この研究は、NIH助成金R01GM080376、R35GM118139、NSFメカノバイオロジーCMMI:15-48571からY.E.G.、およびNIAIDの博士前NRSAフェローシップF30AI114187によってサポートされました.M

注: すべての手順は、一般的なラボスペースで完了できます。
1. ガラスカバースリップクリーニング
<ol><li>コロイド粒子の蒸発堆積のためのきれいな表面を提供するために、24 x 30 mmの光学ホウケイ酸ガラスカバーリップ(0.16-0.19 mm厚さ)を、コプリンガラス染色瓶の溝付きインサート内に配置して洗浄します。 注: クリーニングプロセス中にすべての表面がはっきりと露出するように、カバーリップが直立し、十分に分離されていることを確認してください。</li>
	<li>染色瓶に十分なアセトンを注ぎ、カバーを覆い、カバーを置き、40°Cで10分間超音波処理します。</li>
	<li>アセトンを注ぎ、染色した瓶に蒸留したH2Oを充填し、水を注いでカバーリップをすすいだ。さらに2回繰り返します。</li>
	<li>アセトン超音波処理(ステップ1.2と1.3)をもう一度繰り返します。</li>
	<li>40°Cで20分間カバーリップと超音波処理をカバーするのに十分な200 mM KOHを瓶に注ぎます。 注:KOHはガラスを少しエッチングします。</li>
	<li>蒸留したH2Oを6回でカバーリップをすすいでください。</li>
	<li>カバーリップを覆うエタノールを加え、蓋を加え、40°Cで10分間超音波処理します。</li>
	<li>蒸留したH2Oを3回でカバーリップをすすいでください。</li>
	<li>穏やかな鉗子を使用して端の各カバースリップを拾い、N2 ガスでカバースリップを乾燥させる。カバースリップの端だけをタッチします。乾燥した洗浄されたカバーリップをそれぞれ、個々のきれいなペトリ皿に入れます。</li>
</ol>2. ポリスチレンビーズの蒸発蒸着
<ol><li>ZMWアレイ用のコロイド結晶マスクを作成するために、直径1μmの遠心分離機50μL、非機能化ポリスチレンビーズ(水中2.5%w/v)を15,000xg、25°Cで5分間作成した。 注:ビーズをピペットする前に、ビーズがボトルの底に落ち着いた場合に備えて、ストック液を短時間渦に入れる必要があります。</li>
	<li>上清を捨て、残りの水はできるだけ少なくします。 注:残留水はエタノール再懸濁液39の蒸発特性を変化させることができるので、すべての水を除去するために少量のビーズを除去することは許容される。</li>
	<li>ステップ2.2からビーズを50 μLの1:400 TritonX-100:エタノール溶媒で再懸濁します。ピペットを数回上下にして、ビーズと溶媒を完全に混合します。 注:TritonX-100:エタノール溶媒は、使用後パラフィンフィルムで密封し、月に一度新鮮に調製する必要があります。ビーズは、マイクロ遠心チューブなどのプラスチック容器の側面に付着する傾向があるため、側面に沿ってピペットがすべてのビーズを再懸濁するようにします。</li>
	<li>堆積のための湿度室を設置するには、蓋がわずかにアジャールを残したラインのベンチに、それぞれ1つのカバースリップを備えた6ペトリ皿を置きます。各皿で、次のステップで湿度が上がったときにカバーリップが環境にさらされるように、カバースリップを開いた領域に移動させます。</li>
	<li>ペトリ皿の後ろに湿度計と小さな扇風機を置きます。</li>
	<li>開始相対湿度 (RH) をラボに記録します。200 mL ビーカーに約75°Cの水150~200 mLを充填し、ファンの後ろに置きます。</li>
	<li>ファンの電源を入れ、ペトリ皿、ファン、ビーカー、湿度計を覆い、透明なプラスチック製の収納容器(66cm x 46 cm x 38 cm)で覆います。</li>
	<li>チャンバー内のRHを70-75%に上昇させ、通常は5-10分かかります。 注:アンビエントラボRHが低い(〜50%未満)場合は、チャンバーが高いRHに到達しますが、堆積中の湿度の損失を補うために80%以下にします(下記参照)。</li>
	<li>RHが70-75%に達したら、RHを記録し、プラスチック製の貯蔵容器をわずかに持ち上げて、カバーをペトリ皿に素早く置き、カバースリップの過度の濡れを防ぎます。 注: チャンバー内の温度は、加湿の結果として室温(通常は25-26 °C)よりもわずかに暖かくなります。カバーリップに水分が見える場合は、ガラス表面が濡れ過ぎる。商用グローブボックスは、プロトコルのこの部分を簡素化する可能性があります。</li>
	<li>チャンバー内のRHは85%まで上昇し続けます。その時点で、湿度チャンバにRHを記録し、各カバースリップの中央にビーズサスペンションのピペット5μLを記録します。</li>
	<li>湿度の損失を最小限に抑えるために、各堆積物の後にチャンバーとペトリ皿を閉じます。2分以内に6つの堆積物をすべて仕上げるようにしてください。</li>
	<li>堆積後のチャンバーにRHを記録します。 注: 堆積後の RH は、周囲の実験室の条件に依存する堆積中にどのくらいの速さで湿度が失われたかを測定するのに役立ちます。典型的な成功した走行のために、チャンバは堆積の前に85%RHで始まり、堆積後70-75%RHで終わる。</li>
	<li>ビーズの液滴を広げて5分間乾燥させます。 注:コロイド結晶が多くの穴や多層領域を持っている場合、チャンバーはそれぞれ湿度が高すぎたか乾燥している可能性があります。ペトリ皿を閉じる相対湿度を調整し、堆積を開始します(最適化の詳細については、結果セクションを参照)。</li>
</ol>3. コロイド結晶テンプレートで毛穴のサイズを小さくするためのビーズアニーリング
<ol><li>ビーズ間のインタースティックスを狭め、インタースティックスのコーナーを丸めるポリスチレンビーズのアニーリングのための均一な温度表面を提供するために、標準的なセラミックホットプレートの上に平らな、粉砕されたアルミニウム板を置きます。</li>
	<li>ホットプレートの温度を107°Cに設定し、ポリスチレン40のガラス転移温度に設定する。 注: 安定した正確な温度を得るために、熱電対プローブは幅2~3mm、アルミニウム板の深さ4~5mmの穴に保持されています。</li>
	<li>ホットアルミプレートにビーズテンプレートを含むカバースリップを20sのアニールに置きます(融解時間の説明については、説明セクションを参照)。</li>
	<li>加熱後、カバースリップをアルミニウム板から取り出し、速やかに別の室温アルミニウム表面に置いて冷却します。 注:カバーリップのピックアップを容易にするために、カバーリップがプレートの端に少し掛かっているか、またはプレートに浅いチャネル(付属のビデオを参照)を持っている方が便利です。</li>
</ol>4. コロイド結晶テンプレートを用いたアルミニウムゼロモードの導波管のナノファブリケーション
<ol><li>熱または電子ビーム蒸発堆積を使用して、300nmの銅をコロイド結晶テンプレート上に2Å/sに堆積させ、ビーズ間補間にポストを生成します。</li>
	<li>テープで表面を軽く押して、ビーズの上に余分な金属を取り除きます。テープをゆっくりと剥がして金属を引き離します。 注:テーププル後に反射過剰な金属の小さなパッチが残ることがあり、これらはしばしばN2 ガスの流れによって除去することができます。テーププル後に反射過剰金属の相当なパッチが残っている場合は、ポリスチレンビーズを部分的に溶解させるために2時間トルエンにテンプレートを浸してみてください。カバーリップを蒸留水で洗い、N2で乾かしてからテープを引き抜きます。追加の浸漬は、ビーズがテーププル中の損傷からポストを保護するのに役立つため、ビーズを完全に溶解しないでください。</li>
	<li>ポリスチレンビーズを溶解するには、ビーズテンプレートをトルエンに入れ、一晩浸します。 注意:トルエン煙は有毒である可能性があります。換気の良いフードの下でトルエンを使用し、手袋、安全メガネ、ラボコートなどの個人用保護具を着用してください。トルエンは、可燃性液体用に指定された換気キャビネットに保管する必要があります。</li>
	<li>トルエンインキュベーション後、テンプレートをクロロホルムで1回、エタノールで2回リンスします。繊細な200-300 nmの高さの金属の柱が露出しているので、この時点で慎重にカバーリップを扱います。テンプレートをN2 で乾燥させ、酸素プラズマクリーナーの残留ポリマーと汚染物質を30分間除去します。 注意:クロロホルムの煙は有毒である可能性があります。換気の良いフードの下でクロロホルムを使用し、手袋、安全メガネ、ラボコートなどの個人用保護具を着用してください。クロロホルムは、他の可燃性溶剤から離れた換気キャビネットに保管する必要があります。</li>
	<li>熱または電子ビーム蒸着を使用して、チタン付着層の3nmを1Å/sに堆積させ、その後、銅ポストの周りと上に4Å/ sで100-150 nmのアルミニウムを堆積させます。 注:より厚いクラッディングを使用して、より深いガイドを取得し、バックグラウンド蛍光をより良く減衰させることができますが、これはまた、次のステップで投稿を公開して溶解した後の収量を減少させます(説明セクションを参照)。</li>
	<li>金属ポストを溶解するには、カバーリップを銅エッチャント(クエン酸ベース)に浸します。 資料一覧)2時間。 注意:金属エッチャントは皮膚の火傷を引き起こす可能性があります。換気の良いフードの下でエッチャントを使用し、保護具を着用してください。取扱い後は手を十分に洗ってください。金属エッチャントは、腐食性液体用に指定された換気されたキャビネットに保管する必要があります。</li>
	<li>カバーリップを蒸留水でリンスし、N2で乾燥させ、レンズペーパーで金属クラッディングの表面を軽くバフして、クラッディングで覆われているポストを露出させます。カバースリップを別の2時間銅エッチャントに戻し、蒸留水で再びすすいでN2で乾燥させます。 注:ZMWのスライドは、汚染物質を含まないそれらを保つために、覆われた、きれいなペトリ皿に保存する必要があります。</li>
</ol>5. コロイド結晶テンプレートを用いた金ゼロモードの導波管のナノファブリケーション
注: アルミニウム ZMWs を製造するためのプロトコルを反映したゴールド ZMW (補足図 1)を製造する方法は、このセクションで提供されています。
<ol><li>熱または電子ビーム蒸発堆積を使用して、チタン付着層の3nmを1Å/sに堆積させ、その後4Å/sで300nmのアルミニウムを堆積させます。</li>
	<li>テープで表面を軽く押して、ビーズの上に余分な金属を取り除きます。テープをゆっくりと剥がして金属を引き離します。</li>
	<li>ポリスチレンビーズを溶解するには、ビーズテンプレートをトルエンに入れ、一晩浸します。</li>
	<li>トルエンインキュベーション後、テンプレートをクロロホルムで1回、エタノールで2回リンスします。テンプレートをN2 で乾燥させ、酸素プラズマクリーナーの残留ポリマー汚染物質を30分間除去します。</li>
	<li>熱ビームまたは電子ビーム蒸発堆積を使用して、アルミニウムポストの周りおよび上に5 Å /sで金の100-150 nmを堆積させます。</li>
	<li>金属ポストを溶解するには、カバーリップをアルミニウムエッチャント(リン酸ベース)に浸します。 資料一覧)1時間。</li>
	<li>カバーリップを蒸留水でリンスし、N2で乾燥させ、レンズペーパーで金属クラッディングの表面を軽くバフして、クラッディングで覆われているポストを露出させます。カバースリップをアルミニウムエチャントに1時間戻し、蒸留水で再びすすいでN2で乾燥させます。 注:ZMWのスライドは、覆われた、きれいなペトリ皿に格納する必要があります。</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

コロイド自己集合(プロトコルセクション2)では、懸濁溶媒として水ではなくエタノールを使用すると、以前の方法48,49のように、テンプレートが1−2時間ではなく、堆積後2〜3分で準備ができるように、蒸発プロセスを高速化する。ここで提示される蒸発沈積分プロトコルは、サスペンション49、50、51以上の表面傾斜、温度、および空気量を制御する必要がある以前の堆積物プロトコルよりも簡単である。このプロトコルで使用される粒子体積分率は2.4%であり、以前の沈降法48で使用されていた0.2-0.5%よりも高く、水グリセロール混合物中のコロイドを再懸濁して、はるかに長いセトリングタイムスケールを行う。しかし、堆積物の品質は粒子体積分率の変化に強く、過去の研究では2-10%49、50、51の間で変化させることができることが分かりました。このプロトコルから正常に堆積して得られたコロイド結晶の粒径は、20-30μmで、以前の堆積方法(通常は数百ナノメートル)48,49の粒子よりも大きい。マクロ的には、コロイド単層の直径約2cmの領域も、前の方法49によって生成された1cmの領域に匹敵する。この方法で作られるコロイド結晶テンプレートの大きいサイズはまた3-5分離された流れの部屋44、各ZMWのスライドで作られるのは、それぞれ約3-4 mm幅を可能にする。これにより、複数の独立した単一分子実験を各スライドに対して行うことができる。
自己組立後にコロイドビーズテンプレート(プロトコルセクション3)をアニーリングすることは簡単ですが、ZMWsで背景蛍光を十分に低減するための重要なステップです。 補足図2 が示すように、アンネル化されていないテンプレートからの三角断面を有する導波管の有効カットオフ波長は894nmである。これに対して、アニールテンプレートから130nm径の円波導路に対する有効カットオフ波長は221nmであり、分析的に(ガイド18の直径の1.7倍)と数値的に決定される。堆積のために小さなビーズを使用すると、テンプレートの孔のサイズを小さくすることもできますが、導波ガイドは、可視光の回折限界の周りにある200 nmよりも近くに間隔を置きます。さらに、導波管は断面の三角形のままで、導波路を通して非対称の電力伝達を導く(補足図2A−D)。アニーリングステップの欠点の1つは、融解時間の変動が導波管径の変動を引き起こす可能性があるため、正確なタイミングがバッチ間の変動を最小限に抑えるのに役立ちます。インタースティスは25sよりも長いアニーリング時間で閉じ始め、ポスト直径は20-25 sの間であまり減少しません(補足図3B-D)。インタースティスクロージャーの簡単なテストは、アニールされたテンプレートが光で照らされ、斜めで見たときに虹回折パターンを生成するかどうかを確認することです。そうでなければ、インタースティックの大部分が閉じている可能性が高いです。アニーリング時間と典型的な孔径の関係は、38以前に提示されています。
アニーリングステップ中に所望の孔サイズを達成した後、銅は、マスクの影を作成するためにテンプレート上に(ステップ4.1)堆積されます。金属ができるだけ垂直にテンプレートに近づくと、視線堆積を使用することが重要です。したがって、サンプルと金属源との距離を長くすると、テンプレートを保持するプレートが回転しないように、いくつかの蒸気堆積機で自動的に行われるように、ポリスチレン基板上の金属の横面堆積を最小限に抑える際に役立ちます。しかし、いくつかの横方向の堆積は避けられず、これは間質孔のサイズを小さくし、したがって、より多くの金属が52に堆積するにつれてポスト断面を減少させる。この結果、プリズムのような構造の方がピラミッド型の金属ポストが 52になります。
銅の柱はプリズムの形ではなくピラミッド状である可能性が高いため、ポストの上にアルミニウム堆積(ステップ4.5)も傾斜した側面の一部をカバーし、一部のポストの銅エッチャントのアクセシビリティをブロックします。したがって、レンズ用紙のバフ処理ステップ(ステップ4.7または5.7)をエッチャントに最初に浸した後に添加し、アルミニウムで覆われた銅のポストを機械的に破壊した。より高いポストを作成するためにより多くの銅を堆積させることはまた、レンズ用紙のバフリング中に機械的な混乱の影響を受けやすいポストを作る。しかし、500nm以上の銅は、堆積の目標は、1μmビーズの500 nmの正中線に間質穴を投影することであるため、堆積すべきではありません。
もう 1 つの潜在的な難点は、レンズ用紙のバフリング中に意図しないアルミニウムクラッディングの除去です (ステップ 4.7 または 5.7)。また、アニール工程を加えた後に、焼鈍工程の添加によりアルミニウムクラッディングの損失がより頻繁に発生し、ポリスチレン残基の増加により、ガラスへのアルミニウム付着を妨げる可能性があることがわかった(プロトコルセクション3)。しかし、テーププル後の一晩トルエンの浸漬(ステップ4.3または5.3)は、この問題を解決しました。 図4EのAFM画像では、ポスト間にポリスチレンの残留リングが見えますが、アルミニウムクラッディングはステップ4.7で複数のバフに抵抗しました。アルミニウムクラッディングの損失が一晩トルエン浸漬後に問題のままである場合、RCA-1(標準クリーン-1)洗浄、ピラニア洗浄、またはさらなる酸素プラズマ洗浄をステップ4.4または5.4に添加することができる。これらの洗浄ステップは、ZMWsをさらに洗浄するために、最終エッチングステップ(ステップ4.7または5.7)の後、およびパッシベーション前に追加することもできます。
単一分子FRET実験におけるZMWsの性能は、EBLで製造されたZMWsの性能と同様であった。Cy3標識DNAヘリカーゼローダータンパク質を溶液に標識した単一鎖DNAに対して単一分子FRETを行う以前の研究では(図6Aと同じドナーアクセプター配列)、FRETイベントは100 nM Cy5バックグラウンドで明確に識別可能で、1μMでは識別不可能であった(低いアクセプター微量シグナル)我々は、商業ZMWsを用いた以前の研究では、バックグラウンド濃度が1mM54の高い単分子FRETアクセプターシグナルが、我々および社内で製造されたZMWsを有する他の以前の研究42,53よりも高いと報告された。ZMWs間の信号からバックグラウンドへのパフォーマンスに関するさらなる議論は、ジャミオルコフスキら38.ZMW表面53と蛍光サンプルの非特異的相互作用は、特に溶液中の拡散蛍光種が大きな高分子である場合に、より高い濃度へのアクセスを制限する一般的な課題である。翻訳などの複雑な生化学的システムに関するZMWsの研究は、通常、100-250nM 55、56、57、58に無料蛍光基質濃度を制限している。ZMWsの意図された適用に関係なく、高濃度で許容可能なノイズ信号を維持するために、異なるシステムのためのパッシベーション方法の最適化が必要になる可能性があります。
全体的に見て、ここで提示される方法は、特殊なスキルや機器を必要としない、一度に多くのテンプレートの並列製作を可能にし、異なる金属でZMWsを製造するために適応することができます。本研究では、銅とアルミニウムをそれぞれアルミニウムと金で置換し、金のZMWsを製造した(補足図3)。これはアルミニウムではなく金のパッシベーション方法を使用する実験室にとって有利である。また、金ZMWは可視スペクトルの赤色領域で吸収する蛍光体の発光を増強することが示されているが、アルミニウムZMWは緑色領域59で吸収する蛍光色素の発光を増強する。今後、この方法で作製されたZMWsからの蛍光シグナル強度は、HF16,26,60を用いてZMW金属クラッディングの下のガラスにエッチングすることで増強される可能性がある。これは、フルオロフォア61をクエンチすることができる金属壁から遠く離れて固定化された生体分子をもたらします。さらに、開口の入り口下の励起照明強度には最大があり、これは単一分子発光を26,60に増強するために以前に利用されてきた。

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/t/61154">Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy</a>. A figure was updated.
Figure 3 was updated from:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3.jpg" /> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 &#181;m). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 &#181;m). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61154/61154fig3large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2.jpg" /> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 &#181;m). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 &#181;m). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/t/61154">Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy</a>. A figure was updated.

Erratum: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

単一分子蛍光共鳴エネルギー伝達(smFRET)や単分子蛍光相関分光(FCS)などの単一分子技術は、分子生物物理学のための強力なツールであり、転写1、2、3、翻訳4、6などのプロセスにおける個々の生体分子の動的動き、立体構造、相互作用の研究を可能にする7。smFRETの場合、多くのテザード分子が経つ場合があり、TIRによって発生するエバネッセント波はカバースリップ8に隣接する100-200 nm領域に制限されるため、全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡は一般的な方法である。しかし、励起体積に関するこの制限があっても、背景蛍光9を超える単一分子シグナルを検出するためには、関心のある蛍光体をpMまたはnM範囲に希釈する必要がある。細胞酵素のミカエル-メンテン定数は、典型的にはμMからmM範囲10であるため、単一分子研究における生化学的反応は、通常、細胞内の反応よりもはるかに遅い。例えば、タンパク質合成は大腸菌11,12において1秒当たり15~20アミノ酸で起こり、smFRET実験における原核生物リボソームの大部分は、毎秒0.1~1アミノ酸で翻訳される。タンパク質合成において、失速リボソーム上の結晶構造およびsmFRETは、tRNA-mRNA転座ステップ14,15の前に「ハイブリッド」状態と「古典的」状態の間でRNA(tRNA)の転移が変動することを示した。しかし、転座GTPase因子の生理的濃度が、EF−G、存在した場合、異なる立体構造、ハイブリッド状態と古典状態との中間体が、smFRET6で観察された。細胞内と同様の速度と濃度で動的分子プロセスを研究することは重要ですが、技術的な課題は残っています。
蛍光基質濃度を高める戦略は、ゼロモード導波ガイド(ZMWs)と呼ばれる金属ベースのサブ可視波長開口を用いて、開口16内に局在する生体分子を選択的に励起する限定励起場を生成することである(図1)。開口部は通常、直径 100~200 nm、深さ17で 100~150 nm です。ウェルの大きさと形状に関連するカットオフ波長(λc≈、水を有する円形導管の直径の2.3倍の誘電媒体18)、導波路では伝播モードが認められません。しかし、振動電磁場は、エバネッセント波と呼ば、指数関数的に強度が減衰し、依然として導波管18,19に短い距離をトンネルする。TIRエバネッセント波と同様に、ZMWエバネッセント波は減衰定数が短く、導波路内で10〜30nm有効な励起領域を生じます。蛍光標識リガンドのマイクロモル濃度では、励起領域内に同時に存在する分子は1個または数個に過ぎない。この励起体積の制限とそれに伴うバックグラウンド蛍光の減少により、生物学的に関連する濃度で単一分子の蛍光イメージングが可能になります。これは、多くのシステム20に適用されているが、単一タンパク質拡散21のFCS測定、低親和性リガンドタンパク質22およびタンパク質タンパク質相互作用23の単一分子FRET測定、および単一分子ターンオーバーイベント24の分光電気化学的測定を含む。
ZMWsは、イオンビームミリング25、26または電子ビームリソグラフィ(EBL)を用いて金属層を直接パターン化し、続いてプラズマエッチング16、27を生成した。これらのマスクレスリソグラフィ法は、一連の導波ガイドを作成し、通常、ZMW技術の普及を防ぐために、特殊なナノファブリケーション施設へのアクセスを必要とします。もう一つの方法は、紫外線ナノインプリントリソグラフィーリフトオフ28、切手のようなレジストフィルムに逆ZMWテンプレートを押し込むために石英スライド型を使用する。この方法はより合理化されていますが、石英金型の製造にはEBLが必要です。本稿では、EBLやイオンビームミリングを必要とせず、リソグラフィマスクを形成するためにナノスフィアの密閉に基づく、シンプルで安価なテンプレート化された製造方法のプロトコルを紹介します。
1982年にDeckmanとDunsmuir29,30によって最初に提案されたナノスフィアまたは「天然」リソグラフィーは、数十ナノメートルから数十マイクロメートル31までの単分散コロイド粒子の自己集合体を使用して、エッチングおよび/または材料の堆積を介した表面パターニングのテンプレートを作成します。2次元(2D)または3次元(3D)コロイド粒子の拡張周期配列は、コロイド結晶と呼ばれ、散乱および回折32からの明るい虹彩を特徴とする。電子ビームやフォトリソグラフィよりも広く使用されていないが、このマスキング方法論は、シンプルで低コストで、100nm以下の特徴サイズを作成するために簡単に縮小されます。
コロイド粒子の自己集合性を導き、表面パターニング用のマスクとしてコロイド結晶を使用することの成功を決定します。粒子の大きさと形状が均質であれば、コロイド粒子は、六角形のパッキングで容易に自己組み立てすることができ、エントロピー枯渇33によって駆動される。滴下後の水蒸発はコロイド粒子を沈降させる有効な経路であるが、他の方法としては、ディップコート34、スピンコート35、電気泳動堆積36、空気水界面37での定着が挙げられる。以下に示すプロトコルは、最も簡単に実装された蒸発堆積物法に基づいています。密梱されたポリスチレンビーズ間の三角形の間間に、犠牲金属をプレートする開口部を形成し、ポストを形成する(図2 および 補足図1)。このステップの前にビーズの短いアニーリングは、これらのポストの形状と直径を調整します。ビーズが除去され、最終的な金属層がポストの周りに堆積し、ポストが削除されます。コロイドナノマスクへの2つの金属蒸着ステップ、中間ポストの除去、およびパッシベーションおよびテザリングのための表面化学修飾の後、ZMWアレイは単一分子イメージングに使用する準備ができています。製造後のZMW光学特性のより広範な特性は、添付の記事38で見つけることができます。金属の蒸着のための熱蒸発器のほかに、特別な用具は要求されない。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:667px;" width="668">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">1. Glass Coverslip Cleaning</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Acetone</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">32201</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Coplin glass staining jar</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-817</td>
			<td>Staining jar with 8 grooves and molded glass cover</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Coverslips</td>
			<td style="width:103px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48404-467</td>
			<td>24 mm x 30 mm (No.1&#189;, Rectangular)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Ethanol</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E7023</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">KOH</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">30603</td>
			<td>Potassium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R80115TS</td>
			<td>100 mm diameter, 15 mm deep</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sonicator</td>
			<td style="width:103px;">Branson</td>
			<td style="width:119px;">Z245143</td>
			<td>Tabletop ultrasonic cleaner, 5510</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Clear storage container</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-110-8222</td>
			<td>26 x 18 x 15 in.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Desk fan</td>
			<td style="width:103px;">O2Cool</td>
			<td style="width:119px;">FD05001A</td>
			<td>Any small desk (~5 in.) fan will work</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Glass beaker</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-555-25B</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Humidity meter</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11-661-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">21-402-903</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Polystyrene microspheres</td>
			<td style="width:103px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">18602-15</td>
			<td>1.00 &#181;m diameter, non-functionalized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Triton X-100 deturgent</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Aluminum plate</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AA11062RY</td>
			<td>Customized in-house to 14 cm x 14 cm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Ceramic hotplate</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">HP88857100</td>
			<td>13 x 8.2 x 3.8 in.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Temperature controller</td>
			<td style="width:103px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">38615K71</td>
			<td>Read temperature with thermocouple probe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Thermocouple probe</td>
			<td style="width:103px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">9251T93</td>
			<td>Type K, surface probe</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Aluminum etchant</td>
			<td style="width:103px;">Transene</td>
			<td style="width:119px;">Type A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Aluminum pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMAL40QXHB</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Chloroform</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">288306</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Copper etchant</td>
			<td style="width:103px;">Transene</td>
			<td style="width:119px;">49-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Copper pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMCU40QXQA</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Gold pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMAUXX40G</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Lens paper</td>
			<td style="width:103px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">MC-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:103px;">Harrick Plasma</td>
			<td style="width:119px;">PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Scotch tape</td>
			<td style="width:103px;">Staples</td>
			<td style="width:119px;">MMM119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Thin film deposition system</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">PVD-75</td>
			<td>Tabletop thermal evaporation system will also work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Titanium pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMTI45QXQA</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Toluene</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">244511</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Representative Results</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">COMSOL Multiphysics Modeling Software</td>
			<td>COMSOL, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Dual View spectral splitter</td>
			<td style="width:103px;">Photometrics, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of zero mode waveguides for high concentration single molecule microscopy

単一分子蛍光エンミノロジーでは、溶液中の標識基質からのバックグラウンド蛍光は、多くの生理学的リガンド濃度よりも数桁少ない数桁のピコからナノモルの範囲に蛍光を制限することが多い。アルミニウムや金などの薄い導電金属で作られた直径100~200nmの直径開口であるゼロモード導波管(ZMWs)と呼ばれる光学ナノ構造は、可視光励起をゼプトリットル有効体積に限定することで、蛍光色素のマイクロモル濃度で個々の分子をイメージングすることができます。しかし、高価で特殊なナノファブリケーション装置の必要性は、ZMWsの広範な使用を妨げている。典型的には、ZMWsのようなナノ構造は、逐次的かつ遅い電子ビームリソグラフィを用いて直接書くことによって得られる。ここで、コロイド、またはナノスフィアは、導波路製作のためのナノメートルスケールマスクを作成する代替戦略として用いられる。このレポートでは、各フェーズの実際的な考慮事項と共に、アプローチについて詳しく説明します。この方法により、数千のアルミニウムまたはゴールドのZMWを並列に作成でき、最終的な導波管の直径と深さは100〜200nmです。金属蒸着用の一般的なラボ機器と熱蒸発器のみが必要です。生化学的コミュニティにZMWsをよりアクセスしやすくすることで、この方法は細胞の濃度と速度での分子プロセスの研究を容易にすることができます。

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Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

ここでは、フルオロフォアのナノからミクロモル濃度で単分子イメージングのための金属張りのガラス顕微鏡カバースリップにおけるナノパーチャーの配列であるゼロモードの導波管の平行作製のためのナノスフィアリソグラフィー法を説明する。この方法は、コロイド結晶自己集合を利用して導波管テンプレートを作成します。

高濃度単一分子顕微鏡のためのゼロモード導波ガイドの作製

In single molecule fluorescence enzymology, background fluorescence from labeled substrates in solution often limits fluorophore concentration to pico- to ...

fabrication-zero-mode-waveguides-for-high-concentration-single

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.9K ビュー.  University of Pennsylvania. ここでは、フルオロフォアのナノからミクロモル濃度で単分子イメージングのための金属張りのガラス顕微鏡カバースリップにおけるナノパーチャーの配列であるゼロモードの導波管の平行作製のためのナノスフィアリソグラフィー法を説明する。この方法は、コロイド結晶自己集合を利用して導波管テンプレートを作成します。

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Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics and ultrastructure. First, cells can be imaged in a near native environment for both techniques. Second, due to the vitrification process, samples are
 preserved by rapid physical immobilization rather than slow chemical fixation. Third, imaging the same sample with both cryo-LM and cryo-EM provides correlation of
 data from a single cell, rather than a comparison of "representative samples". While these benefits are well known from prior studies, the widespread use of correlative 
 cryo-LM and cryo-EM remains limited due to the expense and complexity of buying or building a suitable cryogenic light microscopy stage. Here we demonstrate the 
 assembly, and use of an inexpensive cryogenic stage that can be fabricated in any lab for less than $40 with parts found at local hardware and grocery stores. This 
 cryo-LM stage is designed for use with reflected light microscopes that are fitted with long working distance air objectives. For correlative cryo-LM and cryo-EM 
 studies, we adapt the use of carbon coated standard 3-mm cryo-EM grids as specimen supports. After adsorbing the sample to the grid, previously established protocols 
 for vitrifying the sample and transferring/handling the grid are followed to permit multi-technique imaging. As a result, this setup allows any laboratory with a 
 reflected light microscope to have access to direct correlative imaging of frozen hydrated samples.

We demonstrate the fabrication of a low-cost cryogenic stage designed to fit most reflected light microscopes. This lab-built cryogenic stage enables efficient and reliable correlative imaging between cryo-light and cryo-electron microscopy.

相関ライト/電子顕微鏡のための低コストクライオ光学顕微鏡のステージの作製

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

生物工学

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

磁気ピンセットを用いた多重化単分子フォースタンパク質分解測定

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Fabrication of Carbon Nanotube High-Frequency Nanoelectronic Biosensor for Sensing in High Ionic Strength Solutions

The unique electronic properties and high surface-to-volume ratios of single-walled carbon nanotubes (SWNT) and semiconductor nanowires (NW) 1-4 make them good candidates for high sensitivity biosensors. When a charged molecule binds to such a sensor surface, it alters the carrier density5 in the sensor, resulting in changes in its DC conductance. However, in an ionic solution a charged surface also attracts counter-ions from the solution, forming an electrical double layer (EDL). This EDL effectively screens off the charge, and in physiologically relevant conditions ~100 millimolar (mM), the characteristic charge screening length (Debye length) is less than a nanometer (nm). Thus, in high ionic strength solutions, charge based (DC) detection is fundamentally impeded6-8.
We overcome charge screening effects by detecting molecular dipoles rather than charges at high frequency, by operating carbon nanotube field effect transistors as high frequency mixers9-11. At high frequencies, the AC drive force can no longer overcome the solution drag and the ions in solution do not have sufficient time to form the EDL. Further, frequency mixing technique allows us to operate at frequencies high enough to overcome ionic screening, and yet detect the sensing signals at lower frequencies11-12. Also, the high transconductance of SWNT transistors provides an internal gain for the sensing signal, which obviates the need for external signal amplifier.
Here, we describe the protocol to (a) fabricate SWNT transistors, (b) functionalize biomolecules to the nanotube13, (c) design and stamp a poly-dimethylsiloxane (PDMS) micro-fluidic chamber14 onto the device, and (d) carry out high frequency sensing in different ionic strength solutions11.

We describe the device fabrication and measurement protocol for carbon nanotube based high frequency biosensors. The high frequency sensing technique mitigates the fundamental ionic (Debye) screening effect and allows nanotube biosensor to be operated in high ionic strength solutions where conventional electronic biosensors fail. Our technology provides a unique platform for point-of-care (POC) electronic biosensors operating in physiologically relevant conditions.

高イオン強度ソリューションで感知するためのカーボンナノチューブ高周波ナノエレクトロニクスバイオセンサーの作製

The unique electronic properties and high surface-to-volume ratios of single-walled carbon nanotubes (SWNT) and semiconductor nanowires (NW) 1-4 make them ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

単一分子蛍光顕微鏡による受容体ダイナミクスの高分解能時空間解析

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

シングルセルおよび3D閉じ込めにおける単一胚を注文：ハイコンテントスクリーニングのための新しいデバイスを

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

マイカの製造は、高分解能光学顕微鏡イメージングのための脂質二重層をサポート

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

平面支持された二分子層​​上の単一分子蛍光顕微鏡

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

マイクロトロイドの光共振器を用いたラベルフリー単一分子検出

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...