この方法は、リンパ内皮細胞への損傷を最小限に抑えてリンパ流を遮断し、遮断タイミングを正確に制御することで、リンパ流がリンパ節における恒常性および免疫応答にどのような影響を与えるかを調べることができる。この手順のデモンストレーションを手伝うのが、私の研究室の大学院生である景納徐さんです。注入装置を準備するために、ポリエチレンチューブのおよそ30センチメートルを切断する。
針Aの先端をチューブの一端に接続します。別の針を慎重に取り外し、壊れた側をポリエチレンチューブのもう一方の端に接続します。その後、針Aを1ミリリットルの結核注射器に取り付けます。
使用直前に、10:1ケタミンキシラジン混合物を生理食前に調製する。腹腔内にケタミン/キシラジン混合物を250マイクロリットル注入してマウスを麻酔した後、つま先ピンチで完全な麻酔を確実にする。毛のバリカンで脚の周りの毛皮を剃り、脚の周りに脱毛クリームを適用します。
5分後、湿った組織を使用して残留ファーと脱毛クリームを拭き取り、滅菌水で脚をきれいにします。脚の周りに70%エタノールをスプレーして、手術領域を殺菌します。マウスを起こしやすい位置に置き、外科用テープを使用して右脚の手術領域を露出させます。
皮内に1%エバンスブルー染料の5マイクロリットル、または注射装置から9センチメートルの液体をマウスの右足パッドに注入する。静かにリンパ管に入る流体を助けるためにフットパッドをマッサージします。解剖顕微鏡の下で、大窩窩の下端から5ミリメートルの切開部位を見つける。
はさみを使用して、長さ約5ミリメートルの小さな切開を行います。その後、細かい操作鉗子を使用して切開を伸ばし、採取したリンパ管を露出させます。大窩リンパ節に至る両血管の同定。
針ホルダーを使用して、眼下リンパ管と伏状動脈の間に縫合針を慎重に挿入する。軽く、尿管のリンパ管の周りに針を引き出します。縫合糸弦を慎重に引っ張り、縫合糸の約2センチメートルを後ろに残します。
針ホルダーを使用して、外科医の結び目を結ぶのに役立ちます。エバンスブルー染料が縫合部位を通過しないようにフットパッドを穏やかにマッサージし、余分なひもをはさみで切ります。他の不フェレンチン性リンパ管を縫合し、リンパ管に使用したのと同じ縫合糸で皮膚切開部を閉じる。
シャムコントロールのために、皮内に左足パッドに1%エバンスブルー染料の5マイクロリットルを注入し、フットパッドをマッサージする。切開で皮膚を開き、血管を縫合せずに傷口を閉じます。マウスの手術後にマウスを監視する場合、右足は浮腫を示し、エバンスブルー染料は太ももに広がり、コントロールレッグにはエバンスブルーの染料がフットパッドに制限されていることが示されます。
手術直後、右足パッドと左パッドの両方に2%FITCの10マイクロリットルを皮内に注入する。FITC注射の2、6、および12時間後に、安楽死させたマウスの窩から亜大リンパ節を採取する。pRNの周りには、ペリノダル脂肪組織を慎重に取り除いてください。
pRNを最適な切断温度化合物に埋め込み、髄質洞領域をクライオモールドの側面に向けます。凍結煙を使用して、20ミクロンの凍結したセクションを準備します。pRN 内の FITC 分布を決定するには、共焦点顕微鏡の下でクライオセクションを画像化します。
FITC注射の2、6、および12時間後に撮影された共焦点画像は、不同性リンパ管を縫合した後の、大小リンパ節におけるFITC蓄積を大幅に減少させた。pRN中の残留FITCは、リンパ節副鼻腔に優先的に蓄積された。リンパ管が縫合によって閉塞されると、リンパ節脂肪組織の共焦点画像が示され、リンパ節が副鼻腔化するとFITCが組織に入るが、リンパ節全体に効果的に分布していない。
この方法を試みるとき、血管とリンパ血管の間に縫合針を挿入することが重要であることを覚えておくことが重要です。このステップの失敗は、船舶を壊す可能性があります。この方法を行った後、感染または他の免疫刺激を有するマウスを免疫し、リンパ流が免疫保護を調節する方法を研究することが可能である。
リンパ流の機能はよく理解されていない。この方法は、リンパ流がない場合のリンパ節における細胞の移動を研究するために使用することができる。
