私たちは、プライマーの開発とテストを支援したアルヴィ・ワドゥドとトルディ・フロストに感謝します。本研究で報告されたアッセイ設計のための資金は、国防総省戦略環境研究開発プログラム(RC19-1156)によって提供されました。貿易、製品、または会社名の使用は記述目的のものであり、米国政府による承認を意味するものではありません。この調査中に生成されたデータは、USGS データ・リリース https://doi-org.remotexs.ntu.edu.sg/10.5066/P9BIGOS5 として入手できます。

<ol>
	<li>Kubista, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+real-time+polymerase+chain+reaction.">The real-time polymerase chain reaction.</a> Mol Aspects Med. 27 (2-3), 95-125 (2006).</li><li>Higuchi, R. D., Walsh, P. S., Griffith, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+amplification+and+detection+of+specific+DNA+sequences.">Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences.</a> Biotechnology. 10, 5 (1992).</li><li>Mauvisseau, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+accuracy,+repeatability+and+detection+probability+in+the+reliability+of+species-specific+eDNA+based+approaches.">Influence of accuracy, repeatability and detection probability in the reliability of species-specific eDNA based approaches.</a> Scientific Reports. 9 (1), 580 (2019).</li><li>Hernandez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=60+specific+eDNA+qPCR+assays+to+detect+invasive,+threatened,+and+exploited+freshwater+vertebrates+and+invertebrates+in+Eastern+Canada.">60 specific eDNA qPCR assays to detect invasive, threatened, and exploited freshwater vertebrates and invertebrates in Eastern Canada.</a> Environmental DNA. , (2020).</li><li>Klymus, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporting+the+limits+of+detection+and+quantification+for+environmental+DNA+assays.">Reporting the limits of detection and quantification for environmental DNA assays.</a> Environmental DNA. , (2019).</li><li>Thalinger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+validation+scale+to+determine+the+readiness+of+environmental+DNA+assays+for+routine+species+monitoring.">A validation scale to determine the readiness of environmental DNA assays for routine species monitoring.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Helbing, C. C., Hobbs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+DNA+Standardization+Needs+for+Fish+and+Wildlife+Population+Assessments+and+Monitoring.">Environmental DNA Standardization Needs for Fish and Wildlife Population Assessments and Monitoring.</a> CSA Group. , (2019).</li><li>Sepulveda, A. J., Nelson, N. M., Jerde, C. L., Luikart, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+Environmental+DNA+Methods+Ready+for+Aquatic+Invasive+Species+Management.">Are Environmental DNA Methods Ready for Aquatic Invasive Species Management.</a> Trends in Ecology &amp; Evolution. , (2020).</li><li>Svec, D., Tichopad, A., Novosadova, V., Pfaffl, M. W., Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+good+is+a+PCR+efficiency+estimate:+Recommendations+for+precise+and+robust+qPCR+efficiency+assessments.">How good is a PCR efficiency estimate: Recommendations for precise and robust qPCR efficiency assessments.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 3, 9-16 (2015).</li><li>Wilcox, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+detection+of+rare+species+using+environmental+DNA:+the+importance+of+primer+specificity.">Robust detection of rare species using environmental DNA: the importance of primer specificity.</a> PLoS One. 8 (3), 59520 (2013).</li><li>Prediger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+design+primers+and+probes+for+PCR+and+qPCR.">How to design primers and probes for PCR and qPCR.</a> IDT. , (2020).</li><li>Thornton, B., Basu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+(qPCR)+primer+design+using+free+online+software.">Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 39, 145-154 (2011).</li><li>Owczarzy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDT+SciTools:+a+suite+for+analysis+and+design+of+nucleic+acid+oligomers.">IDT SciTools: a suite for analysis and design of nucleic acid oligomers.</a> Nucleic Acids Research. 36, 163-169 (2008).</li><li>Kibbe, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OligoCalc:+an+online+oligonucleotide+properties+calculator.">OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator.</a> Nucleic Acids Research. 35, 43-46 (2007).</li><li>Taylor, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ultimate+qPCR+Experiment:+Producing+Publication+Quality,+Reproducible+Data+the+First+Time.">The Ultimate qPCR Experiment: Producing Publication Quality, Reproducible Data the First Time.</a> Trends in Biotechnology. 37 (7), 761-774 (2019).</li><li>Ye, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer-BLAST:+A+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction.">Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinformatics. 13 (134), 11 (2012).</li><li>Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Local+Alignment+Search+Tool.">Basic Local Alignment Search Tool.</a> Journal of Molecular Biology. 215, 403-410 (1990).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Bio-Rad. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bio-Rad Vol. 5279. , (2020).</li><li>Bio-Rad. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bio-Rad Vol. 6894. , (2020).</li><li>Eurogentec. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Eurogentec. Vol. 0708-V2. , (2020).</li><li>Bustin, S., Huggett, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=qPCR+primer+design+revisited.">qPCR primer design revisited.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 14, 19-28 (2017).</li><li>Hoorfar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+considerations+in+design+of+internal+amplification+controls+for+diagnostic+PCR+assays.">Practical considerations in design of internal amplification controls for diagnostic PCR assays.</a> Journal of Clinical Microbiology. 42 (5), 1863-1868 (2004).</li><li>Goldberg, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+considerations+for+the+application+of+environmental+DNA+methods+to+detect+aquatic+species.">Critical considerations for the application of environmental DNA methods to detect aquatic species.</a> Methods in Ecology and Evolution. 7 (11), 1299-1307 (2016).</li><li>Guan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+DNA+(eDNA)+Assays+for+Invasive+Populations+of+Black+Carp+in+North+America.">Environmental DNA (eDNA) Assays for Invasive Populations of Black Carp in North America.</a> Transactions of the American Fisheries Society. 148 (6), 1043-1055 (2019).</li><li>Mosher, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+molecular+detection+studies+require+clear+communication+among+diverse+research+partners.">Successful molecular detection studies require clear communication among diverse research partners.</a> Frontiers in Ecology and the Environment. 18 (1), 43-51 (2019).</li><li>Kwonga, S., Srivathsana, A., Meier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+update+on+DNA+barcoding:+low+species+coverage+and+numerous+unidentified+sequences.">An update on DNA barcoding: low species coverage and numerous unidentified sequences.</a> Cladistics. 28, 6 (2012).</li><li>Rees, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REVIEW:+The+detection+of+aquatic+animal+species+using+environmental+DNA+-+a+review+of+eDNA+as+a+survey+tool+in+ecology.">REVIEW: The detection of aquatic animal species using environmental DNA - a review of eDNA as a survey tool in ecology.</a> Journal of Applied Ecology. 51 (5), 1450-1459 (2014).</li><li>Evans, N. T., Lamberti, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freshwater+fisheries+assessment+using+environmental+DNA:+A+primer+on+the+method,+its+potential,+and+shortcomings+as+a+conservation+tool.">Freshwater fisheries assessment using environmental DNA: A primer on the method, its potential, and shortcomings as a conservation tool.</a> Fisheries Research. 197, 60-66 (2018).</li><li>Forootan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+determine+limit+of+detection+and+limit+of+quantification+in+quantitative+real-time+PCR+(qPCR).">Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR).</a> Biomolecular Detection and Quantification. 12, 1-6 (2017).</li><li>Sengupta, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+DNA+for+improved+detection+and+environmental+surveillance+of+schistosomiasis.">Environmental DNA for improved detection and environmental surveillance of schistosomiasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (18), 8931-8940 (2019).</li><li>Klymus, K. E., Richter, C. A., Chapman, D. C., Paukert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+eDNA+shedding+rates+from+invasive+bighead+carp+Hypophthalmichthys+nobilis+and+silver+carp+Hypophthalmichthys+molitrix.">Quantification of eDNA shedding rates from invasive bighead carp Hypophthalmichthys nobilis and silver carp Hypophthalmichthys molitrix.</a> Biological Conservation. 183, 77-84 (2015).</li></ol>

著者らは利益相反を宣言しない。資金提供者は、研究の設計に何の役割も持っていなかった。データの収集、分析、または解釈に含まれる。原稿の執筆に。または結果を公開する決定に含まれます。

他の研究と同様に、対処する質問を定義することは最初のステップであり、eDNAアッセイの設計は研究の範囲に依存する26.例えば、研究または調査の目的が1種または数種を検出することである場合、標的プローブベースのアッセイが最善である。しかし、より大きな組み合えまたは種の集合体を評価することが目標である場合、高スループットシーケンシングメタバーコーディングアッセイの方が適しています。どのアプローチを取る必要が決定されたら、検定の設計、テスト、最適化を含むパイロットスタディを推奨します。24.アッセイの設計は、次の説明に従って種のリストから始まります。 図 1.このリストは、アッセイが特異性と適用される可能性のある地理的範囲の観点から、アッセイがどの程度優れたパフォーマンスを発揮するかを理解するための基礎となります。6,10.特定の地理的領域に対するアッセイを設計し、設計者がその地域の他の種に対する交差反応性のアッセイをより良くテストすることを可能にし、標的種が発生する可能性のある他の地域にアッセイを拡張することに関する限界を認識することが奨励される24.リストが完成すると、パブリック遺伝データベースからシーケンスをダウンロードできます。これらのデータベースは不完全であるため27、アッセイ設計で使用される配列のローカル参照データベースを完了するために、一つは、家の中でリスト上のできるだけ多くの種をシーケンスする必要があります。これらは増幅する最も可能性の高い非標的であるとして、密接に関連する種の共生を優先する。ターゲット種と同じ属または家族内のすべての種に焦点を当てることは、開始する良い場所です。密接に関連する種との比較は、標的種に特有の配列領域を同定するのに役立つ。これは、アッセイが他のシステムまたは場所でどのように実行されるかを知らせるのに役立ちます。ミトコンドリア領域は、より多様な種からのより多くの配列情報が、バーコード・オブ・ライフ・プロジェクトで使用されてきたミトコンドリア遺伝子で入手可能であり、ミトコンドリアDNAが核DNAよりもコピー/細胞にはるかに高い濃度で存在するため、アッセイ開発のための通常の選択である24,28,29.配列カバレッジは、遺伝的リポジトリデータベース内の分類によって異なるため、複数の遺伝子領域をさらなるアッセイ開発について評価する必要があります。この参照シーケンスのローカルデータベースが作成された後、配列配列データとコンピュータソフトウェアプログラムの手動可視化を組み合わせてプライマー/プローブアッセイを設計します。どのアッセイをテストするかを決定するために、ソフトウェアに厳密に依存すべきではありません。プライマーとプローブがターゲットと非ターゲットに座っている位置合わせを視覚的に検証して、PCRでどのように作用するかをよりよく理解することが重要です。最後にアッセイスクリーニングと最適化は、3つのレベル(インシリコ、インビトロおよびinitu)を含む6,7,24,25.シリコの設計とテストは、成功の可能性が高いアッセイの短いリストを生成するために重要ですが、経験的な(インビトロ)テストは、最高の実際のパフォーマンスでアッセイを選択するために重要です。インビトロでの最適化とアッセイのテストには、反応効率の測定とアッセイの感度と特異性の定義が含まれます。検出と定量の限界は、アッセイの開発において見落とされがちであるが、データ解釈にとって重要な2つのパラメータである。アッセイ用の標準曲線の複数の反復を実行することにより、LODとLOQを簡単に測定することができます1,5,30.アッセイのLODまたはLOQに関する結果について議論する研究はほとんどありませんが、Senguptaら(2019)は、アッセイのLODとLOQをデータ解釈とグラフィックスに組み込み、結果を明確に理解します。31.内部の肯定的な制御は、同様に設計されたアッセイに多重化されるべきである。サンプル内の PCR 阻害をテストしないと、偽陰性が発生する可能性があります。24,32.PCR阻害試験の最も簡単な方法として、標的アッセイによる多重化IPCアッセイの使用を提案する23.最後に、現場および実験室から採取したサンプルからのアッセイの現場試験では、環境試料中でターゲット増幅が確実に起こる必要がある24.
eDNAサンプルを用いた種特異的なプローブベースのqPCRアッセイの使用には制限があります。例えば、テスト用の複数のアッセイの設計は、配列の可用性によって制限され、アッセイ性能の面で妥協が必要な場合があります。これらの選択は、研究の目標によって導かれ、結果26と報告されなければならない。例えば、希少種の検出が目標であり、陽性が少ない場合、すべての検出がシーケンシングによって検証されるならば、不完全な特異性(すなわち、非標的種の増幅)を伴うアッセイを使用することができる。目標が種の地理的範囲を監視する場合、eDNA濃度データが不要な場合、不完全な効率を持つアッセイを使用し、データはパーセント検出としてのみ報告されます。さらに、可能な限り不可能な実験室ですべての潜在的な特異性がテストされない限り、アッセイの真の特異性を絶対的な確実性をもって知ることはできません。例えば、アッセイはクリンチ川のいくつかの淡水ムール貝種に対して設計され、テストされました。このアッセイを別の河川システムで使用するには、新しい場所の種のスイートに対してテストする必要があります。アッセイの発生中に試験されない種または集団内の遺伝的変異も特異性に影響を及ぼす可能性がある。最後に、アッセイが高い技術的性能を有することが確認された場合でも。フィールドで作業すると、条件が変化します。水流、pH、動物の挙動などの非アッセイ関連条件は、異なるeDNA採取および抽出プロトコルを使用できるようにeDNA検出可能性を変化させる可能性があります。最適化され、よく説明されたアッセイを使用すると、そのようなパラメータがeDNA検出に及ぼす影響を理解しやすくなります。
eDNAの分野は、探索的分析の段階を超えて、方法や技術の標準化を高める段階で成熟しています。これらの開発により、eDNAの技術、能力、および制限に関する理解が深まりつつあります。上記の最適化プロセスにより、アッセイの感度、特異性、再現性が向上します。eDNA法の改良と標準化の最終目標は、eDNAデータに基づいて推論を行う研究者の能力を向上させるとともに、結果に対するエンドユーザーとステークホルダーの信頼を高めることです。

研究者や管理者は、種検出のための環境DNAアッセイの使用にますます関心を持つようになっています。30年にわたり、核酸1,2の配列特異的検出および定量化のために、定量的またはリアルタイムPCR(qPCR/rtPCR)が多数の分野で使用されてきました。eDNA研究の比較的新しい分野では、eDNAサンプルの体積または重量当たりの標的DNAのコピーを定量化するための標準曲線を用いたアッセイの使用が、今や日常的な実践となっている。ミトコンドリアのDNA配列は、ミトコンドリアゲノムが細胞当たり数千部に存在するため、一般にeDNAアッセイで標的とされているが、核DNAまたはRNA配列のアッセイも可能である。eDNAサンプルに対して公開されたアッセイは、必ずしも性能が等しいとは限らないということを理解することが重要です。標的種のDNA(特異性)と低量の標的DNA(すなわち、感度)の検出におけるアッセイの信頼性は、アッセイの設計、選択、最適化、試験方法の違いにより大きく異なる可能性があります。アッセイ性能の定量的尺度報告は以前はほとんど見落とされてきたが、最近ではアッセイ開発の透明性を向上させる基準が3、4、5、6、7、8に浮上している。
eDNA調査結果の設計と解釈の研究に役立つアッセイ性能の最適化と報告。非標的種DNAとの交差反応は偽陽性検出につながる可能性があるが、感度の低いアッセイは、サンプル中に存在する場合でも標的種DNAを検出できない可能性がある(偽陰性)。アッセイ感度と選択性を理解することは、希少種の検出に必要なサンプリング作業を知らせるのに役立ちます。eDNAには多くの自然な変動源があるため、eDNAアッセイ3を完全に最適化し、特性を付け込むなど、制御可能な変動源を可能な限り制限する必要があります。
アッセイの特異性や感度に直接影響する条件は、アッセイの性能を変えます。これは、異なる実験室の条件下で発生する可能性があります (すなわち、異なる試薬、ユーザー、機械など)。したがって、このプロトコルは、新しい条件下でアッセイを適用する際に再検討する必要があります。文献に良く特徴付けられるアッセイでさえ、新しい実験室で採用されたとき、または異なる試薬(例えば、マスターミックス溶液)5,9を使用する場合に、試験および最適化されるべきである。アッセイ特異性は、異なる地理的領域に適用されると変化する可能性があり、アッセイが検査されていない非標的種を含む新しい生物学的コミュニティからのサンプルにアッセイが適用されているため、標的種の遺伝的変異が生じる可能性がある。再び、アッセイは新しい場所で使用する場合に再評価されるべきである。フィールド PCR 阻害剤はサンプルに存在する可能性が高いため、フィールド条件は実験室の条件とは異なります。PCR阻害剤は、増幅反応に直接影響を与え、アッセイ性能に影響を与えます。このため、eDNAアッセイを開発する際には、内部の正のコントロールが必要です。
最後に、現場の環境条件は、標的種のDNA分子に影響を与え、DNA分解、輸送および保持を通じて捕捉する可能性があります。さらに、DNAの収集と抽出のための異なるプロトコルは、その効率とDNAを保持する能力が異なります。しかし、これらのプロセスはeDNAの検出可能性に影響を与えますが、分子アッセイの性能には影響しないことに注意することが重要です。したがって、フィールドサンプル中の標的種からのDNAの検出可能性は、qPCRアッセイの技術的性能と、フィールド条件および収集、保存、抽出プロトコルの両方の機能である。よく特徴付け、高度に実行アッセイを使用する場合、ユーザーはアッセイの能力に自信を持つことができます。研究者は、eDNA検出に影響を与える外部アッセイ因子(すなわち、環境変数、捕獲または抽出プロトコルの違い)の理解に集中できるようになりました。
ここでは、厳密な設計と最適化によるアッセイ技術性能に特に焦点を当てています。米国クリンチ川でサンプリングした水から淡水ムール貝(アクチナガイアス・靭帯)を検出するために開発されたプローブベースのアッセイを用いてプロトコルを実証します。最近、Thalingerら(2020)は、標的eDNAアッセイの検証のためのガイドラインを提示した。私たちのプロトコルに従ったアッセイ設計は、Thalingerらのレベル4にアッセイに加えて、レベル5 6に向けた追加のステップをもたらすでしょう。この時点で、アッセイの技術的性能が最適化され、実験室および現場でのアプリケーションでの定期的な使用に備える。実験室でのアッセイのさらなる使用、メソコスム、およびフィールド実験は、次に、eDNA検出および検出性に影響を与える因子に関する質問に対処することができる、レベル5検証6のための最終ステップ。

<table><tbody><tr><td>96 Place Reversible Racks with Covers</td><td>Globe Scientific</td><td>456355AST</td><td></td></tr><tr><td>Clean gloves (ie. latex, nitrile, etc.)</td><td>Kimberly-Clark</td><td>43431, 55090</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td><td>Bio-Rad</td><td>1855196</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>5408129</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>2681332</td><td></td></tr><tr><td>Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear</td><td>Bio-Rad</td><td>#HSP9601</td><td></td></tr><tr><td>IPC forward and reverse primers</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td>none</td><td>custom product</td></tr><tr><td>IPC PrimeTime qPCR Probes</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td>none</td><td>custom product</td></tr><tr><td>IPC Ultramer DNA Oligo synthetic template</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td>none</td><td>custom product</td></tr><tr><td>Labnet MPS 1000 Compact Mini Plate Spinner Centrifuge for PCR Plates</td><td>Labnet</td><td>C1000</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge machine</td><td>Various</td><td>-</td><td>Any microcentrifuge machine that hold 1.5mL and 2.0mL tubes is typically okay.</td></tr><tr><td>Microseal &#039;B&#039; PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips GP LTS 1000 &amp;micro;L F 768A/8</td><td>Rainin</td><td>30389272</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips GP LTS 20 &amp;micro;L F 960A/10</td><td>Rainin</td><td>30389274</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips GP LTS 200 &amp;micro;L F 960A/10</td><td>Rainin</td><td>30389276</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Rainin</td><td>Various</td><td>Depending on lab preference, manual or electronic pipettes can be used at various maximum volumes.</td></tr><tr><td>TaqMan Environmental Master Mix 2.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4396838</td><td></td></tr><tr><td>Target forward and reverse primers</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td>none</td><td>custom product</td></tr><tr><td>Target PrimeTime qPCR Probes</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td>none</td><td>custom product</td></tr><tr><td>Target synthetic gBlock gene fragment</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td>none</td><td>custom product. used for qPCR standard dilution series</td></tr><tr><td>TE Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>AM9849</td><td></td></tr><tr><td>VORTEX-GENIE 2 VORTEX MIXER</td><td>Fisher Scientific</td><td>50728002</td><td></td></tr></tbody></table>

development and testing of species-specific quantitative pcr assays for environmental dna applications

漁業や野生動物保護管理を支援するために、種の存在を検出し、監視するための新しい非侵襲的な方法が開発されています。マクロビオタを検出するための環境DNA(eDNA)サンプルの使用は、急速に普及し、国家管理プログラムで実施されている方法の一つです。ここでは、プローブベースの定量PCR(qPCR)アプリケーションに対する種特異的標的アッセイの開発に焦点を当てています。プローブベースのqPCRを使用すると、プライマー単独で可能な限り特異性が高くなります。さらに、サンプル中のDNAの量を定量化する能力は、eDNAの生態と、現場におけるeDNA検出パターンの解釈を理解するのに役立ちます。環境試料から標的種を検出する感度と特異性を確保するために、これらのアッセイの開発と試験には慎重に検討が必要です。このプロトコルでは、標的種の検出のためのプローブベースのアッセイを設計およびテストするために必要な手順を説明します。シーケンスデータベースの作成、アッセイ設計、アッセイの選択と最適化、テストアッセイ性能、フィールド検証など。これらの手順に従うと、効率的で、敏感で、かつ、信頼できる特定のアッセイを実現するのに役立ちます。このプロセスは、米国クリンチ川で見られる淡水ムール貝種であるマケット(アクチナガイアス・シネラシナ)の集団のために設計されたアッセイで実証しています。

Watch this Scientific Journal Video about Development and Testing of Species-specific Quantitative PCR Assays for Environmental DNA Applications at JoVE.com

Development and Testing of Species-specific Quantitative PCR Assays for Environmental DNA Applications

環境DNAアッセイでは、現場データの収集を開始する前に、厳格な設計、テスト、最適化、検証が必要です。ここでは、環境試料から標的種DNAの検出と定量を行うための、種特異的なプローブベースのqPCRアッセイを設計する各ステップを通じてユーザーを取るプロトコルを提示する。

環境DNA応用に関する種特異的定量PCRアッセイの開発と試験

New, non-invasive methods for detecting and monitoring species presence are being developed to aid in fisheries and wildlife conservation management. The ...

development-testing-species-specific-quantitative-pcr-assays-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Environment

12.7K ビュー.  U.S. Geological Survey. 環境DNAアッセイでは、現場データの収集を開始する前に、厳格な設計、テスト、最適化、検証が必要です。ここでは、環境試料から標的種DNAの検出と定量を行うための、種特異的なプローブベースのqPCRアッセイを設計する各ステップを通じてユーザーを取るプロトコルを提示する。

ビデオ: Development and Testing of Species-specific Quantitative PCR Assays for Environmental DNA Applications

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated HF183 marker. The EntHF183 duplex dPCR (referred as EntHF183 dPCR hereon) assay uses the same primer and probe sequences as its published individual quantitative PCR (qPCR) counterparts. Likewise, the same water filtration and DNA extraction procedures as performed prior to qPCR are followed prior to running dPCR. However, the duplex dPCR assay has several advantages over the qPCR assays. Most important, the dPCR assay eliminates the need for running a standard curve and hence, the associated bias and variability, by direct quantification of its targets. In addition, while duplexing (i.e. simultaneous quantification) Enterococcus and HF183 in qPCR often leads to severe underestimation of the less abundant target in a sample, dPCR provides consistent quantification of both targets, whether quantified individually or simultaneously in the same reaction. The dPCR assay is also able to tolerate PCR inhibitor concentrations that are one to two orders of magnitude higher than those tolerated by qPCR. These advantages make the EntHF183 dPCR assay particularly attractive because it simultaneously provides accurate and repeatable information on both general and human-associated fecal contamination in environmental waters without the need to run two separate qPCR assays. Despite its advantages over qPCR, the upper quantification limit of the dPCR assay with currently available instrumentation is approximately four orders of magnitude lower than that achievable by qPCR. Consequently, dilution is needed for measurement of high concentrations of target organisms such as those typically observed following sewage spills.

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay that can be used to simultaneously quantify Enterococcus spp. and the HF183 genetic markers as indicators of general and human-associated fecal contamination in recreational waters.

の同時定量のための二重デジタルPCRアッセイ<em&gt;エンテロコッカス属。</em&gt;およびWatersにおけるヒトの糞便関連HF183マーカー

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

環境学

Simultaneous DNA-RNA Extraction from Coastal Sediments and Quantification of 16S rRNA Genes and Transcripts by Real-time PCR

Real Time Polymerase Chain Reaction also known as quantitative PCR (q-PCR) is a widely used tool in microbial ecology to quantify gene abundances of taxonomic and functional groups in environmental samples. Used in combination with a reverse transcriptase reaction (RT-q-PCR), it can also be employed to quantify gene transcripts. q-PCR makes use of highly sensitive fluorescent detection chemistries that allow quantification of PCR amplicons during the exponential phase of the reaction. Therefore, the biases associated with &#39;end-point&#39; PCR detected in the plateau phase of the PCR reaction are avoided. A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. First, a method for the co-extraction of DNA and RNA from coastal sediments, including the additional steps required for the preparation of DNA-free RNA, is outlined. Second, a step-by-step guide for the quantification of 16S rRNA genes and transcripts from the extracted nucleic acids via q-PCR and RT-q-PCR is outlined. This includes details for the construction of DNA and RNA standard curves. Key considerations for the use of RT-q-PCR assays in microbial ecology are included.

A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. The methodology includes the co-extraction of DNA and RNA; preparation of DNA-free RNA; and 16S rRNA gene and transcript quantification via RT-q-PCR, including standard curve construction.

リアルタイムPCRによる沿岸堆積物および定量16SのrRNA遺伝子と転写物からの同時DNA-RNA抽出

Real Time Polymerase Chain Reaction also known as quantitative PCR (q-PCR) is a widely used tool in microbial ecology to quantify gene abundances of ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as tumors. Because digital polymerase chain reactions (PCR) enable the precise quantification of DNA copy number variants, they are becoming an essential tool for detecting rare genetic variations, such as drug-resistant mutations. It is expected that molecular diagnoses using digital PCR (dPCR) will be available in clinical practice in the near future; thus, how to efficiently conduct dPCR with human genetic material is a hot topic. Here, we introduce a method to detect Adenomatous polyposis coli (APC) somatic mosaicism using dPCR with the chip-in-a-tube format, which allows eight dPCR reactions to be simultaneously conducted. Care should be taken when filling and sealing the reaction mixture on the chips. This article demonstrates how to avoid the over- and underestimation of positive partitions. Furthermore, we present a simple procedure for collecting the dPCR product from the partitions on the chips, which can then be used to confirm the specific amplification. We hope that this methods report will help promote the dPCR with the chip-in-a-tube method in genetic research.

Digital polymerase chain reaction (PCR) is a useful tool for the high-sensitivity detection of single nucleotide variants and DNA copy number variants. Here, we demonstrate key considerations for measuring rare variants in the human genome using digital PCR with the chip-in-a-tube format.

チップ チューブ形式を使用して散発的な家族性大腸腺腫症患者の遺伝的変異のデジタル ポリメラーゼ連鎖反応分析

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

がん研究

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation into thousands of nano-sized water-in-oil individual reactions. Recently, ddPCR has become one of the most accurate and sensitive tools for circulating tumor DNA (ctDNA) detection. One of the major limitations of the standard ddPCR technique is the restricted number of mutations that can be screened per reaction, as specific hydrolysis probes recognizing each possible allelic version are required. An alternative methodology, the drop-off ddPCR, increases throughput, since it requires only a single pair of probes to detect and quantify potentially all genetic alterations in the targeted region. Drop-off ddPCR displays comparable sensitivity to conventional ddPCR assays with the advantage of detecting a greater number of mutations in a single reaction. It is cost-effective, conserves precious sample material, and can also be used as a discovery tool when mutations are not known a priori.

Here, we present a protocol to accurately quantify multiple genetic alterations of a target region in a single reaction using drop-off ddPCR and a unique pair of hydrolysis probes.

ホット スポット領域の変異の包括的かつ同時検出のための単一液滴デジタル ポリメラーゼの連鎖反応

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

遺伝学

Digital-Droplet PCR to Detect Indels Mutations in Genetically Modified Anopheline Mosquito Populations

Recent advances in mosquito genomics and genetic engineering technologies have fostered a need for quick and efficient methods for detecting targeted DNA sequence variation on a large scale. Specifically, detecting insertions and deletions (indels) at gene-edited sites generated by CRISPR guide RNA (gRNA)/Cas9-mediated non-homologous end-joining (NHEJ) is important for assessing the fidelity of the mutagenesis and the frequency of unintended changes. We describe here a protocol for digital-droplet PCR (ddPCR) that is well-suited for high-throughput NHEJ analysis. While this method does not produce data that identifies individual sequence variation, it provides a quantitative estimate of the sequence variation within a population. Additionally, with appropriate resources, this protocol can be implemented in a field-site laboratory setting more easily than next-generation or Sanger sequencing. ddPCR also has a faster turn-around time for results than either of those methods, which allows a more quick and complete analysis of genetic variation in wild populations during field trials of genetically-engineered organisms.

This protocol provides the steps from DNA extraction to experimental set-up for digital droplet PCR (ddPCR), including analysis for the identification and quantification of non-homologous end-joining (NHEJ) events at target sites following gRNA-induced Cas9 cleavage and DNA repair. Other uses of this method include applications such as polymorphism detection and gene-editing variant verification.

遺伝子組み換えアノフェリン蚊集団におけるインデル変異を検出するデジタル液滴PCR

Recent advances in mosquito genomics and genetic engineering technologies have fostered a need for quick and efficient methods for detecting targeted DNA ...

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and animal tissues (Figure 1). Direct PCR is based on specially engineered Thermo Scientific Phusion and Phire DNA Polymerases, which include a double-stranded DNA binding domain that gives them unique properties such as high tolerance of inhibitors.
PCR-based target DNA detection has numerous applications in plant research, including plant genotype analysis and verification of transgenes. PCR from plant tissues traditionally involves an initial DNA isolation step, which may require expensive or toxic reagents. The process is time consuming and increases the risk of cross contamination1, 2. Conversely, by using Thermo Scientific Phire Plant Direct PCR Kit the target DNA can be easily detected, without prior DNA extraction. In the model demonstrated here, an example of derived cleaved amplified polymorphic sequence analysis (dCAPS)3,4 is performed directly from Arabidopsis plant leaves. dCAPS genotyping assays can be used to identify single nucleotide polymorphisms (SNPs) by SNP allele-specific restriction endonuclease digestion3. 
Some plant samples tend to be more challenging when using Direct PCR methods as they contain components that interfere with PCR, such as phenolic compounds. In these cases, an additional step to remove the compounds is traditionally required2,5. Here, this problem is overcome by using a quick and easy dilution protocol followed by Direct PCR amplification (Figure 1). Fifteen year-old oak leaves are used as a model for challenging plants as the specimen contains high amounts of phenolic compounds including tannins. 
Gene transfer into mice is broadly used to study the roles of genes in development, physiology and human disease. The use of these animals requires screening for the presence of the transgene, usually with PCR. Traditionally, this involves a time consuming DNA isolation step, during which DNA for PCR analysis is purified from ear, tail or toe tissues6,7. However, with the Thermo Scientific Phire Animal Tissue Direct PCR Kit transgenic mice can be genotyped without prior DNA purification. In this protocol transgenic mouse genotyping is achieved directly from mouse ear tissues, as demonstrated here for a challenging example where only one primer set is used for amplification of two fragments differing greatly in size.

The Direct PCR approach presented here facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified plant and animal tissue.

前のDNA精製せずに植物や動物のサンプルの遺伝子型

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and ...

生物学

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to quantify DNA sample concentration using a standard curve. In this manuscript, a detailed protocol for developing and implementing a real-time quantitative recombinase polymerase amplification assay (qRPA assay) is provided. Using HIV-1 DNA quantification as an example, the assembly of real-time RPA reactions, the design of an internal positive control (IPC) sequence, and co-amplification of the IPC and target of interest are all described. Instructions and data processing scripts for the construction of a standard curve using data from multiple experiments are provided, which may be used to predict the concentration of unknown samples or assess the performance of the assay. Finally, an alternative method for collecting real-time fluorescence data with a microscope and a stage heater as a step towards developing a point-of-care qRPA assay is described. The protocol and scripts provided may be used for the development of a qRPA assay for any DNA target of interest.

Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.

内部陽性対照との定量的リコンビナーゼポリメラーゼ増幅アッセイの開発

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...

低MW遺伝子の濃縮による環境AMR評価の効率的化技術

Enhanced Extraction of Low-Molecular Weight DNA from Wastewater for Comprehensive Assessment of Antimicrobial Resistance

Environmental surveillance is recognized as an important tool for assessing public health in the post-pandemic era. Water, in particular wastewater, has emerged as the source of choice to sample pathogen burdens in the environment. Wastewater from open drains and community water treatment plants is a reservoir of both pathogens and antimicrobial resistance (AMR) genes, and frequently comes in contact with humans. While there are many methods of tracking AMR from water,&#160;isolating good-quality DNA at high yields from heterogeneous samples remains a challenge. To compensate, sample volumes often need to be high, creating practical constraints. Additionally, environmental DNA is frequently fragmented, and the sources of AMR (plasmids, phages, linear DNA) consist of low-molecular-weight DNA. Yet, few extraction processes have focused on methods for high-yield extraction of linear and low-molecular-weight DNA. Here, a simple method for high-yield linear DNA extraction from small volumes of wastewater using the precipitation properties of polyethylene glycol (PEG) is reported. This study makes a case for increasing overall DNA yields from water samples collected for metagenomic analyses by enriching the proportion of linear DNA. In addition, enhancing low-molecular-weight DNA overcomes the current problem of under-sampling environmental AMR due to a focus on high-molecular-weight and intracellular DNA. This method is expected to be particularly useful when extracellular DNA exists but at low concentrations, such as with effluents from treatment plants. It should also enhance the environmental sampling of AMR gene fragments that spread through horizontal gene transfer.

著者スポットライト:培養ベースの技術とゲノミクスの組み合わせによる環境中の抗菌薬耐性の理解と検出

Here, we present a simple technique to assess environmental antimicrobial resistance (AMR) by enhancing the proportion of low-molecular-weight extracellular DNA. Prior treatment with 20%-30% PEG and 1.2 M NaCl allows detection of both genomic and horizontally transferred AMR genes. The protocol lends itself to a kit-free process with additional optimization.

抗菌薬耐性の包括的評価のための廃水からの低分子量DNAの抽出の強化 

Environmental surveillance is recognized as an important tool for assessing public health in the post-pandemic era. Water, in particular wastewater, has ...

環境DNA応用に関する種特異的定量PCRアッセイの開発と試験

要約

さらに動画を探す

この動画の章

の同時定量のための二重デジタルPCRアッセイ

リアルタイムPCRによる沿岸堆積物および定量16SのrRNA遺伝子と転写物からの同時DNA-RNA抽出

チップチューブ形式を使用して散発的な家族性大腸腺腫症患者の遺伝的変異のデジタルポリメラーゼ連鎖反応分析

ホットスポット領域の変異の包括的かつ同時検出のための単一液滴デジタルポリメラーゼの連鎖反応

遺伝子組み換えアノフェリン蚊集団におけるインデル変異を検出するデジタル液滴PCR

前のDNA精製せずに植物や動物のサンプルの遺伝子型

内部陽性対照との定量的リコンビナーゼポリメラーゼ増幅アッセイの開発

抗菌薬耐性の包括的評価のための廃水からの低分子量DNAの抽出の強化

抗菌薬耐性の包括的評価のための廃水からの低分子量DNAの抽出の強化

抗菌薬耐性の包括的評価のための廃水からの低分子量DNAの抽出の強化

環境DNA応用に関する種特異的定量PCRアッセイの開発と試験

要約

さらに動画を探す

この動画の章

の同時定量のための二重デジタルPCRアッセイ

リアルタイムPCRによる沿岸堆積物および定量16SのrRNA遺伝子と転写物からの同時DNA-RNA抽出

チップ チューブ形式を使用して散発的な家族性大腸腺腫症患者の遺伝的変異のデジタル ポリメラーゼ連鎖反応分析

ホット スポット領域の変異の包括的かつ同時検出のための単一液滴デジタル ポリメラーゼの連鎖反応

遺伝子組み換えアノフェリン蚊集団におけるインデル変異を検出するデジタル液滴PCR

前のDNA精製せずに植物や動物のサンプルの遺伝子型

内部陽性対照との定量的リコンビナーゼポリメラーゼ増幅アッセイの開発

抗菌薬耐性の包括的評価のための廃水からの低分子量DNAの抽出の強化

抗菌薬耐性の包括的評価のための廃水からの低分子量DNAの抽出の強化

抗菌薬耐性の包括的評価のための廃水からの低分子量DNAの抽出の強化

チップチューブ形式を使用して散発的な家族性大腸腺腫症患者の遺伝的変異のデジタルポリメラーゼ連鎖反応分析

ホットスポット領域の変異の包括的かつ同時検出のための単一液滴デジタルポリメラーゼの連鎖反応