このプロトコルは、さまざまな小分子のバイオセンサーとしてタンパク質二量体化システムをエンジニアリングするための一般的なアプローチを提供するため、重要です。さらに、高度に多様なタンパク質ライブラリーを使用して、特殊な装置を必要とせずに効率的かつ費用対効果の高い方法で、異なるリガンド用のバイオセンサーを選択します。設計されたバイオセンサーは、細胞の挙動を化学的に制御し、細胞代謝産物のリアルタイム変化を監視するために使用することができる。
この視覚的なデモンストレーションを通して、研究者は実験出力の明確な期待を持って技術の詳細な指示を観察することができます。摂氏37度で6ミリリットルの2YT培地で単一のTG1エレクトロポレーションコンピテントセルコロニーを成長させ、1分あたり250回転を約0.5の600ナノメートルの吸光度に成長させることで、すべての選択を開始します。最適な光学密度に達したら、細胞を氷の上に置きます。
ネガティブセレクションビーズを調製するには、ストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズ300マイクロリットルを05%PBSプラストゥイーンバッファの1ミリリットルで3回、磁気分離ラックで1回のPBSを1ミリリットルで2回洗浄します。PBSで1%カゼインの1ミリリットルでビーズを再懸濁し、ビーズの報告された結合能力の5倍でビオチンでビーズを飽和させる。室温で1時間後に回転し、PBSプラストゥイーンでビーズを5回、PBSで3回洗浄します。
最後の洗浄後、PBSの13ファージ粒子に約10回10回、PBSの1%の牛血清アルブミンをビーズに加え、室温で1時間の回転を伴うインキュベーションを行います。インキュベーションの終わりに、上清を1.5ミリリットルのチューブに移します。ビオチン化リガン酸結合ストレプトアビジンビーズで正の選択を行う場合、選択したビオチン化リガンドの負の選択に使用されるビーズの量の半分を、マニュアルに従って計算された完全結合容量の5倍で飽和させる。
回転で室温で1時間のインキュベーションを行った後、PBSプラスTweenでビーズを5回、PBSだけで3回洗浄し、1%カゼインと1%ウシ血清アルブミンの1ミリリットルでビーズを1時間回転してブロックします。インキュベーションの最後に、ストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズをPBSプラストゥイーンで3回洗浄し、PBSだけで1回洗浄し、アンバウンドファージを使用してストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズを再懸濁させます。ビーズを乱すことなく非結合ファージ含有上清を抽出し、入力として使用されるようにサンプルを脇に置きます。
次に、PBSとTweenでビーズを10回洗浄し、PBSで5回洗浄し、3回の洗浄ごとにビーズを新しいチューブに移し、結合したファージをチューブ壁に非特異的に結合することを避けます。結合したファージを競争力のある溶出させるために、非ビオチン化リガンドのマイクロモル濃度の450マイクロリットルを正の選択ビーズに加え、ビーズを30分間回転させます。インキュベーションの終わりに、上清を新しいチューブに移して出力として使用します。
入力滴定の場合、入力ファージで10倍から9倍までPBSに10個のシリアル希釈液を用意します。10マイクロリットルの入力ファージを1回10~7~10から9個の希釈液から、調製したTG1細胞の70マイクロリットルのアリコートに移す。摂氏37度で45分後、感染したTG1細胞を、アンピシリン1ミリリットル当たり100マイクログラム、摂氏37度で一晩のインキュベートのために2%グルコースを含む個々の90ミリメートル2YT寒天皿にプレートします。
翌朝、ファージ入力を計算するために式を使用します。出力感染と滴定のために、溶出したファージを3ミリリットルのTG1細胞に加え、摂氏37度の水浴で45分間インキュベーションします。次に、感染した細胞の10個の連続希釈液を新鮮な2YT培地で3濃度まで10倍まで調製し、摂氏37度で一晩のインキュベーションのために90ミリメートル2YT寒天皿に各希釈物をプレートします。
翌朝、式に従ってファージ出力を計算する。濃縮されたサブライブラリから個々のクローンを分離するには、一晩培養されたファージに感染したTG1細胞プレートから、37°Cの一晩培養のために無菌深井戸プレートでアンピシリンを250マイクロリットルの2YT培地に移します。細胞が約0.5の600ナノメートル密度に達したら、各ウェルにCM13ヘルパーファージのミリリットル当たり9回のプラーク形成単位に5倍10を加え、毎分250回転で摂氏37度で45分間細胞をインキュベートします。
インキュベーションの最後に、アンピシリンを添加した2YT培地500マイクロリットルを各ウェルに加え、1ミリリットルのカナマイシンを各ウェルに加え、プレートを摂氏25度、毎分250回転に置きます。翌朝、遠心分離により細胞を沈下し、ファージ粒子の採取を可能にする。ELISAによるアンカー結合を検証するには、96ウェルELISAプレートをコーティングバッファーに1ミリリットル当たり5マイクログラムの100マイクロリットルを一晩で4°Cでコーティングします。
翌朝、PBSとトゥイーンの300マイクロリットルでプレートを3回洗浄してから、1マイクロモルビニチン化ターゲットの100マイクロリットルを標的井戸に、1マイクロモルビオチンまたはターゲットホモログの100マイクロリットルを適切な制御ウェルに追加します。室温で1時間後、PBSとTweenで5回洗浄し、室温で1時間、1ウェルあたり300マイクロリットルの1%カゼインで非特異的結合をブロックします。インキュベーションの終わりに、新鮮なPBSと洗い込みごとにトゥイーンでプレートを3回洗い、精製したファージ上清を加えます。
室温で1時間後、新鮮なPBSと1回の洗浄でプレートを10回洗います。100マイクロリットルの西洋ワサビペルオキシダーゼM13主要コートタンパク質抗体を各ウェルに加え、室温で1時間のインキュベーションを行います。次に、実例のようにプレートを3回洗浄し、室温で10分間のインキュベーションを行うか、目に見える色の変化が観察されるまで、各ウェルにTMB基板100マイクロリットルを加えます。
その後、ウェルあたり1モル塩酸100マイクロリットルで反応を停止し、分光光度計で450ナノメートルのプレートを読み取ります。アンカーバインダーの検証後、二量体結合体スクリーニングは、アンカーバインダーリガンド複合体を標的とする同じタンパク質ライブラリーを用いて行う必要があります。選択の4〜6ラウンド後の典型的な濃縮結果は、サブライブラリ内の潜在的ヒット率が高いことを示す良い指標であり、その場合、さらに選択のラウンドが必要ない場合があります。
シングルクローンELISAは、アンカーおよび二量体結合剤の相対的結合親和性および選択性を分析するのに適しており、クローン間の結合選択性の比較を容易にする。同様に、二量体結合剤選択は、リガンドの有無にかかわらず固定化されたアンカーバインダーを使用してヘテロダイマーを形成するクローンの同定を可能にする。これらのリガンド濃度依存的結合データは、試験されたナノボディが、対照試料によって示された不十分な結合と比較して化学的に誘導された二量体化システムを構築するのに適していることを示唆している。
また、分析的サイズ排除クロマトグラフィーは、リガンドの存在下でアンカーと二量体結合剤との間のヘテロ二量体形成を確認するために使用することができる。例えば、この実験では、アンカーと二量体化バインダーとカンナビジオールを混合した場合に二量体化ピークが観察された。対照的に、カンナビジオールの不在時または各バインダーがカラムだけにロードされたとき、二量体化ピークは検出されなかった。
タンパク質二量体化システムは、インビボアプリケーションを開発するための選択されたバイオセンサーのさらなる検証を可能にするために、酵母または哺乳類細胞で遺伝的にコードされるべきである。この方法は、他の研究者に、重要な代謝産物、シグナル伝達分子、または高い時空間分解能を持つ生体内の薬物を検出するための効果的かつ必要なツールを提供することを期待する。
