リグニンは、3つのモノリニョールから構成される複合ヘテロポリマーです。これは、セルロースの隣に地球上で2番目に豊富なポリマーです。ここでは、リグニン含量の推定に最も信頼性の高い方法であるチオグリコール酸法を示す。
この方法は、リグニンがチオエーテル結合を介してチオグリコール酸に結合するという原理に基づいています。さらに、このプロトコルを5つのフェーズに分けた。第1段階では、植物材料を準備します。
第2段階では、アルコール不溶性抽出物を分離する。第3段階では、チオグリコール酸および酸性条件を用いてリグニンを沈殿させます。第4段階では、工業用竹リグニンを用いてリグニン標準曲線を調製する。
最後に、第5段階では、第4段階で調製した標準曲線を用いてリグニン含有量を推定する。植物材料を回収し、鉢をひっくり返して根を分け、水で十分に洗浄し、2日間空気乾燥し、標識容器に移し、1週間から10日間摂氏49度でインキュベーターにインキュベーターでインキュベーターに入れ込んだ。はさみを使用して、組織をさらに1mm〜3mmサイズに切断する。
あるいはバイオマスグラインダーは、植物組織を粉砕するために使用される。根組織を使用する バイオマスグラインダーをオンにして、粉砕した粉末を事前ラベル付き容器に集めます。同様に、幹細胞組織および葉組織についても繰り返す。
粉砕された粉は、その後、冷凍工場に置かれ、3サイクルの10 CP速度の速度で冷凍工場を実行する粉砕花瓶にロードされます。20mgの粉砕組織粉末を秤量し、あらかじめ作られた2mlチューブに移す。空のチューブとチューブにティッシュパウダーと、ラボノートブックのティッシュパウダーをメモします。
60°Cで開いたキャップでチューブを1時間インキュベートします。インキュベーション後、15,000 RPMの各サンプル渦遠心分離機に1.8mlの水を10分間加えます。上清を捨て1.8mlのメタノールを加えます。
ボルテックスとインキュベートは、予熱された摂氏60度ブロックで20分間、15,000RPMで遠心分離機を10分間インキュベートした後に行う。この手順をもう一度繰り返します。遠心分離後、上清を捨て、真空乾燥機のペレットを2〜3時間、またはパレットが完全に乾燥するまで乾燥させます。
最後にリグニン含有量を推定するために、ラボノートブックの各チューブの重量を測定し、記録します。また、この時点でトリケートで0.5 mgから4 mgから始まるポジティブコントロール工業用竹リグニンが含まれます。1 mlの通常塩酸を1ml加え、各サンプルボルテックスに100マイクロリットルのグリコール酸を加え、摂氏80度で3時間インキュベートします。
3時間後にインキュベーションをラックに移し、10分間冷却します。その後、15,000 RPMで10分間遠心分離機を使用します。遠心分離後、溶液の色は次のようになります。
上清を捨てます。1mlの水を加えます。ボルテックス遠心分離機を15,000 RPMで10分間行う。
上清を捨てます。1 mlの通常の水酸化ナトリウムを加えます。渦と一晩摂氏37度シェーカーでインキュベート。
一晩インキュベーション後、チューブを15,000 RPMで10分間遠心分離する。上清を移す新鮮な前にラベル付けされた2 mlの管は上清に濃縮塩酸の200マイクロリットルを加える。ここに示すように穏やかな反転によってそれらを混ぜます。
一晩摂氏4度で冷蔵庫にインキュベートします。15,000RPMで遠心分離機を10分間インキュベーションした後。上清を捨てます。
水酸化ナトリウム1mlを加えます。室温で10~15分間、シェーカーにインキュベートします。分光光度計を使用して280ナノメートルの吸光度測定値を収集し、沈殿したリグニンが水酸化ナトリウムに溶解するので、2マイクロリットルの水酸化ナトリウムをブランクとして取る。
空白をゼロにします。同様に、サンプルについても繰り返します。ラボノートブックの吸光度測定値を収集するには、各サンプルの 2 マイクロリットルを使用します。
3 つの技術的な反復の各サンプルの 3 つの測定値を取ります。最初の列には、サンプル番号があります。第2のコラムでは、R1、R2、R3が1つの実験ラインの3つの生物学的複製を表す生物学的複製を有する。
3番目のコラムでは、280ナノメートルで得られた吸光度測定値を平均化しました。4番目の列のリグニン含有量を計算するには、式y=mx-cを使用して、xは平均OD.mであり、c値は用意された標準曲線の回帰直線からプロットされます。第5列は、メタノールと水の水の水の後の重量です。
これは、mg のリグニン含量の推定に使用される方法です。.そこで、第4列で得られた値を5列目で除算し、6列目のリグニン含有量のmg当たりの値を求める。そして、グラム細胞壁の重量を得るために、この値に1000を掛ける。
そして、リグニン含有量のパーセントは、この値を1000で割り、100を掛けることによって計算されます。最後に、リグニン含有量の違いを理解するために棒グラフの形で別の実験線の平均と比較される各実験ラインの3つの生物学的複製のリグニンを平均することによって平均リグニンを得る。また、学生のt検定を適用して、その重要性のレベルをテストすることもできます。
列Aには、市販の竹リグニンがあり、TGAの前に取られた竹リグニンの重量と、280ナノメートルのそれぞれの吸光度測定値があります。表 A のこれらの値は、列 B の散布グラフをプロットするために使用され、m と c の値を持つ回帰直線を示します。Cでは、標準曲線と工業用竹リグニン実験ライン1と2を用いて得られた値を棒グラフの形で比較し、その結果が互いに差を示した。
