脂肪由来幹細胞の単離および増殖は、いくつかのダウンストリームアプリケーションおよび実験技術に使用できる多数の幹細胞を生成します。このプロトコルにおける分化脂肪細胞の主な使用目的は、インスリン刺激グルコース取り込み、脂質生成、および刺激脂肪分解などの代謝アッセイです。まず、バイオセーフティフードとすべてのツールを消毒して、無菌の作業環境を作ります。
約10ミリリットルの5つのPBSバッファーを4つの100ミリメートル細胞培養皿にピペットで入れます。50グラムの脂肪サンプルを皿の1つに移し、5つのPBSを含む他の皿に順次移して4回洗浄します。次に、洗浄した脂肪組織を清潔な100ミリメートルの培養皿に移し、ハサミまたは滅菌鉗子を使用して完全にミンチします。
ミンチ組織の1〜3センチメートルの切片を、13ミリリットルのコラゲナーゼバッファーを含む50ミリリットルの円錐管に移します。培養皿から残った組織を2ミリリットルのコラゲナーゼバッファーですすぎ、総容量15ミリリットルを確保します。25ミリリットルの血清学的ピペットを使用してサンプルを完全に混合し、ロッカー上で摂氏37度でチューブを30〜60分間インキュベートします。
酵素活性を中和するために、インキュベーション後に10ミリリットルのADSC増殖培地をチューブに加え、それをピペットでよく混合して組織凝集体を分離する。液体部分を新しい滅菌50ミリリットルの円錐管に移し、固体組織を残す。7ミリリットルの2つのPBSを使用して組織を3回洗浄し、液体を新しいチューブに移します。
次に、チューブを500倍Gで5分間遠心分離し、ペレットを乱さずにできるだけ多くの上清を注意深く取り除きます。ペレットを1ミリリットルの1X赤血球またはRBC溶解バッファーに再懸濁し、室温で10分間インキュベートします。次に、5ミリリットルのADSC増殖培地をチューブに加え、遠心分離して上清を除去して細胞を2回洗浄します。
最後の洗浄後、ペレットを2ミリリットルのADSC増殖培地に再懸濁し、70ミクロンのセルストレーナーを通して滅菌された50ミリリットルのコニカルチューブにろ過します。さらに2ミリリットルの培地でストレーナーをすすぎ、4ミリリットルの懸濁液を滅菌済みの100ミリリットルの培養皿に移します。円錐管を3ミリリットルの培地で2回すすぎ、培養皿に総容量10ミリリットルを回収する。
採取した細胞を倒立顕微鏡で倍率10倍で観察し、浮遊細胞がないか確認します。摂氏37度、二酸化炭素5%、相対湿度100%の二酸化炭素インキュベーターで細胞を24時間インキュベートします。培地の無菌性を確保するために、培地のみを含むプレートを含める。
24時間後、倒立顕微鏡下で細胞を観察し、細胞接着を確認します。細胞が80〜90%コンフルエントになるまで、48時間ごとに培地を取り出し、温かい培地と交換します。増殖のために、コンフルエントなADSC細胞から増殖培地を取り除き、2ミリリットルの滅菌室温PBSで2回洗浄します。
PBSを吸引し、プレートの表面積全体を覆うように、各培養プレートに2ミリリットルの0.25%トリプシンEDTAを加えます。プレートを摂氏37度と5%の二酸化炭素で7分間インキュベートし、トリプシン処理された細胞を強制的にピペッティングして機械的に取り除きます。2ミリリットルのADSC増殖培地を加え、細胞を穏やかに混合します。
細胞を50ミリリットルの円錐管に移し、プレートからの細胞回収を最大化するために、追加の2ミリリットルの培地で皿をすすぎます。次に、チューブを室温で5分間500倍Gで遠心分離し、上清をデカントして菌体ペレットを得た。細胞ペレットを100万細胞あたり5〜6ミリリットルのADSC増殖培地に再懸濁します。
血球計算盤を使用して細胞をカウントし、テキスト原稿に記載されているようにそれらをプレートします。細胞が80〜90%のコンフルエントに達したら、増殖培地を吸引し、滅菌室温PBSで細胞をすすぎ、次に10ミリリットルのADSC分化培地を追加します。約14〜21日間、3日ごとに培地を交換してください。
倒立顕微鏡下で細胞に脂肪滴が存在することを40倍の倍率で観察します。成熟脂肪細胞は一般に14日後に観察されます。メッキの日、ADSCは非接着性であり、文化に浮かんでいました。
細胞は72時間後に80%コンフルエントになり、脂肪細胞分化の準備ができていました。ADSC分化の14日後、成熟脂肪細胞は40倍の倍率で観察された強い脂肪生成特性を示しました。14日目に、細胞を染色し、脂肪滴の可視化のためにオイルレッドOおよびBODIPYで固定した。
分化した脂肪細胞は20倍の倍率で観察することができた。このプロトコルを試みる場合、無菌作業環境は、脂肪由来幹細胞の健全な分離、適切な増殖、および効率的な分化にとって重要であることを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、これらの細胞は、グルコース取り込み、脂質生成、および私たちの研究の主要な焦点である脂肪分解などのいくつかの代謝アッセイに使用できます。
この技術により、慢性アルコールとSIVが脂肪細胞の代謝能力にどのように影響するかを調査できます。
