シュレヤ・シャーの校正とアドバイスに感謝します。

1. ドップラーファントム準備のセットアップ (図2A)
<ol><li>蠕動ポンプ、血液模擬流体貯蔵所、パルスダンパー、ドップラーフローファントムをプラスチックチューブに接続します。</li>
	<li>直径4mmの運河を選ぶ。</li>
	<li>ポンプを0.3 sの流体720 mL/minに排出し、0.7 sで50 mL/minを排出して収縮期と拡張期心相をそれぞれ模倣するようにプログラムする</li>
	<li>ポンプを実行し、静かに潜在的な気泡を排出するためにパイプを振ります。 注:オペレータは別の運河の直径および異なったポンプ速度を選びることができるが、超音波の順序が最も速い流れの速度を得るのに十分な速さであることを保障しなければならない。Eq. 3 は後で提示され、シーケンスを設計するのに役立ちます。</li>
</ol>2. 超高速超音波スキャナーのセットアップ (図 2A)
<ol><li>超高速対応のリサーチ スキャナを、PCI Express リンクを使用してホスト コンピュータに接続します。</li>
	<li>超音波スキャナーのトランスデューサアダプタをプローブコネクタに合わせて交換し、プローブを接続します。</li>
	<li>Matlabを実行し、超音波スキャナのライセンスをアクティブにします。 注:このセクションと以下は、Verasonics Vantageシステムの使用を暗黙のうちに想定しています。</li>
</ol>3. 超音波シーケンスプログラミング
<ol><li>例のスクリプトを使用して、プローブの位置決めに使用される従来の焦点を合わせられる「Bモード」(すなわち、echography)シーケンスを設計する。<ol>
<li>撮像深さを50mmに設定します。</li>
		<li>焦点深さを35mmに設定します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>スクリプトの例を使用して、超高速超音波シーケンスを設計します。<ol>
<li>撮像深さを50mmに設定します。</li>
		<li>プログラム3は[-3,0,3]度で平面波を傾けた。</li>
		<li>パルス繰り返し周波数(PRF)を12 kHzに設定します。</li>
		<li>使用するプローブに応じて、中心周波数で、超音波波形に4半サイクルを使用してください。中心周波数は 5.2 MHz と想定されます。</li>
		<li>合計期間を 1 s に設定します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. プローブの位置決めとデータ取得
<ol><li>プローブのレンズに超音波ゲルを塗布します。</li>
	<li>プローブをファントムに置き、Bモード超音波シーケンスを起動します。</li>
	<li>興味のある運河を見つけます。流体は周囲の組織よりも暗く見えます。プローブを縦方向のビューに配置します。</li>
	<li>プローブを対象の位置に手動で維持します。</li>
	<li>Bモードシーケンスを終了し、超高速シーケンス取得スクリプトを起動します。</li>
</ol>5. 画像再構成 (図2B)
<ol><li>シーケンスが終了したら、生データ(無線周波数データ「RF」とも呼ばれる)を保存します。</li>
	<li>超音波システムのデフォルトソフトウェアを使用して画像再構築スクリプトを起動します。プロセスの最後に、IQ データマトリックスを作成する必要があります。 注:超音波エコーは、プローブの各要素と各放出/受信に記録され、RFデータマトリックスに保存されます。画像再構成は、各チャンネルに適切な遅延則を適用し、いわゆる「IQ」(位相/直交)行列を生み出した。複雑なIQマトリックスは、スペース(画像の深さと幅)と時間用の3次元を持っています</li>
</ol>6. クラッターフィルタリング (図 2C)
注: 手順 6 ~ 7 については、「 補足資料」に記載されている Matlab スクリプトを参照してください。
<ol><li>3D (空間 x 空間 x 時間) の IQ 行列を 2D (空間 x 時間) の Casorati 行列に変更します。</li>
	<li>IQrの単数分解15(Eq. 1)を計算する。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61838/61838equ01v3.jpg"> Eq. 1</li>
	<li>バランゲルら (II,D)で記述された空間的特異ベクトルU(II,D)を用いて空間類似行列Cを計算し、血液部分空間境界Nを特定する。</li>
	<li>このカットオフNを使用して、Demeneら(II,C)に記載されているIQデータをフィルタリングする。</li>
</ol>7. 流れの視覚化と速度の測定 (図 2C)
<ol><li>時間ディメンションに沿ってフィルターされたデータ IQt のエンベロープを統合することによって、パワードップラーマップPDを計算します(Eq. 2)。3D 座標 z、x、t はそれぞれ深さ、幅、時間寸法 、nt であり、取得したフレーム数です。 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61838/61838equ02v5.jpg"> Eq. 2</li>
	<li>PD マップを対数スケールで表示します。ダイナミック レンジを設定するには、運河の外側の領域で平均 PD を計算し、この値を dB でダイナミック レンジの下限として使用します。一般的なダイナミック レンジは [-30, 0] dB です。</li>
	<li>1 ~ 30 ピクセルを含む、画像上の対象となる円形領域 (ROI) を定義します。</li>
	<li>そのROIのピクセル上のIQf信号を平均して <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61838/61838equ03v2.jpg"> 、nt時間ポイントのベクトルを得る。</li>
	<li><img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/61838/61838equ04v2.jpg">短時間フーリエ変換 (STFT) の平方マグニチュードを使用して、ドップラースペクトログラムを計算して表示します。<ol>
<li>STFT ウィンドウを 60 サンプルの「Hann」ウィンドウに設定します。</li>
		<li>STFTのオーバーラップをウィンドウ長の90%に設定します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>スペクトログラムの各時点で中心周波数をオーバーレイします。</li>
	<li>ドップラー式(Eq. 3)を使用して、周波数f値を血液軸速度vzに変換します。c0は、送信された超音波波形の中心周波数(ここでは5.2MHz)の媒体とfTWの音速です。 <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/61838/61838equ05v4.jpg"> Eq. 3</li>
</ol>

<ol>
	<li>Doppler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ueber das farbige Licht der Doppelsterne und einiger anderer Gestirne des Himmels. , (2020).</li><li>Bonnefous, O., Pesqu&#233;, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+domain+formulation+of+pulse-Doppler+ultrasound+and+blood+velocity+estimation+by+cross+correlation.">Time domain formulation of pulse-Doppler ultrasound and blood velocity estimation by cross correlation.</a> Ultrasonic Imaging. 8 (2), 73-85 (2004).</li><li>Bercoff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+compound+doppler+imaging:+Providing+full+blood+flow+characterization.">Ultrafast compound doppler imaging: Providing full blood flow characterization.</a> IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 58 (1), 134-147 (2011).</li><li>Evans, D. H., Jensen, J. A., Nielsen, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasonic+colour+Doppler+imaging.">Ultrasonic colour Doppler imaging.</a> Interface Focus. 1 (4), 490-502 (2011).</li><li>Nuffer, Z., Rupasov, A., Bekal, N., Murtha, J., Bhatt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+Doppler+ultrasound+of+peripheral+arteries:+a+pictorial+review.">Spectral Doppler ultrasound of peripheral arteries: a pictorial review.</a> Clinical Imaging. 46, 91-97 (2017).</li><li>Jensen, J. A., Nikolov, S. I., Gammelmark, K. L., Pedersen, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+aperture+ultrasound+imaging.">Synthetic aperture ultrasound imaging.</a> Ultrasonics. 44, (2006).</li><li>Tong, L., Ramalli, A., Jasaityte, R., Tortoli, P., D'Hooge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-transmit+beam+forming+for+fast+cardiac+imaging-experimental+validation+and+in+vivo+application.">Multi-transmit beam forming for fast cardiac imaging-experimental validation and in vivo application.</a> IEEE Transactions on Medical Imaging. 33 (6), 1205-1219 (2014).</li><li>Tanter, M., Bercoff, J., Sandrin, L., Fink, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+compound+imaging+for+2-D+motion+vector+estimation:+application+to+transient+elastography.">Ultrafast compound imaging for 2-D motion vector estimation: application to transient elastography.</a> IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics and Frequency Control. 49 (10), 1363-1374 (2002).</li><li>Udesen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frame-rate+blood+vector+velocity+imaging+using+plane+waves:+Simulations+and+preliminary+experiments.">High frame-rate blood vector velocity imaging using plane waves: Simulations and preliminary experiments.</a> IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 55 (8), 1729-1743 (2008).</li><li>Hansen, K. L., Udesen, J., Gran, F., Jensen, J. A., Bachmann Nielsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+examples+of+flow+patterns+with+the+fast+vector+velocity+ultrasound+method.">In-vivo examples of flow patterns with the fast vector velocity ultrasound method.</a> Ultraschall in der Medizin. 30 (5), 471-477 (2009).</li><li>Tanter, M., Fink, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+imaging+in+biomedical+ultrasound.">Ultrafast imaging in biomedical ultrasound.</a> IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 61 (1), 102-119 (2014).</li><li>Montaldo, G., Tanter, M., Bercoff, J., Benech, N., Fink, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coherent+plane-wave+compounding+for+very+high+frame+rate+ultrasonography+and+transient+elastography.">Coherent plane-wave compounding for very high frame rate ultrasonography and transient elastography.</a> IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics and Frequency Control. 56 (3), 489-506 (2009).</li><li>Papadacci, C., Pernot, M., Couade, M., Fink, M., Tanter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-contrast+ultrafast+imaging+of+the+heart.">High-contrast ultrafast imaging of the heart.</a> IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 61 (2), 288-301 (2014).</li><li>Maresca, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+Imaging+of+the+Coronary+Vasculature+Using+Ultrafast+Ultrasound.">Noninvasive Imaging of the Coronary Vasculature Using Ultrafast Ultrasound.</a> JACC: Cardiovascular Imaging. 11 (6), 798-808 (2018).</li><li>Demen&#233;, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Clutter+Filtering+of+Ultrafast+Ultrasound+Data+Highly+Increases+Doppler+and+fUltrasound+Sensitivity.">Spatiotemporal Clutter Filtering of Ultrafast Ultrasound Data Highly Increases Doppler and fUltrasound Sensitivity.</a> IEEE Transactions on Medical Imaging. 34 (11), 2271-2285 (2015).</li><li>Demen&#233;, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+microvascular+imaging+based+on+ultrafast+Doppler+tomography.">4D microvascular imaging based on ultrafast Doppler tomography.</a> NeuroImage. 127, 472-483 (2016).</li><li>Demen&#233;, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+Doppler+reveals+the+mapping+of+cerebral+vascular+resistivity+in+neonates.">Ultrafast Doppler reveals the mapping of cerebral vascular resistivity in neonates.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 34 (6), 1009-1017 (2014).</li><li>Baranger, J., Arnal, B., Perren, F., Baud, O., Tanter, M., Demene, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+Spatiotemporal+SVD+Clutter+Filtering+for+Ultrafast+Doppler+Imaging+Using+Similarity+of+Spatial+Singular+Vectors.">Adaptive Spatiotemporal SVD Clutter Filtering for Ultrafast Doppler Imaging Using Similarity of Spatial Singular Vectors.</a> IEEE Transactions on Medical Imaging. 37 (7), 1574-1586 (2018).</li><li>Demen&#233;, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+Doppler+Reveals+the+Mapping+of+Cerebral+Vascular+Resistivity+in+Neonates.">Ultrafast Doppler Reveals the Mapping of Cerebral Vascular Resistivity in Neonates.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 34 (6), 1009-1017 (2014).</li><li>Goudot, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wall+Shear+Stress+Measurement+by+Ultrafast+Vector+Flow+Imaging+for+Carotid+Stenosis.">Wall Shear Stress Measurement by Ultrafast Vector Flow Imaging for Carotid Stenosis.</a> Ultraschall in der Medizin - European Journal of Ultrasound. , (2019).</li><li>Demen&#233;, C., Mairesse, J., Baranger, J., Tanter, M., Baud, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+Doppler+for+neonatal+brain+imaging.">Ultrafast Doppler for neonatal brain imaging.</a> NeuroImage. 185, 851-856 (2019).</li><li>Villemain, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+Ultrasound+Imaging+in+Pediatric+and+Adult+Cardiology.">Ultrafast Ultrasound Imaging in Pediatric and Adult Cardiology.</a> JACC: Cardiovascular Imaging. , (2019).</li><li>Provost, J., Papadacci, C., Demene, C., Gennisson, J. L., Tanter, M., Pernot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+ultrafast+doppler+imaging+applied+to+the+noninvasive+mapping+of+blood+vessels+in+Vivo.">3-D ultrafast doppler imaging applied to the noninvasive mapping of blood vessels in Vivo.</a> IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 62 (8), 1467-1472 (2015).</li><li>Osmanski, B. F., Montaldo, G., Fink, M., Tanter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+out-of-plane+Doppler+imaging+based+on+ultrafast+plane+wave+imaging.">In vivo out-of-plane Doppler imaging based on ultrafast plane wave imaging.</a> IEEE International Ultrasonics Symposium, IUS. 62 (4), 76-79 (2013).</li><li>Kim, M. W., Zhu, Y., Hedhli, J., Dobrucki, L. W., Insana, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-dimensional+Clutter+Filter+Optimization+for+Ultrasonic+Perfusion+Imaging.">Multi-dimensional Clutter Filter Optimization for Ultrasonic Perfusion Imaging.</a> IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 65 (11), 2020-2029 (2018).</li><li>Chau, G., Li, Y. L., Jakovljevic, M., Dahl, J., Rodr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Wall Clutter Removal in Doppler Ultrasound using Principal Component Pursuit. , (2018).</li><li>Tierney, J., Baker, J., Brown, D., Wilkes, D., Byram, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+Component-Based+Spatiotemporal+Clutter+Filtering+for+Slow+Flow+Ultrasound.">Independent Component-Based Spatiotemporal Clutter Filtering for Slow Flow Ultrasound.</a> IEEE Transactions on Medical Imaging. , 1-1 (2019).</li><li>Zhang, N., Rivaz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clutter+Suppression+in+Ultrasound:+Performance+Evaluation+and+Review+of+Low-Rank+and+Sparse+Matrix+Decomposition+Methods.">Clutter Suppression in Ultrasound: Performance Evaluation and Review of Low-Rank and Sparse Matrix Decomposition Methods.</a> BioMedical Engineering Online. 19, 37 (2020).</li><li>Guidi, G., Licciardello, C., Falteri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+spectral+broadening+(ISB)+in+ultrasound+Doppler+as+a+combination+of+transit+time+and+local+geometrical+broadening.">Intrinsic spectral broadening (ISB) in ultrasound Doppler as a combination of transit time and local geometrical broadening.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 26 (5), 853-862 (2000).</li><li>Cloutier, G., Shung, K. K., Durand, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Evaluation+of+Intrinsic+and+Nonstationary+Ultrasonic+Doppler+Spectral+Broadening+in+Steady+and+Pulsatile+Flow+Loop+Models.">Experimental Evaluation of Intrinsic and Nonstationary Ultrasonic Doppler Spectral Broadening in Steady and Pulsatile Flow Loop Models.</a> IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 40 (6), 786-795 (1993).</li><li>Winkler, A. J., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+intrinsic+spectral+broadening+errors+in+doppler+peak+velocity+measurements+made+with+phased+sector+and+linear+array+transducers.">Correction of intrinsic spectral broadening errors in doppler peak velocity measurements made with phased sector and linear array transducers.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 21 (8), 1029-1035 (1995).</li><li>Osmanski, B. F., Bercoff, J., Montaldo, G., Loupas, T., Fink, M., Tanter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancellation+of+Doppler+intrinsic+spectral+broadening+using+ultrafast+Doppler+imaging.">Cancellation of Doppler intrinsic spectral broadening using ultrafast Doppler imaging.</a> IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 61 (8), 1396-1408 (2014).</li><li>Sauvage, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+aperture+row+column+addressed+probe+for+in+vivo+4D+ultrafast+doppler+ultrasound+imaging.">A large aperture row column addressed probe for in vivo 4D ultrafast doppler ultrasound imaging.</a> Physics in Medicine and Biology. 63 (21), (2018).</li><li>Correia, M., Provost, J., Tanter, M., Pernot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+ultrafast+ultrasound+flow+imaging:+in+vivo+quantification+of+arterial+volumetric+flow+rate+in+a+single+heartbeat.">4D ultrafast ultrasound flow imaging: in vivo quantification of arterial volumetric flow rate in a single heartbeat.</a> Physics in Medicine and Biology. 61 (23), 48-61 (2016).</li><li>Center for Devices and Radiological Health. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FDA+Information+for+Manufacturers+Seeking+Marketing+Clearance+of+Diagnostic+Ultrasound+Systems+and+Transducers.">FDA Information for Manufacturers Seeking Marketing Clearance of Diagnostic Ultrasound Systems and Transducers.</a> Center for Devices and Radiological Health. , (2008).</li><li>I, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IEC+62127-1+-+Measurement+and+characterization+of+medical+ultrasonic+fields+up+to+40+MHz.">IEC 62127-1 - Measurement and characterization of medical ultrasonic fields up to 40 MHz.</a> IEC. , 61010-61011 (2013).</li></ol>

利益相反なし

このプロトコルのメインフレームの周囲には、いくつかのバリエーションがあります。
ハードウェアに関する懸念事項 ユーザーがカスタム ホスト コンピュータを提供する場合、マザーボードとコンピュータのケースには、使用可能な PCI Express スロットが必要です。CPU には、すべてのデバイスを処理するのに十分な PCIe レーンが必要です。
プローブの選択 超音波プローブ(トランスデューサとも呼ばれる)は、必要な空間分解能と視野の幾何学に応じて選択されます。プローブの中心周波数が高いほど、空間分解能は良くなりますが、イメージングの深さは短くなります。線形、曲面またはフェーズドアレイプローブは、それぞれ矩形、円形セクタ、フラットトップセクタ形状の視野を提供します。
角度依存性 超高速ドップラーは、血流角度への依存性に関して従来のドップラーと同じ制約を共有しています。実際、基礎となるドップラー効果は、プローブ表面に向かって、またはプローブから離れて意味する軸方向の動きの検出のみを可能にします。したがって、実際には、血液散乱速度ベクトルの軸成分のみが測定されます。真の速度は、垂直軸で血流の局所的な角度を手動で示すことによって回復することができますが、この角度は常に正しく評価されるとは限りません。流れが垂直深度軸に完全に直交している極端な場合、ドップラー効果は血液速度を確実に測定するために使用することはできません。高度な手法では、複数の軸上の速度ベクトルの複数の投影を測定でき、最終的には真の速度ベクトルを再構築することができます。これらの角度に依存しないアプローチは、ベクトルフローイメージング8、9、10、24と呼ばれます。
エイリアシング 本稿に記載されている議定書には、いくつかの制限があります。まず、シャノン・ナイキストのサンプリング定理は、サンプリングされた信号の最大測定可能な周波数がフレームレートの半分を超えることができないと述べています。3つの角度と12 kHzのPRFで、フレームレートは4 kHzです。その結果、最大検出可能な軸速度が30cm/sであることをEq. 3から導き出すことができます。ファントムの運河の角度を考慮すると、このフレームレートは96 cm /sまでの速度の流れの検出を可能にする。この閾値を超える速度は、ドップラースペクトログラムにエイリアスで表示されます。提示されたセットアップのために、ピーク速度は95 cmと8 cm /sの間の範囲であった。
クラッターフィルターの最適化 血流の可視化は、ゆっくりと動く組織の背景から血液信号を分離する能力に強く依存しています。呼吸やソノグラファーの手の動きに応じて、組織は遅い血流に似た速度で動くことができます。したがって、いわゆる「クラッタフィルタ」段階は、組織信号をキャンセルすることを目的としています。遅い血液の流れを検出する能力は、この乱雑なフィルタステージの効率にのみ依存します。超高速超音波の時空間的一貫性を活用することは、これらのフィルタの結果を強く増加させることが示されている。Demeneら15で説明した単数形値分解フィルタが広く用いられている。高次SVD25、主成分追求26、独立成分分析27または他の低ランク分解28のようなその方法18以上の複雑なアルゴリズムの最適化は、フィルタリングされたデータの品質を向上させることができる。発表されたin vitroのセットアップでは、混乱の唯一のソースは、オペレータの手の動きであることを言及する価値があります。生体内では、呼吸や動脈脈動などの他の多くの要因がより優勢である雑然とする可能性が高い。このような場合、このプロトコルで説明する高度なSVDフィルタが最も重要になります。
スペクトログラムの解釈 スペクトログラムは、従来のドップラー超音波と超高速ドップラー超音波の両方で血流特性を研究するための最も一般的なツールです。各時点のスペクトログラムは、考慮されたROI内の速度分布をグレースケールで示します。非層流のような複雑な流れは自然にこのスペクトルを広げる。しかし、スペクトルの広がりと速度分布の間のこのリンクは、ある程度だけ当てはまります。スペクトログラム幅は、スペクトル拡幅とも呼ばれるが、実際にはROIにおける速度分布にリンクされているが、イメージングシステムの幾何学的パラメータ(配列幅、角度など)29、30、31にもリンクされていることがいくつか研究によって示されている。したがって、安定した層状および均一な流れのスペクトログラムは細く平坦な線であるべきであるが、実際には速度分布を反映しない特定の幅を示し、むしろイメージング設定の幾何学的形状を示す。この潜在的な落とし穴は、誤った速度測定につながる可能性があります。これらの効果32を避けるためにROI(図1C破線緑色の線)内の平均速度を考慮することをお勧めします。
3D取得 本プロトコルは、標準のリニアアレイトランスデューサで実現され、2D画像が得られました。それにもかかわらず、3D集録は、電動線形プローブ16で媒体を機械的に走査するか、または行列アレイ33 またはマトリックスアレイ34を用いて行うことができる。これらの新しい方法の欠点は、高いコンピューティングコストと、マトリックスプローブの場合、特定のスキャナの必要性です。3D 取得の例を図 3Eに示します。
安全上の問題 研究の超高速超音波スキャナーのほとんどは、臨床使用のために承認されていません。電気安全と音響出力の両方の用語で、自国で普及している基準を遵守することは、実験者の責任です。後者については、FDA規格35 およびIEC 62127-1国際規格36 を考慮する必要があります。
結論 本論文では、超高速ドップラーによる血流をイメージするための標準プロトコルを提案した。校正されたフローファントムで練習することで、オペレータは最終的に測定の正確さを確認することができます。このプロトコルは、ユーザーが平面波コンパウンドを使用して超高速超音波取得を設計し、実行することを可能にする。最終的には、後処理フレームワークが説明され、画像の任意の領域で血流プロファイルを表示する最初のツールを提供します。

超音波画像診断は、臨床現場および研究活動において最も一般的に使用される画像化技術の1つである。生物組織における超音波放出の組み合わせと後方散乱エコーの記録により、解剖学的画像、いわゆる「Bモード」の再構築が可能となる。この方法は、通常、≈1540 m/sの伝播速度で、通常、数センチメートルにわたって超音波の浸透を可能にする生体組織などの軟部組織イメージングに完全に適合しています。超音波プローブの中心周波数に応じて、30μmから1mmまでの解像度の画像が得られます。さらに、音響源の動きが、関連する波の物理的特性に影響を及ぼすことはよく知られている。特に、波の周波数シフトとソースの速度に対する周波数シフト間のリンクは、ドップラー効果1と呼ばれ、その最も単純な症状は、移動する救急車のサイレンのピッチの変化である。超音波画像は長い間、この物理的効果を使用して移動する赤血球2を観察し、一般的に「ドップラーイメージング」とラベル付けされる様々なイメージングモードを提案している。これらのモードは、脳、心臓、腎臓または末梢動脈などの非常に異なる用途および器官における血液の流れの評価を可能にする。
驚くべきことに、現在利用可能な超音波システムのほとんどは、従来の超音波と呼ばれる同じ技術に依存しています。基礎となる原理は次のとおりです:音響ビームは視野を内在化し、超音波トランスデューサ開口部に沿って掃引されます。ビームの各位置について、エコーが記録され、最終的な画像のラインに変換されます。ビームをトランスデューサに沿って徐々に移動させることで、全視野をライン毎に画像化することができます(図1、左パネル)。この戦略は、21世紀初めまで普及していた電気的制約と計算能力にうまく適応していました。それにもかかわらず、それはいくつかの欠点を持っています。これらの中で、最終的なフレームレートは、ビームスキャンプロセスによって毎秒数百枚の画像に制限されています。血流の面では、この比較的低いフレームレートは、シャノン・ナイキスト3のサンプリング基準によって決定される検出可能な最大流速に影響を与える。さらに、従来のドップラーは複雑なトレードオフに対処する必要があります。特定の関心領域(ROI)における血流速度を評価するためには、そのROIから来るいくつかのエコーを連続的に記録する必要があります。これは、超音波ビームが一定の位置に一時的に維持されることを意味します。エコーアンサンブルが長ければ長いほど、そのROIに対する速度推定が良くなります。しかし、視野の完全な画像を生成するには、ビームは媒体をスキャンする必要があります。したがって、1 つの線に沿って速度を正確に評価するためにビームを保持するか、ビームを移動してイメージを生成するかという 2 つの拘束の間の競合を感知できます。異なる従来のドップラーモード(すなわち、カラードップラーまたはパルス波ドップラー)は、このトレードオフを直接反映しています。通常、カラードップラーは、容器4を局所化するために使用される低忠実度のフローマップを生成し、パルス波ドップラーは、以前に同定された容器5内の流れを正確に定量するために使用される。
これら 2 つの制限 (低フレームレートとローカリゼーション/定量のトレードオフ) は、非常に高フレームレートの新しい手法で克服されます。これらの中でも、合成開口アプローチ6またはマルチライン送信技術は7を挙げられる。本研究では、いわゆる超高速超音波法に焦点を当てる。20年前に導入された8、9、10、この方法はまた、超音波の放出/受信に依存していますが、根本的に異なるパターンを持っています。確かに、走査に焦点を当てたビームを使用する代わりに、超高速イメージングは平面波または発散波を使用し、単一の放出で視野を内振することができます。その単一の放出に続いて、関連する電子工学はまた全体の視野から発生する多数のエコーを受け取り、処理することができる。最後に、画像は単一の放出/受信パターン11(図1、右パネル)から再構築することができる。これらの非焦点放出は音響エネルギーの普及による低い信号対雑音比(SNR)を有することができる。これは、いくつかのタイトルの平面波(または異なるソースで波を発散する)を放出し、結果の画像を追加することによって取り組むことができます。この方法は「コヒーレント・コンパウンディング」12と名付けられています。2つの大きな結果が生じます。まず、フレームレートは飛行の超音波時間にのみ依存し、1〜10 kHzの典型的な値に達することができます。第 2 に、空間ディメンションと時間ディメンションの両方でデータの連続性が保証されます。したがって、従来のローカリゼーション/定量化のトレードオフは破られます。高いフレームレートと時空的な一貫性のこの組み合わせは、超音波で血液の流れを検出する能力に大きな影響を与えます。従来の超音波と比較して、超高速超音波は、血流の完全な特性を提供します 3.実際には、ユーザーは、取得の全期間(通常は≈1秒)、フレームレート(通常は、時間分解能200μsの場合は5kHzのフレームレート)で、画像のすべてのピクセルの速度時間コースにアクセスできます。この高いフレームレートは、冠状マイクロ灌流14を有する心臓室13や心筋のような移動器官における速い流れのような幅広い適用に適した方法を作る。さらに、その時空間的な一貫性が、バックグラウンド移動組織から遅い血流を分離する能力を強く向上させ、したがって微小血管流れ15に対する感受性を増加させることが示されている。この容量は、動物16と人間17の両方の脳の微小血管系へのアクセスを提供します。
したがって、超高速超音波は、様々な状況での血流を画像に適しています。それは軟らかい生物学的組織に限定され、骨、または肺のようなガス腔のような硬いインターフェースの存在によって強く影響を受ける。超音波シーケンスの物理的なパラメータのチューニングは、遅い(1 mm / s11、16まで)と高速流れ(数m / sまで)の両方の研究を可能にします。空間解像度と浸透深度の間にはトレードオフがあります。通常、50 μmの分解能は、5 mm程度の浸透を犠牲にして達成できます。逆に、1mmの分解能を犠牲にして、浸透を15〜20cmまで拡張することができます。この記事で使用されているような超高速スキャナの多くは、2D画像のみを提供していることは注目に値します。
ここでは、生体組織に埋め込まれた血管(動脈または静脈)を模した超音波スキャナーとドップラーファントムをプログラム可能な研究を用いて、超高速ドップラーイメージングの概念を導入する簡単なプロトコルを提案する。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blood-mimicking fluid</td>
			<td>CIRS Inc, Norfolk, Virginia, USA</td>
			<td>069DTF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doppler flow phantom</td>
			<td>CIRS Inc, Norfolk, Virginia, USA</td>
			<td>ATS523A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>MathWorks, Natick, Massachusetts, United States</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump / Doppler flow pump</td>
			<td>CIRS Inc, Norfolk, Virginia, USA</td>
			<td>769</td>
			<td>Include tubings and pulse dampener</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer adpter</td>
			<td>Verasonics, Kirkland, Washington, USA</td>
			<td>UTA 408-GE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafast ultrasound research scanner</td>
			<td>Verasonics, Kirkland, Washington, USA</td>
			<td>Vantage 256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound probe/transducer</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE 9L-D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

blood flow imaging with ultrafast doppler

パルスドップラー効果は、血流を評価するために臨床エクログラフィーで使用される主な技術です。従来の焦点を当てた超音波ドップラーモードで適用され、それはいくつかの制限を有する。まず、血液の流れと周囲の動く組織を区別するために、細かく調整された信号フィルタリング操作が必要です。第二に、オペレータは血液の流れを局所化するか、それらを定量化するかを選択する必要があります。過去20年間で、超音波画像は、焦点を合っていない波を使用して超高速超音波の出現とパラダイムシフトを受けています。この新しい技術は、フレームレートの100倍の増加(最大10000Hz)に加えて、従来の定量化/局在化トレードオフを破り、視野の完全な血流マッピングと、単一ピクセルレベル(50μmまで)での細かい速度測定への同時アクセスを提供します。空間的および時間的な次元の両方のこのデータの連続性は、組織/血液のフィルタリングプロセスを強力に改善し、小さな血流速度(1 mm/sまで)に対する感受性を高める結果となる。本論文では、超高速ドップラーの概念と主なパラメータを紹介することを目指しています。まず、非焦点波イメージングの物理的原理を要約する。次に、ドップラー信号処理の主なステップを提示します。特に、重要な組織/血流分離アルゴリズムの実用的な実装と、これらのフィルタリングされたデータからの速度の抽出について説明する。この理論的な記述は、インビトロの経験によって補完されます。流れる血液模倣液を含む運河を埋め込む組織ファントムは、研究プログラム可能な超音波システムで画像化される。血流画像が得られ、運河の数画素に流動特性が表示されます。最後に、生体内応用の検討が提案され、頸動脈、腎臓、甲状腺、脳および心臓などのいくつかの器官における例を示す。

取得と後処理の品質は、まず目視検査によって評価されます。運河の形状は、パワードップラー画像ではっきりと見える必要があり、組織領域は暗く見える必要があります。パワードップラー信号が運河に限定されない場合、クラッタフィルターステップが間違っていた(SVDの閾値が低すぎる)か、またはプローブが取得中に強い動きを経験したことを意味することができます。
目視検査の後、運河内のスペクトログラムの研究は、実験の成功または失敗に関する良い情報を提供することができます。スペクトログラムは片側 (ゼロより上または下のすべての値) でなければなりません。スペクトログラムが両面の場合、エイリアシングが存在します。その場合、フローが速すぎるか、または PRF が低すぎるかのいずれかです。
これらの品質基準が満たされている場合、血液速度は画像内の任意のROIから抽出することができます(図2C)。ROIのサイズを調整することで、信号の平均化が多かれ少なかれ可能になります。与えられたROIの速度時間の経過は、その後、抵抗率指数19、壁せん断応力推定20、反応性高血症定量14、さらに21、22のような複数の分析に使用することができる。
図3A-D は、このプロトコルをさまざまなin vivoアプリケーションに移調することを示しています。特に、新生児の脳獲得(図3B)は、小さな皮質の小胞や細動脈から主要な周動脈まで、非常に異なる流れの特徴を持つ血管を示す。 図3D は、心筋のような強く動く器官で血流信号を抽出する超高速ドップラーの能力を示す。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61838/61838fig01.jpg"> 図1:従来の超高速超音波画像診断。伝説 :(左) 放射に焦点を当てた従来のイメージング。 (右) 平面波放射を用いて超高速イメージング。(ヴィルメインら22より適合) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61838/61838fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61838/61838fig02.jpg"> 図2:超高速ドップラープロトコルのワークフロー。(A) 超高速対応スキャナーとドップラーフローファントムを含む実験的なセットアップ。幻影の破線の長方形は超音波トランスデューサーの足跡を示す。(B)シンプルなユーザーボタン押下によってトリガされた自動データ取得チェーンと後処理。(C)(上)血流信号の抽出と組織の背景雑音の抑制(「乱雑フィルタ」)と、視野の任意のROIにおける血液スペクトログラムの表示。(下)異なる時点でのROIにおける血液速度分布を示すスペクトログラム。ROI の平均速度は、緑色の点線でトレースされます。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61838/61838fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61838/61838fig03.jpg"> 図3:パワードップラー画像。いくつかの臓器で超高速ドップラー獲得。(A)成人移植腎臓、(B)ヒト新生児脳の矢状視、(C)甲状腺、(D)開胸豚実験における壁内冠状血管系、(E)頸動脈の3D指向性動力ドップラーおよび健康ボランティアの頸静脈(青色=下降流、赤=上昇流)。いくつかのスペクトログラムが異なるROIのために抽出されます。(A-Cはバランゲルらから適応され、Dはマレスカら14から適応され、Eはプロボストら23から適応される)。各集録について、中心周波数、角度の数、PRFおよび最大深度は状況に応じて調整された。パネルA、B、Cのダイナミックレンジは、それぞれ -27、-35、および -30 dB です。パネル D と E には提供<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61838/61838fig03large.jpg" target="_blank">されていません。</a>
補足材料。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61838/JOVE_SupScript.m" target="_blank">これらのファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

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Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

このプロトコルは、血液の流れを定量化するために超高速超音波ドップラーイメージングを適用する方法を示しています。1秒の長い取得の後、実験者は各ピクセルの軸速度値を持つ全視野のムービーにアクセスできます ≈0.3 ms(飛行の超音波時間に応じて)。

超高速ドップラーによる血流イメージング

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...

blood-flow-imaging-with-ultrafast-doppler

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Electrical Engineering

Anatomy and Physiology

Bioengineering

Unit 1

Sampling

Blood Vessels and Circulation

SCIENTISTS IN ACTION

7.3K ビュー.  The Hospital for Sick Children, PGCRL Research Institute. このプロトコルは、血液の流れを定量化するために超高速超音波ドップラーイメージングを適用する方法を示しています。1秒の長い取得の後、実験者は各ピクセルの軸速度値を持つ全視野のムービーにアクセスできます ≈0.3 ms(飛行の超音波時間に応じて)。

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Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによるナノ粒子と細菌の細胞内在化を分析する

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

生物工学

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general relatively bulky and costly, making them less effective in the resource limited settings. To potentially address these limitations, we have recently demonstrated the integration of wide-field fluorescent microscopy and imaging flow cytometry tools on cell-phones using compact, light-weight, and cost-effective opto-fluidic attachments. In our flow cytometry design, fluorescently labeled cells are flushed through a microfluidic channel that is positioned above the existing cell-phone camera unit. Battery powered light-emitting diodes (LEDs) are butt-coupled to the side of this microfluidic chip, which effectively acts as a multi-mode slab waveguide, where the excitation light is guided to uniformly excite the fluorescent targets. The cell-phone camera records a time lapse movie of the fluorescent cells flowing through the microfluidic channel, where the digital frames of this movie are processed to count the number of the labeled cells within the target solution of interest. Using a similar opto-fluidic design, we can also image these fluorescently labeled cells in static mode by e.g. sandwiching the fluorescent particles between two glass slides and capturing their fluorescent images using the cell-phone camera, which can achieve a spatial resolution of e.g. ~ 10 &mu;m over a very large field-of-view of ~ 81 mm2. This cell-phone based fluorescent imaging flow cytometry and microscopy platform might be useful especially in resource limited settings, for e.g. counting of CD4+ T cells toward monitoring of HIV+ patients or for detection of water-borne parasites in drinking water.

We review our recent results on the integration of fluorescent microscopy and imaging flow cytometry tools on a cell-phone using compact and cost-effective opto-fluidic attachments. These cell-phone based micro-analysis devices might be useful for cytometric analysis, such as performing various cell counting tasks as well as for high-throughput screening of e.g., water samples in resource limited settings.

携帯電話上の広視野蛍光顕微鏡と蛍光イメージングフローサイトメトリー

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich cell structures and de facto there is still no quantitative method to assess their distribution at cell and tissue levels. What we propose here is an innovative method allowing the detection and quantification of CNTs in cells using a multispectral imaging flow cytometer (ImageStream, Amnis). This newly developed device integrates both a high-throughput of cells and high resolution imaging, providing thus images for each cell directly in flow and therefore statistically relevant image analysis. Each cell image is acquired on bright-field (BF), dark-field (DF), and fluorescent channels, giving access respectively to the level and the distribution of light absorption, light scattered and fluorescence for each cell. The analysis consists then in a pixel-by-pixel comparison of each image, of the 7,000-10,000 cells acquired for each condition of the experiment. Localization and quantification of CNTs is made possible thanks to some particular intrinsic properties of CNTs: strong light absorbance and scattering; indeed CNTs appear as strongly absorbed dark spots on BF and bright spots on DF with a precise colocalization.
This methodology could have a considerable impact on studies about interactions between nanomaterials and cells given that this protocol is applicable for a large range of nanomaterials, insofar as they are capable of absorbing (and/or scattering) strongly enough the light.

In this study, the main purpose was to monitor the cellular uptake and eventual exocytosis of carbon nanotubes (CNTs). From this perspective, we proposed here a unique method using multispectral imaging flow cytometry allowing a quantification and localization of CNTs in a statistically relevant number of cells.

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

人間の細胞に基づく、血液脳関門の接触モデルの作製のための改善された方法

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and progression of pathology in several neurodegenerative diseases, including Alzheimer's disease and the related tauopathies. The potentially critical role of tau seeds in disease progression strongly supports the need for a sensitive assay that readily detects seeding activity in biological samples. 
By combining the specificity of fluorescence resonance energy transfer (FRET), the sensitivity of flow cytometry, and the stability of a monoclonal cell line, an ultra-sensitive seeding assay has been engineered and is compatible with seed detection from recombinant or biological samples, including human and mouse brain homogenates. The assay employs monoclonal HEK 293T cells that stably express the aggregation-prone repeat domain (RD) of tau harboring the disease-associated P301S mutation fused to either CFP or YFP, which produce a FRET signal upon protein aggregation. The uptake of proteopathic tau seeds (but not other proteins) into the biosensor cells stimulates aggregation of RD-CFP and RD-YFP, and flow cytometry sensitively and quantitatively monitors this aggregation-induced FRET. The assay detects femtomolar concentrations (monomer equivalent) of recombinant tau seeds, has a dynamic range spanning three orders of magnitude, and is compatible with brain homogenates from tauopathy transgenic mice and human tauopathy subjects. With slight modifications, the assay can also detect seeding activity of other proteopathic seeds, such as &#945;-synuclein, and is also compatible with primary neuronal cultures. The ease, sensitivity, and broad applicability of FRET flow cytometry makes it useful to study a wide range of protein aggregation disorders.

Cell-to-cell transfer of protein aggregates, or proteopathic seeds, may underlie the progression of pathology in neurodegenerative diseases. Here, a novel FRET flow cytometry assay is described that enables specific and sensitive detection of seeding activity from recombinant or biological samples.

FRETフローサイトメトリーでProteopathic播種活動の高感度検出

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards vascular disease pathologies. Unhealthy arteries often present with wall stiffening, scarring, or partial stenosis which may all affect fluid flow rates, and the magnitude of pulsatile flow, or pulsatility index. Replication of various flow conditions is the result of tuning a flow pressure damping chamber downstream of a blood pump. Introduction of air within a closed flow system allows for a compressible medium to absorb pulsatile pressure from the pump, and therefore vary the pulsatility index. The method described herein is simply reproduced, with highly controllable input, and easily measurable results. Some limitations are recreation of the complex physiological pulse waveform, which is only approximated by the system. Endothelial cells, smooth muscle cells, and fibroblasts are affected by the blood flow through the artery. The dynamic component of blood flow is determined by the cardiac output and arterial wall compliance. Vascular cell mechano-transduction of flow dynamics may trigger cytokine release and cross-talk between cell types within the artery. Co-culture of vascular cells is a more accurate picture reflecting cell-cell interaction on the blood vessel wall and vascular response to mechanical signaling. Contribution of flow dynamics, including the cell response to the dynamic and mean (or steady) components of flow, is therefore an important metric in determining disease pathology and treatment efficacy. Through introducing an in vitro co-culture model and pressure damping downstream of blood pump which produces simulated cardiac output, various arterial disease pathologies may be investigated.

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

This protocol replicates physiological or pathological blood flow in vitro to aid in determining cell response in disease pathologies. By introducing a pressure damping chamber downstream of a blood pump, blood flow across the vasculature can be recapitulated and imposed on a monolayer of vascular endothelium or a mimetic co-culture.

血管細胞リモデリングの研究への応用生理学的および病理学的血流のインビトロモデル

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

マイクロ流体チャンバーモデル止血や血小板輸血に再構成された血液を使用しました<em&gt;インビトロ</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is restricted to platelet deposition only. The intricate relationship between Ca2+-dependent coagulation and platelet function requires careful and controlled recalcification of blood prior to analysis. Our setup uses a Y-shaped mixing channel, which supplies concentrated Ca2+/Mg2+ buffer to flowing blood just prior to perfusion, enabling rapid recalcification without sample stasis. A ten-fold difference in flow velocity between both reservoirs minimizes dilution. The recalcified blood is then perfused in a collagen-coated analysis chamber, and differential labeling permits real-time imaging of both platelet and fibrin deposition using fluorescence video microscopy. The system uses only commercially available tools, increasing the chances of standardization. Reconstitution of thrombocytopenic blood with platelets from banked concentrates furthermore models platelet transfusion, proving its use in this research domain. Exemplary data demonstrated that coagulation onset and fibrin deposition were linearly dependent on the platelet concentration, confirming the relationship between primary and secondary hemostasis in our model. In a timeframe of 16 perfusion min, contact activation did not take place, despite recalcification to normal Ca2+ and Mg2+ levels. When coagulation factor XIIa was inhibited by corn trypsin inhibitor, this time frame was even longer, indicating a considerable dynamic range in which the changes in the procoagulant nature of the platelets can be assessed. Co-immobilization of tissue factor with collagen significantly reduced the time to onset of coagulation, but not its rate. The option to study the tissue factor and/or the contact pathway increases the versatility and utility of the assay.

This paper describes an experimental model of hemostasis that simultaneously measures platelet function and coagulation. Platelet and fibrin fluorescence is measured in real-time, and platelet adhesion rate, coagulation rate, and onset of coagulation are determined. The model is used to determine platelet procoagulant properties under flow in concentrates for transfusion.

血小板輸血や止血のためのマイクロ流体フローチャンバーモデルは、リアルタイムでの血小板沈着およびフィブリン形成を測定します

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

1 蛍光顕微鏡を用いた複数の画像モードを実施

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as atomic force microscopy have limited temporal resolution, while F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) only allow conformations to be inferred. Fluorescence microscopy, on the other hand, allows real-time in situ visualization of single molecules in various flow conditions. Our protocol describes the steps to capture conformational changes of single biomolecules under different shear flow environments using fluorescence microscopy. The shear flow is created inside microfluidic channels and controlled by a syringe pump. As demonstrations of the method, von Willebrand factor (VWF) and lambda DNA are labeled with biotin and fluorophore and then immobilized on the channel surface. Their conformations are continuously monitored under variable shear flow using total internal reflection (TIRF) and confocal fluorescence microscopy. The reversible unraveling dynamics of VWF are useful for understanding how its function is regulated in human blood, while the conformation of lambda DNA offers insights into the biophysics of macromolecules. The protocol can also be widely applied to study the behavior of polymers, especially biopolymers, in varying flow conditions and to investigate the rheology of complex fluids.

We present a protocol for immobilizing single macromolecules in microfluidic devices and quantifying changes in their conformations under shear flow. This protocol is useful for characterizing the biomechanical and functional properties of biomolecules such as proteins and DNA in a flow environment.

蛍光顕微鏡によるせん断流下の単分子の立体構造変化の特徴

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...