td>
			<td>15</td>
			<td>10.71%</td>
			<td>29 ± 10</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:文献で使用される睡眠不足の異なる方法の調査。 睡眠不足を使用した論文はわずか116/254件でした。各方法を使用する論文の数 = 「論文の総数」。各方法を用いた論文の割合= "%論文/技法"。各方法について評価された平均回復の長さ = "平均回復評価"。SD - 睡眠不足。スナップ - スリープ無効装置
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>SD の長さ</td>
			<td>総研究</td>
		</tr>
<tr>
<td>< 6 時間</td>
			<td>12</td>
		</tr>
<tr>
<td>6時間</td>
			<td>23</td>
		</tr>
<tr>
<td>>6 h &< 12時間</td>
			<td>17</td>
		</tr>
<tr>
<td>12時間</td>
			<td>69</td>
		</tr>
<tr>
<td>>12時間&<24時間</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td>24時間</td>
			<td>19</td>
		</tr>
<tr>
<td>> 24時間</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td>慢性SD</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>任意の SD</td>
			<td>160</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2.異なる研究で行われる睡眠不足の長さ. SD - 睡眠不足
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62105/62105fig01.jpg"> 図 1.睡眠を無効にするアパラタス(スナップ)。)装置の正面図。SNAP は、8 つのアクティビティー・モニターを 2 行に収めることができます。ホルダーピンは、モニターを所定の位置に拘束します。脚は、装置を正しい向きに合わせて調整できます。 B)装置を前後に揺らすモーターとスプリングのクローズアップビュー。モーターは、装置を「上」の位置に傾けるカムを回し、スプリングを圧縮します。圧縮からのばねの解放は装置を「下」の位置に戻す。 C)左 -"下"位置にある装置の側面図。ホルダーピンはモニターを拘束します。モニタコードスロットは、モニタコードが所定の位置に保持されていることを保証します。パッドは、装置が「ダウン」位置にスナップする衝撃を緩和するのに役立ちます。右 - カムのクローズアップを閉じます。 D)「上」位置の装置の左側図。右 - カムの反時計回りの回転は、装置を「上」位置に傾けます。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/62105/62105fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62105/62105fig02.jpg"> 図 2.実験結果。A)実験の4日間のCsの睡眠プロットは、ベースライン日(bs)、睡眠剥奪日(sd)、および2日間の回復(rec1およびrec2)を飛ぶ。B)睡眠不足の日のハエの平均運動活動数。ハエは12-24時間から睡眠を奪われた。C)睡眠不足と回復の時間経過。Csハエは12時間から24時間から睡眠を奪われ、24時間から72時間まで回復させた。SNAPは事実上、48時間にわたって部分的に回復した>98%の睡眠(n=12ハエ、時間の反復対策ANOVA、F[70,1470]=12.97、p<10-15)のハエを効果的に奪った。 D)48時間にわたって回復した睡眠率。ハエは12時間にわたって睡眠の20%を回復し、睡眠の約36%が48時間を超えて回復した。スリープは、ベースライン (p <0.05、t-test) と比較して、最初の回復日により統合されます。F)1 日の最大睡眠時間で測定した実験の各日の睡眠の統合。スリープは、ベースライン (p <0.05、t-test) と比較して、最初の回復日により統合されます。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/62105/62105fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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The Sleep Nullifying Apparatus: A Highly Efficient Method of Sleep Depriving Drosophila

睡眠不足は、睡眠機能と調節を調査するための強力なツールです。我々は、睡眠排便装置を使用して ショウジョウバエ を奪い、剥奪によって誘発されるリバウンド睡眠の程度を決定するプロトコルを記述する。

睡眠の無効化装置:ショウジョウバエを奪う睡眠の非常に効率的な方法

Sleep homeostasis, the increase in sleep observed following sleep loss, is one of the defining criteria used to identify sleep throughout the animal ...

the-sleep-nullifying-apparatus-highly-efficient-method-sleep

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Sleep Nullifying Apparatus: A Highly Efficient Method of Sleep Depriving Drosophila

3.4K ビュー.  Washington University School of Medicine. 睡眠不足は、睡眠機能と調節を調査するための強力なツールです。我々は、睡眠排便装置を使用して ショウジョウバエ を奪い、剥奪によって誘発されるリバウンド睡眠の程度を決定するプロトコルを記述する。

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Novel Apparatus and Method for Drug Reinforcement

Animal models of reinforcement have proven to be useful for understanding the neurobiological mechanisms underlying drug addiction. Operant drug self-administration and conditioned place preference (CPP) procedures are expansively used in animal research to model various components of drug reinforcement, consumption, and addiction in humans. For this study, we used a novel approach to studying drug reinforcement in rats by combining traditional CPP and self-administration methodologies. We assembled an apparatus using two Med Associate operant chambers, sensory stimuli, and a Plexiglas-constructed neutral zone. These modifications allowed our experiments to encompass motivational aspects of drug intake through self-administration and drug-free assessment of drug/cue conditioning strength with the CPP test. In our experiments, rats self-administered cocaine (0.75 mg/kg/inj, i.v.) during either four (e.g., the "short-term") or eight (e.g., the "long-term") alternating-day sessions in an operant environment containing distinctive sensory cues (e.g., olfactory and visual). On the alternate days, in the other (differently-cued) operant environment, saline was available for self-infusion (0.1 ml, i.v.). Twenty-four hours after the last self-administration/cue-pairing session, a CPP test was conducted. Consistent with typical CPP findings, there was a significant preference for the chamber associated with cocaine self-administration. In addition, in animals undergoing the long-term experiment, a significant positive correlation between CPP magnitude and the number of cocaine-reinforced lever responses. In conclusion, this apparatus and approach is time and cost effective, can be used to examine a wide array of topics pertaining to drug abuse, and provides more flexibility in experimental design than CPP or self-administration methods alone.

Operant drug self-administration and conditioned place preference (CPP) procedures are expansively used in research to model various components of drug reinforcement, consumption, and addiction in humans. In this report, we combined traditional CPP and self-administration methods as a novel approach to studying drug reinforcement and addiction in rats.

薬物の強化のための新規装置および方法

Animal models of reinforcement have proven to be useful for understanding the neurobiological mechanisms underlying drug addiction.  Operant drug ...

神経科学

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) pacemakers or clocks. Malfunctions in the human circadian system are associated with numerous diseases or disorders. Much progress towards our understanding of the mechanisms underlying circadian rhythms has emerged from genetic screens whereby an easily measured behavioral rhythm is used as a read-out of clock function. Studies using Drosophila have made seminal contributions to our understanding of the cellular and biochemical bases underlying circadian rhythms. The standard circadian behavioral read-out measured in Drosophila is locomotor activity. In general, the monitoring system involves specially designed devices that can measure the locomotor movement of Drosophila. These devices are housed in environmentally controlled incubators located in a darkroom and are based on using the interruption of a beam of infrared light to record the locomotor activity of individual flies contained inside small tubes. When measured over many days, Drosophila exhibit daily cycles of activity and inactivity, a behavioral rhythm that is governed by the animal's endogenous circadian system. The overall procedure has been simplified with the advent of commercially available locomotor activity monitoring devices and the development of software programs for data analysis. We use the system from Trikinetics Inc., which is the procedure described here and is currently the most popular system used worldwide. More recently, the same monitoring devices have been used to study sleep behavior in Drosophila. Because the daily wake-sleep cycles of many flies can be measured simultaneously and only 1 to 2 weeks worth of continuous locomotor activity data is usually sufficient, this system is ideal for large-scale screens to identify Drosophila manifesting altered circadian or sleep properties.

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

We describe procedures for recording daily locomotor activity rhythms of Drosophila and subsequent data analysis. Locomotor activity rhythms are a reliable behavioral output of animal circadian clocks and are used as the standard readout of clock function when studying circadian mutants or examining how the environment regulates the circadian system.

に概日リズムと睡眠のパラメータを研究するために運動活性を測定するショウジョウバエ</em

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of the breadth of molecular regulation. Newer approaches such as high-resolution RNA sequencing (RNA-Seq)1 provides new and expansive information about tissue- or state-specific expression such as relative transcript levels, alternative splicing, and micro RNAs2-4. Prospects for employing the RNA-Seq method in comparative whole transcriptome profiling5 within discrete tissues or between phenotypically distinct groups of individuals affords new avenues for elucidating molecular mechanisms involved in both normal and abnormal physiological states. Recently, whole transcriptome profiling has been performed on human brain tissue, identifying gene expression differences associated with disease progression6. However, the use of next-generation sequencing has yet to be more widely integrated into mammalian studies.
Gene expression studies in mouse models have reported distinct profiles within various brain nuclei using laser capture microscopy (LCM) for sample excision7,8. While LCM affords sample collection with single-cell and discrete brain region precision, the relatively low total RNA yields from the LCM approach can be prohibitive to RNA-Seq and other profiling approaches in mouse brain tissues and may require sub-optimal sample amplification steps. Here, a protocol is presented for microdissection and total RNA extraction from discrete mouse brain regions. Set-diameter tissue corers are used to isolate 13 tissues from 750-&mu;m serial coronal sections of an individual mouse brain. Tissue micropunch samples are immediately frozen and archived. Total RNA is obtained from the samples using magnetic bead-enabled total RNA isolation technology. Resulting RNA samples have adequate yield and quality for use in downstream expression profiling. This microdissection strategy provides a viable option to existing sample collection strategies for obtaining total RNA from discrete brain regions, opening possibilities for new gene expression discoveries.

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

RNA expression profiling of discrete mouse brain regions requires a precise and repeatable tissue collection strategy. A protocol that uses both coronal brain sectioning and tissue corer-assisted microdissection is described here. The yield and quality of total RNA obtained from the resulting samples confirms the utility of the outlined method.

トータルRNAの単離およびダウンストリーム次世代シーケンシングと遺伝子発現プロファイリングのための離散マウスの脳領域のマイクロダイセクションのための非レーザーキャプチャー顕微鏡のアプローチ

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

免疫応答やスリープ中の定量的測定<em&gt;ショウジョウバエ</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

免疫・感染学

A Fully Automated and Highly Versatile System for Testing Multi-cognitive Functions and Recording Neuronal Activities in Rodents

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be investigated in a single task sequence. The unique feature of this system is a custom-made, acoustically transparent chamber that eliminates many of the issues associated with auditory cue control in most commercially available chambers. The ease with which operant devices can be added or replaced makes this system quite versatile, allowing for the implementation of a variety of auditory, visual, and olfactory behavioral tasks. Automation of the system allows fine temporal (10 ms) control and precise time-stamping of each event in a predesigned behavioral sequence. When combined with a multi-channel electrophysiology recording system, multiple cognitive brain functions, such as motivation, attention, decision-making, patience, and rewards, can be examined sequentially or independently.

In this report, we present a fully automated and highly versatile system capable of simultaneously testing multi-cognitive behaviors and recording neuronal activities for rodents.

マルチ認知機能のテストとげっ歯類の神経活動を記録するための完全に自動化された汎用性の高いシステム

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body at rest1. The function of non rapid eye movement sleep (NREMS), the largest portion of sleep by time, is uncertain. However, one salient feature of NREMS is a significant reduction in the rate of cerebral glucose utilization relative to wakefulness2-4. This and other findings have led to the widely held belief that sleep serves a function related to cerebral metabolism. Yet, the mechanisms underlying the reduction in cerebral glucose metabolism during NREMS remain to be elucidated.
	One phenomenon associated with NREMS that might impact cerebral metabolic rate is the occurrence of slow waves, oscillations at frequencies less than 4 Hz, in the electroencephalogram5,6. These slow waves detected at the level of the skull or cerebral cortical surface reflect the oscillations of underlying neurons between a depolarized/up state and a hyperpolarized/down state7. During the down state, cells do not undergo action potentials for intervals of up to several hundred milliseconds. Restoration of ionic concentration gradients subsequent to action potentials represents a significant metabolic load on the cell8; absence of action potentials during down states associated with NREMS may contribute to reduced metabolism relative to wake.
	Two technical challenges had to be addressed in order for this hypothetical relationship to be tested. First, it was necessary to measure cerebral glycolytic metabolism with a temporal resolution reflective of the dynamics of the cerebral EEG (that is, over seconds rather than minutes). To do so, we measured the concentration of lactate, the product of aerobic glycolysis, and therefore a readout of the rate of glucose metabolism in the brains of mice. Lactate was measured using a lactate oxidase based real time sensor embedded in the frontal cortex. The sensing mechanism consists of a platinum-iridium electrode surrounded by a layer of lactate oxidase molecules. Metabolism of lactate by lactate oxidase produces hydrogen peroxide, which produces a current in the platinum-iridium electrode. So a ramping up of cerebral glycolysis provides an increase in the concentration of substrate for lactate oxidase, which then is reflected in increased current at the sensing electrode. It was additionally necessary to measure these variables while manipulating the excitability of the cerebral cortex, in order to isolate this variable from other facets of NREMS.
	We devised an experimental system for simultaneous measurement of neuronal activity via the elecetroencephalogram, measurement of glycolytic flux via a lactate biosensor, and manipulation of cerebral cortical neuronal activity via optogenetic activation of pyramidal neurons. We have utilized this system to document the relationship between sleep-related electroencephalographic waveforms and the moment-to-moment dynamics of lactate concentration in the cerebral cortex. The protocol may be useful for any individual interested in studying, in freely behaving rodents, the relationship between neuronal activity measured at the electroencephalographic level and cellular energetics within the brain.

A procedure is described for manipulating the activity of cerebral cortical pyramidal neurons optogenetically while the electroencephalogram, electromyogram, and cerebral lactate concentration are monitored. Experimental recordings are performed on cable-tethered mice while they undergo spontaneous sleep/wake cycles. Optogenetic equipment is assembled in our laboratory; recording equipment is commercially available.

同時脳波、リアルタイム乳酸濃度の測定と齧歯類大脳皮質ニューロン活動のOptogeneticマニピュレーション

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

睡眠障害治療の進歩: ショウジョウバエに基づくスクリーニングアプローチ

High-Throughput Small Molecule Drug Screening For Age-Related Sleep Disorders Using Drosophila melanogaster

Sleep, an essential component of health and overall well-being, often presents challenges for older individuals who frequently experience sleep disorders characterized by shortened sleep duration and fragmented patterns. These sleep disruptions also correlate with an increased risk of various illnesses in the elderly, including diabetes, cardiovascular diseases, and psychological disorders. Unfortunately, existing drugs for sleep disorders are associated with significant side effects such as cognitive impairment and addiction. Consequently, the development of new, safer, and more effective sleep disorder medications is urgently needed. However, the high cost and lengthy experimental duration of current drug screening methods remain limiting factors.
This protocol describes a cost-effective and high-throughput screening method that utilizes Drosophila melanogaster, a species with a highly conserved sleep regulation mechanism compared to mammals, making it an ideal model for studying sleep disorders in the elderly. By administering various small compounds to aged flies, we can assess their effects on sleep disorders. The sleep behaviors of these flies are recorded using an infrared monitoring device and analyzed with the open-source data package Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program 2020 (SCAMP2020). This protocol offers a low-cost, reproducible, and efficient screening approach for sleep regulation. Fruit flies, due to their short life cycle, low husbandry cost, and ease of handling, serve as excellent subjects for this method. As an illustration, Reserpine, one of the tested drugs, demonstrated the ability to promote sleep duration in elderly flies, highlighting the effectiveness of this protocol.

著者スポットライト:DAMシステムを使用したショウジョウバエの睡眠測定における課題の克服 

Presented is a protocol for high-throughput drug screening to improve sleep by monitoring the sleep behavior of fruit flies in an elderly Drosophila model.

ショウジョウバエによる加齢性睡眠障害のハイスループット低分子薬物スクリーニング(英語)

Sleep, an essential component of health and overall well-being, often presents challenges for older individuals who frequently experience sleep disorders ...

行動学

A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat

Afferent signaling via the vagus nerve transmits important general visceral information to the central nervous system from many diverse receptors located in the organs of the abdomen and thorax. The vagus nerve communicates information from stimuli such as heart rate, blood pressure, bronchopulmonary irritation, and gastrointestinal distension to the nucleus of solitary tract of the medulla. The cell bodies of the vagus nerve are located in the nodose and petrosal ganglia, of which the majority are located in the former. The nodose ganglia contain a wealth of receptors for amino acids, monoamines, neuropeptides, and other neurochemicals that can modify afferent vagus nerve activity. Modifying vagal afferents through systemic peripheral drug treatments targeted at the receptors on nodose ganglia has the potential of treating diseases such as sleep apnea, gastroesophageal reflux disease, or chronic cough. The protocol here describes a method of injection neurochemicals directly into the nodose ganglion. Injecting neurochemicals directly into the nodose ganglia allows study of effects solely on cell bodies that modulate afferent nerve activity, and prevents the complication of involving the central nervous system as seen in systemic neurochemical treatment. Using readily available and inexpensive equipment, intranodose ganglia injections are easily done in anesthetized Sprague-Dawley rats.

Afferent vagal signaling transmits important information to central nervous system from receptors located in organs of the abdomen and thorax. The nodose ganglia of vagus nerves contain many types of receptors that modulate vagal activity. This protocol describes a method of local injections of neurochemicals into the nodose ganglia.

スプラーグ - ドーリーラットのメソッド節状神経節の注入

Afferent signaling via the vagus nerve transmits important general visceral information to the central nervous system from many diverse receptors located ...

睡眠の無効化装置:ショウジョウバエを奪う睡眠の非常に効率的な方法

要約

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薬物の強化のための新規装置および方法

に概日リズムと睡眠のパラメータを研究するために運動活性を測定するショウジョウバエ

トータルRNAの単離およびダウンストリーム次世代シーケンシングと遺伝子発現プロファイリングのための離散マウスの脳領域のマイクロダイセクションのための非レーザーキャプチャー顕微鏡のアプローチ

免疫応答やスリープ中の定量的測定

マルチ認知機能のテストとげっ歯類の神経活動を記録するための完全に自動化された汎用性の高いシステム

同時脳波、リアルタイム乳酸濃度の測定と齧歯類大脳皮質ニューロン活動のOptogeneticマニピュレーション

ショウジョウバエによる加齢性睡眠障害のハイスループット低分子薬物スクリーニング(英語)

ショウジョウバエによる加齢性睡眠障害のハイスループット低分子薬物スクリーニング(英語)

ショウジョウバエによる加齢性睡眠障害のハイスループット低分子薬物スクリーニング(英語)

スプラーグ - ドーリーラットのメソッド節状神経節の注入